Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
LAPORAN RESMI
ISOLASI MIKROORGANISME DARI SUATU CAMPURAN, UJI
BIOKIMIA, DAN UJI HIDROLISA
I. Tujuan
I.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari isolasi mikroorganisme dari suatu
campuran dengan teknik cawan gores dan cawan tuang.
I.2 Uji Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test))
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari dihasilkan atau tidaknya asam organik
oleh suatu mikroorganisme.
I.3 Uji Hidrolisa (Hidrolisa Gelatin)
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan jenis mikroorganisme yang memiliki
enzim gelatinase, yakni eksoenzim yang mempunyai kemampuan menguraikan gelatin menjadi
asam amino.
II. Pengamatan
II.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran
II.1.1 Metode Cawan Gores
Tabel II.1 Hasil Pengamatan Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran dengan Metode Cawan
Gores pada Media NBA Setelah 24 Jam
Bentuk koloni
dilihat dari:

Sektor 0

Hasil Pengamatan
Sektor I
Sektor II

Sektor III

Atas
keseluruhan

Atas tepi

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)

Permukaan
(samping)

Keterangan:
-

Warna

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Diameter

4,5 cm

1,9 cm

0,6 cm

0,5 cm

Kepekatan

Sedikit pekat

Sedikit pekat

Sedikit pekat

Sedikit pekat

Tabel II.2 Hasil Pengamatan Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran dengan Metode Cawan
Gores pada Media NBA Setelah 48 Jam
Bentuk koloni
dilihat dari:
Atas keseluruhan

Sektor 0

Hasil Pengamatan
Sektor I
Sektor II

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Sektor III

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)

Atas tepi

Keterangan:
-

Warna

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Diameter

4,5 cm

2,1 cm

0,9 cm

0,8 cm

Kepekatan

Pekat putih

Pekat putih

Pekat putih

Pekat putih

II.1.2 Metode Cawan Tuang

Tabel II.3 Hasil Pengamatan Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran dengan Metode Cawan
Tuang pada Media PDA Setelah 24 Jam
Bentuk koloni dilihat
dari:

Petridish 1

Hasil Pengamatan
Petridish 2

Petridish 3

Atas keseluruhan

Keterangan:
-

Warna

Diameter

Putih agak bening

Putih agak bening

Putih agak bening

4,1 cm

2,6 cm

2,2 cm

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
-

Kepekatan

Tidak pekat

Tidak pekat

Tidak pekat

Tabel II.4 Hasil Pengamatan Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran dengan Metode Cawan
Tuang pada Media PDA Setelah 48 Jam
Bentuk koloni
dilihat dari:

Petridish 1

Hasil Pengamatan
Petridish 2

Petridish 3

Putih susu

Putih

Putih

Atas keseluruhan

Atas tepi

Keterangan:
-

Warna

Diameter

8,9 cm

5,6 cm

4,2 cm

Kepekatan

Agak pekat

Agak pekat

Agak pekat

II.2 Uji Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test))

Tabel II.5 Hasil Pengamatan Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test) Setelah 24 Jam
Nama Mikroorganisme

Uji Methyl-Red

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Uji Voges-Proskauer

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
Rhyzopus oligosporus

Keterangan
Positif (+)

Negatif (-)

Tabel II.6 Hasil Pengamatan Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test) Setelah 48 Jam
Nama Mikroorganisme
Rhyzopus oligosporus

Uji Methyl-Red

Uji Voges-Proskauer

Positif (+)

Negatif (-)

Keterangan

II.3 Uji Hidrolisa (Hidrolisa Gelatin)

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
Tabel II.8 Hasil Pengamatan Uji Gelatin pada Media Gelatin Cair Setelah 48 Jam
Jenis Uji

Hasil Pengamatan

Keterangan

Blanko (+)

Uji Hidrolisa Gelatin

Negatif (-)

III.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran

Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari isolasi mikroorganisme dari suatu campuran
dengan teknik cawan gores dan cawan tuang. Dalam percobaan yang telah dilakukan, terdapat 2
jenis biakan campuran yang digunakan, untuk metode cawan gores digunakan campuran bakteri
Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis dan untuk metode cawan tuang digunakan campuran
jamur Aspergillus niger, Thiobacillus harzianum dan Rizhopus oligosporus.
Dalam melakukan isolasi, media yang digunakan adalah Potato Dextrose Agar (PDA) dan
Nutrient Broth Agar (NBA). PDA terdiri dari sari kentang yang sangat mendukung pertumbuhan
mikroorganisme jenis jamur. Bentuk dari PDA yang digunakan sebagai agar awal mulanya adalah

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
padatan yang kemudian dicairkan, namun ketika dituangkan ke petridish maka dalam beberapa
menit media PDA akan memadat.
(http://www.neogen.com/)
PDA memiliki komposisi dalam pembuatannya, menurut literatur PDA mengandung(dalam
takaran massa) 200 g infusi kentang, 20 g dextrosa, 20 g agar, dan 1 lt air distilasi. Medium tidak
boleh di lelehkan lebih dari satu kali. Dan diketahui bahwa PDA memiliki pH pada kisaran 5,6
0,2.
(http://www.fda.gov/)
NBA merupakan media yang sangat cocok untuk budidaya bakteri, karena bakteri yang
memerlukan nutrient yang terdapat dalam NBA. Oleh sebab itu, media ini banyak digunakan dalam
pemeliharaan kultur bakteri selain itu, media NBA berguna sebagai media pembelajaran. Komposisi
dari NBA terdiri dari bubuk campuran pepton yang telah di dehidrasi, ekstrak daging sapi, dan
natrium klorida.
(http://www.mastgrp.com/)
Penggunaan media agar sebagai media tumbuh mikroorganisme dalam percobaan ini
dikarenakan oleh beberapa hal, yaitu karena agar tidak dapat diuraikan oleh hampir semua jenis
mikroorganisme, agar tetap berbentuk padat pada kisaran suhu inkubasi yang luas (0-80 oC), dan
agar mencair pada titik didih air, tetapi tidak segera memadat pada suhu pendingan 42oC. Hal ini
memungkinkan pembuatan suspensi biakan pada suhu 45oC untuk tujuan pengenceran biakan dan
isolasi mikroorganisme.
(Hendrianie, 2001, hal 5-8)
Proses yang harus dilakukan sebelum memasukkan media agar pada tabung reaksi dan
petridish, merupakan proses sterilisasi. Proses sterilisasi ini di lakukan dalam alat sterilisasi, yakni
autoclave. Tabung reaksi dan petridish dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan sebelum memasuki
autoclave, hal ini dilakukan untuk mengurangi terdapatnya kontaminan dalam media kultur
mikroorganisme. Sebelum memasuki autoclave, petridish dibungkus dengan kertas warna coklat.
Tujuan membungkus kertas coklat adalah mengurangi potensi kontaminasi saat melakukan
sterilisasi. Bagian kertas yang yang bertekstur licin diletakkan pada sisi luar, karena bagian yang
licin ini mengandung lapisan lilin yang dapat menghalangi uap air dari autoclave untuk masuk ke
dalam petridish. Sedangkan untuk tabung reaksi, disumbat dengan menggunakan kapas. Setelah itu,
tabung reaksi dan petridish dimasukan ke dalam autoclave untuk disterilisasi. Proses sterilisasi ini
dilakukan dengan menggunakan suhu sebesar 121oC selama kurun waktu 15 menit. Yang dimaksud
dengan proses sterilisasi, merupakan suatu usaha untuk membebaskan alat-alat dan bahan-bahan
dari segala macam bentuk kehidupan, terutama mikroba, sehingga dalam sterilisasi nanti alat-alat
tidak terkontaminasi dengan pihak luar (kontaminan). Kondisi saat memasukkan petridish ke dalam

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
autoclave selama 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 15 psi atau 0,01 mPa dapat membunuh
semua organisme sehingga alat dalam keadaan bersih dan steril dan akhirnya tidak terdapat
kontaminan yang berdampak pada pengamatan.
(Tortora, 2010, halaman 188)
Percobaan isolasi mikroorganisme dari suatu campuran ini dilakukan dengan 2 metode,
yakni metoda cawan gores, dan cawan tuang. Selanjutnya adalah pembahasan tentang metode
cawan gores dan cawang tuang.

II.1.1 Metode Cawan Gores

Yang dimaksud dengan metode cawan gores, merupakan metode yang dilakukan dengan
cara mengencerkan biakan campuran hingga setiap individu spesies dapat dipisahkan, sehingga
setiap koloni yang terbentuk merupakan hasil dari pembelahan satu sel, kemudian menggoreskan
pada permukaan media agar, mulai dari sektor 0 hingga sektor 3. Hal pertama yang dilakukan untuk
melakukan isolasi mikroorganisme dengan metode cawan gores adalah membagi bagian pada
petridish menjadi empat sektor. Sektor 0 sebagai sektor yang digores pertama kali dengan sample
biakan campuran. Sektor 1 merupakan bagian/sektor goresan mikroorganisme yang berasal dari
goresan sektor 0. Sektor 2 sebagai sektor goresan mikroorganisme yang berasal dari goresan sektor
1 dan begitu juga sektor 3 sebagai sektor goresan mikroorganisme yang berasal dari sektor 2.
Pembagian kuadran sektor 0 hingga sektor 3 pada petridish dapat di gambarkan sebagai berikut:

Gambar III.1 kuadran sektor pada petridish

Petridish yang sudah dibagi menjadi 4 sektor kemudian melalui proses sterilisasi. Setelah
proses sterilisasi dilakukan, maka langkah selanjutnya adalah memasukan media NBA (Nutrient
Broth Agar) pada petridish. Media NBA digunakan untuk mengisolasi campuran bakteri Bacillus
subtilis dan Zymomonas mobilis. Selanjutnya melakukan inokulasi mikroorganisme yang dilakukan

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
di dalam incase. Incase merupakan suatu ruangan yang di design tertutup untuk melakukan
inokulasi sehingga faktor kontaminan dari lingkungan luar dapat di minimalisir, karena incase
bersifat tertutup dari lingkungan luar. Incase biasa disebut dengan anaerobic chamber, yang
merupakan ruangan tertutup yang hanya bisa digunakan dengan peng-oprasian menggunakan
tangan pada tempat operasional.
(Pelczar, 2007, halaman 111)
Di dalam incase terdapat biakan induk mikroorganisme, api spirtus, kawat ose. Penggunaan kawat
ose memiliki fungsi sebagai alat untuk memindahkan mikroorganisme dari media lama ke dalam
media baru yang lebih steril, dengan menggunakan teknik aseptik. Fungsi dari penggunaan teknik
aseptik dalam meng-inokulasi mikroorganisme ini adalah untuk mencegah adanya kontaminasi
terhadap mikroorganisme yang akan menjadi objek penelitian. Selain itu, juga untuk mencegah
kontaminasi terhadap ruang serta para praktikan yang sedang meneliti.
(htttp://www.biolabs.tmcc.edu/)
Sebelum memindahkan biakan yang akan di inokulasikan, kawat ose dipijarkan terlebih dahulu di
atas api spirtus hingga berwarna merah membara. Tujuan dari pemijaran kawat ose ini adalah
sterilisasi kawat ose yang akan digunakan. Tetapi jangan memasukkan kawat ose dalam keadaan
masih panas memijar, karena dikhawatirkan akan mengakibatkan mikroorganisme yang
diinokulasikan telah terbunuh akibat panas yang dibawa oleh kawat ose yang tengah berpijar.
Dalam proses inokulasi, hal pertama yang dilakukan pada media NBA adalah dengan
menggoreskan kawat ose yang telah berisi campuran biakan bakteri Bacillus subtilis dan
Zymomonas mobilis dari sektor 0. Kemudian meneruskan goresan dari sektor 0 dan meneruskan
inokulasi (dengan menggoreskan) hingga ke sektor 1. Begitu seterusnya, hingga goresan telah
sampai ke sektor 3. Dengan catatan, setiap akan berpindah ke lain sektor, kawat ose harus di
sterilisasi terlebih dahulu dengan menggunakan metode aseptik. Tujuan dari metode penggoresan
secara berkala dan berkesinambungan ini adalah untuk mengencerkan biakan campuran hingga
setiap individu spesies dapat dipisahkan, dan setiap koloni yang terbentuk merupakan hasil dari
pembelahan satu sel induk. Inokulasi dilakukan dengan cara menggoreskan kawat ose yang berisi
biakan, dengan menggunakan pola zig-zag agar permukaan yang di gores lebih luas. Ada beberapa
teknik penggoresan, yaitu quadrant streak, radiant streak, T streak, dan continuous streak. Teknik
penggoresan yang digunakan pada percobaan ini menyerupai teknik T streak. Isolasi sendiri pada
dasarnya dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan biakan murni dimana isolasi bakteri
menggunakan metode media cawan membentuk koloni pada media padat sehingga mudah diisolasi
dengan cara menyebarkan sel-sel tersebut pada agar cawan sehingga timbul koloni-koloni yang
terpisah. Koloni adalah sejumlah besar sel bakteri dalam medium solid, yang dapat dilihat secara

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

10

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
kasat mata. Dalam prosedur ini, sebuah asumsi bahwa koloni merupakan keturunan dari satu sel dan
me-representasikan sebuah clone dari biakan murni. Setelah inkubasi, bentuk umum dari koloni dan
bentuk bagian ujung dari koloni dapat diperoleh dengan cara melihatnya dari bagian atas. Setelah
koloni yang telah terisolasi dengan baik dapat ditemukan, maka dapat dipindahkan ke dalam media
baru untuk mendapatkan biakan murni
(Prescott, 2002, halaman 94)
Keuntungan dari metode cawan gores adalah praktis, hemat biaya dan waktu, serta hanya
membutuhkan keterampilan. Kesalahan-kesalahan yang umum dilakukan dalam metode ini, antara
lain:
1. Tidak memanfaatkan permukaan medium untuk digores sehingga pengenceran kurang optimal.
2. Penggunaan inokulum yang terlalau banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel waktu digores.
(http://repository.usu.ac.id/)
Langkah berikutnya yaitu melakukan inkubasi di dalam inkubator. Namun sebelumnya,
petridish dibungkus kembali dengan kertas warna coklat. Kemudian memasukkan semua hasil
inokulasi ke dalam inkubator. Proses inkubasi dilakukan selama 24 jam dan 48 jam pada suhu
kamar karena pada suhu 300 ini merupakan suhu optimum dalam pertumbuhan mikroorganisme. Di
dalam inkubator, petridish diletakkan dengan posisi terbalik. Hal ini bertujuan untuk mencegah
terjadinya kondensasi dari media di dalam petridish, sehingga dapat menyebabkan uap air turun ke
media dan pada akhirnya mengakibatkan terbatasnya pergerakan koloni di dalam media
mikroorganisme yang dapat merusak bakteri.
(Tortora, 2010, halaman 158)
Pengamatan pertama dilakukan 24 jam setelah proses inkubasi berlangsung. Dari hasil
percobaan yang telah dilakukan, didapatkan koloni mikroorganisme pada sektor 0, sektor 1, sektor
2, dan sektor 3. Pada sektor 0 terlihat bakteri dengan warna putih susu dan sedikit pekat dengan
diameter sekitar 4,5 cm. Untuk sektor 1, koloni bakteri yang tumbuh terlihat lebih sedikit bila
dibandingkan dengan sektor 0. Koloni yang tumbuh berwarna putih tulang dan pekat dengan
diameter sekitar 1,9 cm sedangkan pada sektor 2 ditemukan sedikit koloni bakteri bila dibandingkan
dengan sektor 0 dan 1 dengan warna putih susu, sedikit pekat dan diameter sekitar 0,6 cm.
Sedangkan untuk sektor 3 didapatkan sedikit bakteri berwarna putih susu, sedikit pekat dengan
diameter 0,5 cm. Hal ini wajar terjadi, karena yang diinokulasikan pada sektor 0 adalah berasal dari
campuran suspensi biakan yang diberikan, sedangkan pada sektor 1 merupakan inokulasi berasal
dari sektor 0, sektor 2 merupakan hasil inokukasi dari sektor 1, dan sektor 3 merupakan inokulasi
dari sektor 2.

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

11

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
Pada pengamatan kedua yaitu 48 jam menunjukkan adanya pertumbuhan koloni. Hal ini
terlihat dengan semakin bertambahnya diameter koloni di masing-masing sektor. Pada sektor 0 yang
semula diameternya 4,5 cm tetap menjadi 4,5 cm, dan pada sektor 1 yang semula 1,9 cm menjadi
2,1 cm, pada sektor 2 yang semula 0,6 cm menjadi 0,9 cm dan pada sektor 3 yang semula
diameternya 0,5 cm menjadi 0,8 cm. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyebutkan bahwa
setelah diinkubasi, sel-sel individu akan tumbuh memperbanyak diri hingga membentuk koloni.
Tetapi untuk ukuran dari bakteri sendiri tidak membesar, karena pertumbuhan dari bakteri itu
sendiri adalah pertumbuhan secara eksponensial yang membelah semakin banyak bukan bertumbuh
menjadi besar. Hal ini menunjukkan bahwa terjadi peningkatan populasi bakteri yang cukup
signifikan dalam kurun waktu 48 jam setelah pembiakan.
Pada saat dilihat dari permukaan samping bentuk koloni terlihat seperti lingkaran dan
tepinya berbentuk seperti setengah bola dan hampir di semua sektor bentuk koloninya seperti yang
disebutkan diatas. Terbentuknya massa sel yang dapat dilihat oleh mata telanjang dinamakan koloni.
Setiap koloni yang berlainan dapat mewakili macam organisme yang berbeda-beda. Setiap koloni
merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme.
(Pelczar, 2008, halaman 135-136)
Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan maka dapat diketahui bahwa bakteri yang
tumbuh pada sektor 3 merupakan sektor yang ditumbuhi kultur murni. Bila dilihat dari literatur
mengenai morfologi dan ciri-ciri lain dari mikroorganisme suspensi campuran Bacillus subtilis dan
Zymomonas mobilis, maka untuk bakteri yang terisolasi pada cawan gores di sektor 3 lebih
mengarah ke bakteri Bacillus subtilis. Dimana menyebutkan pada media agar koloni Bacillus
subtilis tumbuh dengan warna putih agak pekat sampai kekuningan suram sedangkan untuk bakteri
Escherichia coli, pada media agar tumbuh koloni dengan warna putih kekuningan cerah. Selain itu,
Bacillus subtilis memiliki ciri-ciri dapat ditumbuhkan pada media agar, berbentuk sel batang pendek
dan merupakan bakteri gram positif bersifat aerobik.
(Madigan, 2012, halaman 759)

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

12

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)

Gambar III.2 Hasil isolasi Bacillus subtilis (http://imgkid.com/)

Gambar III.3 Hasil isolasi campuran A pada percobaan

III.1.2 Metode Cawan Tuang
Metode cawan tuang merupakan teknik lain dalam tujuan yang sama seperti metode cawan
gores, yakni mendapatkan koloni murni mikroorganisme. Kelemahan metode ini adalah
membutuhkan waktu dan bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak memerlukan keterampilan
tinggi. Biakan campuran diencerkan dengan menggunakan medium agar yang telah dicairkan dan
didinginkan. Pengenceran dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh koloni tunggal.
(http://repository.usu.ac.id/)
Seperti halnya pada metode cawan gores, dalam cawan tuang ini sebelum melakukan
inokulasi, maka perlu dilakukan proses sterilisasi petridish, tabung reaksi, serta media terlebih
dahulu. Dengan tujuan untuk menghindari kontaminasi mikroorganisme yang tidak diinginkan, hal
ini dilakukan dengan cara memasukkan ke dalam autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit.
Selanjutnya memasukkan media PDA kurang lebih 1/2 ml pada tabung reaksi yang telah ditandai
dengan angka 1, 2, dan 3. Kemudian menginokulasikan biakan suspensi campuran mikroorganisme
Aspergillus niger, Thiobacillus harzianum dan Rizhopus oligosporus ke dalam tabung reaksi 1,
yang dilakukan dengan menggunakan teknik aseptik di dalam incase. Kemudian mengocok tabung
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

13

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
reaksi 1 perlahan dengan cara memuntir-nya agar campuran biakan mikroorganisme tersebar merata
dalam larutan media (homogen), lalu menginokulasikan biakan campuran dari tabung reaksi 1 ke
tabung reaksi 2. Sementara itu, sisa inokulasi pada tabung 1 dituangkan ke dalam petridish 1.
Selanjutnya, setelah tabung reaksi 2 tercampur rata dengan cara mengocok tabung reaksi 2,
kemudian menginokulasikan tabung 2 tersebut ke dalam tabung reaksi 3. Sementara itu, sisa
inokulasi pada tabung 2 dituangkan ke dalam petridish 2. Kemudian hasil inokulasi pada tabung 3
di kocok agar tercampur rata lalu dituangkan langsung ke petridish 3. Setiap menginokulasi, hal
yang perlu diperhatikan adalah memijarkan kawat ose terlebih dahulu untuk mengurangi
kontaminasi oleh mikroorganisme yang tidak diinginkan. Pengocokan tabung reaksi yaitu dengan
cara memutarnya diantara kedua telapak tangan dengan perlahan, hal ini dimaksudkan agar tidak
mengenai kapas penyumbat karena akan menyebabkan terkontaminasinya biakan mikroorganisme
sehingga dapat mengurangi populasi sesungguhnya dari mikroorganisme, dan juga agar tidak
timbul gelembung-gelembung udara pada media agar. Sebab beberapa mikroorganisme
membutuhkan oksigen bebas dalam pertumbuhannya, sedangkan yang lain dihambat oleh oksigen.
Karena alasan inilah maka kondisi media tumbuh harus disesuaikan sedemikian, sehingga
menguntungkan bagi kelompok mikroorganisme yang ingin diamati.
(Pelczar, 2007, halaman 110)
Pada pengamatan 24 jam, hampir seluruh petridish telah ditumbuhi oleh koloni bakteri.
Dalam petridish 1, bakteri tumbuh merata dalam media, dengan diameter koloni 4,1 cm berwarna
putih agak bening. Pada petridish 2, koloni bakteri ukurannya lebih kecil daripada pada petridish 1
dengan diameter berkisar 2,6 cm berwarna putih agak bening. Sedangkan pada petridish 3, terdapat
koloni bakteri dengan diameter 2,2 cm berwarna putih agak bening. Pada pengamatan dari atas tepi
terlihat bentuk koloni mikroba berbentuk bulat lingkaran sedangkan pada permukaan samping
berbentuk seperti setengah bola.
Sedangkan pada pengamatan 48 jam, kita mendapatkan koloni mikroorganisme yang
telah tumbuh menjadi lebih besar dari petridish 1, 2, dan 3, dengan diameter pada petridish 1
sebesar 8,9 cm, petridish 2 sebesar 5,6 cm, dan pada petridish 3 sebesar 4,2 cm. Pada petridish 3,
koloni tersebut telah terisolasi dengan baik dibandingkan dengan

petridish 1 dan 2, yang

mikroorganismenya belum terisolasi dengan sempurna. Hal ini dikarenakan pengaruh pengenceran,
terbukti dengan terlihatnya jarak antar koloni yang lebih jauh serta hanya terdapat sedikit koloni.
Berbeda dengan petridish yang lain yang koloninya banyak meyebar pada petridish, sehingga pada
petridish 3 ini sudah didapatkan koloni bakteri. Dari pengamatan mengenai ciri morfologinya,

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

14

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
diketahui bentuk bakteri tersebut adalah bulat lonjong, dengan sebagian ada yang berlekuk-lekuk
tidak beraturan dan berwarna putih kekuningan (putih tulang). Dengan demikian, bila dibandingkan
antara ciri morfologi bakteri yang didapat dengan literatur, maka bakteri yang terisolasi pada cawan
tuang lebih mengarah pada Thiobacillus harzianum yang merupakan bakteri gram positif.
(Sri Sumarsih, 2003, halaman 24)

Gambar III.6 Hasil isolasi metode cawan tuang setelah 48 jam

III.2 Uji Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test))
Percobaan uji biokimia (uji methyl red Voges Proskauer (MR-VP Test)) ini adalah untuk
mempelajari dihasilkan tidaknya asam organik atau asam campuran (metilen glikol) oleh suatu
mikroorganisme. Dalam percobaan ini, asam organik yang dihasilkan adalah asetil metil karbinol
(asetolin) yang diproduksi mikroorganisme. Dalam metode ini, digunakan 2 jenis indikator, yakni
indikator methyl red dan juga indikator barrits reagen(campuran KOH dan naphtol). Sementara itu,
mikroorganisme yang digunakan dalam uji MR-VP ini adalah jamur Rhizopus oligosporus. Untuk
pengamatan selama 48 jam, sebelumnya larutan media kultur yang telah diinkubasi selama 24
jam terlebih dahulu dibagi menjadi 2 bagian(2 tabung reaksi). Sehingga 1 larutan dalam tabung
reaksi dapat disimpan kembali di dalam inkubator untuk melakukan pengamatan selama selama
48 jam nantinya. Media kultur mikroorganisme yang digunakan dalam percobaan ini adalah MR-VP
Broth. Media ini juga dikenal dengan media buffered peptone-glucose broth yang digunakan dalam
reaksi uji MR-VP.
(http://catalog.hardydiagnostics.com/)
III.2.1. Methyl Red Test
Methyl red merupakan indikator yang memiliki trayek pH dengan range 6,3 (kuning) sampai
4,2 (merah). Nama kimiawi dari methyl red adalah o-Carboxybenzene-azo-dimethylaniline

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

15

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
(Svehla, 1979, halaman 54)
Pengukuran keasaman yang dideteksi oleh indikator methyl red biasanya lebih rendah dari
pada indikator lainnya (pada media kultur bakteri). Karena itu, untuk dapat terjadi perubahan
warna, mikroba yang digunakan dalam uji MR-VP ini harus menghasilkan asam kuat dalam jumlah
yang banyak. Asam yang dihasilkan berbentuk asam organik atau asam campuran (metilen glikol)
dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP Broth. Saat indikator
methyl red diberikan, jika muncul warna merah, maka hasil tes positif. Hal ini menunjukkan bahwa
mikroba menghasilkan asam organik. Pertama-tama, hal yang dilakukan adalah meng-inokulasikan
Rhizopus oligosporus ke dalam 2 tabung reaksi yang telah melalui proses sterilisasi pada autoclave
yang berisikan 1/3 volume tabung reaksi dengan media kultur MR-VP. Kemudian, diberikan
indikator methyl red setelah melalui proses inkubasi selama 24 jam dan 48 jam. Dari hasil
percobaan yang telah dilakukan, didapatkan hasil negatif untuk uji methyl red yang dilakukan
selama 24 jam, dan juga pada selang waktu 48 jam. Hal ini dapat dilihat dari gambar hasil
pengamatan . Uji akan bersifat positif bila kaldu berwarna merah setelah penambahan reagensia
methy red dan akan bersifat negatif bila kaldu MR-VP berubah warna menjadi kuning atau jingga
setelah penambahan reagensia.
(Direktorat Pembinaan SMK, 2013, halaman 89)

III.1. 2. Voges-Proskauer test

Pada percobaan ini, indikator yang digunakan adalah Barrits reagen, yaitu gabungan
senyawa naphtol dan KOH. Jumlah kuantitas dari larutan KOH dan naphtol yang digunakan pada
uji Voges-Proskauer adalah sebanyak 10 tetes untuk larutan KOH dan 15 tetes untuk larutan
naphtol. Pada uji ini, hasil positif ditunjukkan dengan munculnya warna merah (endapan). Endapan
berwarna merah dihasilkan oleh penambahan H2O2 dan terbentuknya asetoin (asetil metal karbinol)
dari proses fermentasi dextrose. Karena ada oksigen dari udara dan H2O2, asetoin direduksi menjadi
diasetil, dan alpha-naphtol menjadi katalis untuk menghasilkan warna merah. Perubahan warna
medium ini diperjelas dengan penambahan larutan alpha-naphtol. Perubahan warna medium biakan
lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena 2,3 butanadiol dioksidasikan
kembali menjadi asetoin sehinggal memperjelas hasil reaksi.
(Direktorat Pembinaan SMK, 2013, halaman 91)

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

16

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
Pertama-tama, hal yang dilakukan adalah meng-inokulasikan Rhizopus oligosporus ke
dalam 2 tabung reaksi yang telah melalui proses sterilisasi pada autoclave yang berisikan 1/3
volume tabung reaksi dengan media kultur MR-VP. Kemudian, diberikan 10 tetes KOH dan 15
naphtol (Barrits reagen) setelah melalui proses inkubasi selama 24 jam dan 48 jam. Dari hasil
percobaan uji VP pada jamur Rhizopus oligosporus adalah sebagai berikut. Pada waktu 24 jam,
sudah . Hal ini menandakan jamur Rhizopus oligosporus menghasilkan asetoin. Pada waktu 48
jam, Rhizopus oligosporus tetap menghasilkan endapan berwarna merah yang hampir serupa
dengan percobaan pada waktu 24 jam. Ini menandakan jamur Rhizopus oligosporus tetap
menghasilkan asetoin dalam kurun waktu 48 jam. Hal ini dapat dilihat pada gambar hasil
pengamatan. Hal lainnya yang dapat membuat kesalahan dalam praktikum uji Voges-Proskauer ini
dapat disebabkan oleh suhu inkubasi yang tidak sesuai dengan mikroorganisme yang di uji. Selain
itu juga urutan dalam penambahan reagent sangatlah penting, karena jika urutan penambahan
reagent tidak tepat, maka akan menyebabkan hasil positif yang lemah ataupun hasil negatif yang
tidak dapat dipastikan kebenarannya.
(http://catalog.hardydiagnostics.com/)
III.3 Uji Hidrolisa (Hidrolisa Gelatin)
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan jenis mikroorganisme yang memiliki gelatinase,
yaitu eksoenzim yang mempunyai kemampuan menguraikan gelatin menjadi asam amino. Dalam
percobaan yang telah dilakukan, mikroorganisme yang digunakan adalah bakteri Zymomonas
mobilis. Bakteri Zymomonas mobilis mengandung 2 enzim yang memiliki peran berbeda, salah satu
bertanggung jawab terhadap glukosa, dan satu lagi bertanggung jawab terhadap fruktosa dan
fosforilasi.
(http://link.springer.com/)
Media yang digunakan dalam praktikum ini adalah nutrient gelatin, yang memiliki fungsi
untuk mendeteksi adanya pencairan gelatin oleh mikroorganisme proteolytic. Komposisi takaran
(dalam satuan Gms / Litre) dari nutrient gelatin ini adalah 5 Gms/lt jaringan pencernaan peptisasi
hewan (peptone), 3 Gms/lt ekstrak daging sapi, dan 120 Gms/lt gelatin. Dari literatur, didapatkan
hasil pH akhir (ketika suhu 25C) adalah 6,80,2.
(http://himedialabs.com/)
Hal pertama yang dilakukan dalam percobaan ini adalah, memasukkan media nutrient
gelatin cair ke dalam 2 tabung reaksi (1 tabung sebagai blanko). Kemudian, memasukkan tabung

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

17

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
reaksi yang telah berisikan medai nutrient gelatin cair kedalam autoclave untuk memulai proses
sterilisasi. Setelah proses sterilisasi dalam autoclave berakhir, maka dilanjutkan dengan proses
inkubasi dalam inkubator selama kurun waktu 48 jam. Setelah selesai kemudian dilakukan
pengamatan dengan cara mendinginkannya di dalam freezer (0-4C) selama 10-15 menit.
Kemudian mencatat hasil pengamatan, dengan menandai positif apabila gelatin mencair setelah di
dinginkan, dan menandai dengan tanda negatif apabila gelatin tidak mencair setelah didinginkan.
(http://www.thermoscientific.com/)
Dari hasil praktikum yang telah dilakukan, ditemukan hasil uji hidrolisis gelatin terhadap
mikroorganisme bakteri Zymomonas mobilis menghasilkan gelatin yang tidak mencair ketika
didinginkan (selama kurun waktu 48 jam). Sehingga dapat diberi tanda negatif (-). Hal ini
dikarenakan media yang digunakan dalam percobaan ini adalah nutrient gelatin yang memiliki
komposisi (secara teoritis) peptone, ekstrak daging sapi, dan gelatin. Namun dalam percobaan,
media kultur mikroorganisme yang digunakan diberi tambahan agar, yakni NBA (Nutrient Broth
Agar). Penambahan dari medium NBA, menjadi salah satu dari penyebab hasil uji hidrolisa gelatin
tetap menjadi padatan ketika didinginkan. Selain itu, suhu dari inkubasi tidaklah merupakan suhu
optimal dalam pendeteksian dari degradasi gelatin oleh beberapa media, tetapi jika temparture
diatas 30-35C, gelatin dapat berwujud fluid dibandingkan gel. Lalu dari data tabel pada literatur
yang mengambil beberapa sample mikroorganisme, ditemukan bahwa keadaan konsentrasi nutrient
gelatin yang digunakan lebih optimal (berdasarkan fungsi waktu) pada konsentrasi 4%
dibandingkan dengan konsentrasi 12%. Dan suhu optimal (berdasarkan fungsi waktu) inkubasi pada
beberapa mikroorganisme adalah 30C dibandingkan dengan suhu 35C.
(Greenwood, 1991, halaman 2)
Dari tabel pada literatur, yakni tabel phenotypic characteristic of some new Zymomonas
strains. Dijelaskan bahwa untuk bakteri Zymomonas dengan sub spesies mobilis memiliki strains
negatif (-) untuk uji coba liquifikasi gelatin, dalam hal ini tidak dapat menguraikan gelatin karena
tidak adanya eksoenzim gelatinase.
(http://ijs.sgmjournals.org/)

IV. Jawaban Pertanyaan

1. ISOLASI MIKROORGANISME
a. Bagaimanakah keadaan media pembanding (blanko)? Apakah kegunaannya?

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

18

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
Keadaan media pembanding (blanko) dalam percobaan isolasi mikroorganisme dari suatu
campuran adalah steril dan tidak ditumbuhi bakteri. Fungsi blanko disini adalah sebagai
pembanding keadaan media sebelum dan sesudah dilakukan penanaman bakteri.
b. Setelah melakukan isolasi bakteri dengan metode cawan gores, pada daerah
manakah bakteri terisolasi? Bandingkan dengan media pembanding!
Pada isolasi bakteri dengan menggunakan metode cawan gores, daerah yang terkena isolasi
adalah sektor 1, 2, dan 3 namun mikroorganisme yang terisolasi sempurna terdapat pada
sektor 3. Jika dibandingkan dengan blanko maka sektor 3 terlihat lebih pekat dan pada
media blanko sendiri tetap steril (tidak ada bakteri yang tumbuh).
c. Apakah pada permukaan agar yang tidak saudara gores tampak koloni? Jelaskan!
(jika terdapat ataupun tidak)
Pada permukaan yang tidak digores (blanko) sedikit terdapat koloni setelah pengamatan 42
jam, hal ini menunjukkan bahwa media telah terkontaminasi yang disebabkan waktu
membuka media pada pengamatan pertama terlalu lebar sehingga media terkontaminasi
oleh bakteri di udara meskipun dilakukan didalam incase.
d. Apakah keunggulan dan kekurangan dari dua metode di atas?
Perbandingan kelebihan dan kekurangan metode cawan gores dan cawan tuang
Metode

Cawan Gores

Kelebihan
Hanya membutuhkan

Kekurangan
Membutuhkan

sedikit media untuk

ketelitian dan

membiakkan

ketepatan dalam

mikroorganisme dan

menggores, agar

menghemat waktu.

mikroorganisme
dapat terisolasi

Cawan Tuang

Cukup mudah, tidak

dengan sempurna.
Boros dalam waktu

membutuhkan keterampilan

dan penggunaan

yang terlalu tinggi untuk

media.

menginokulasikan
mikroorganisme.

2. UJI BIOKIMIA
e. Media yang digunakan pada beberapa test
Produksi Butadienol menggunakan media MRVP
Hidrolisa kanji menggunakan media kanji agar
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

19

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
Hidrolisa lemak menggunakan nutrient agar cair dan minyak nabati
Hidrolis kasein menggunakan kasein agar
f.
Pasangan reagent dan test
Voges-Proskaeuer test pada Reagen Barrit
Katalase test pada Hidrogen Peroksida
Hidrolisa kanji pada Gram Iodin
g. Enzim yang terlibat pada reaksi dan produk hasil hidrolisanya
Jenis Hidrolisa
Reaktan
Enzim
Hidrolisa Kasein
Kasein (protein susu)
Kaseinase
Hidrolisa Kanji
Polysakarida
Amilase
Hidrolisa Lemak
Lemak
Lipase
Hidrolisa Gelatin
Gelatin
gelatinase
h. Perbedaan Methyl Red test dan Voges Proskauer Test
No.
1

Variabel
Indikator

Produk
Glukosa+glukosa
Disakarida/monosakarida
Asam lemak + gliserol
Asam amino

Methyl-Red
Methyl-Red

Voges-Proskaeuer
Barrit

Reagent

(KOH

Reagent)
2

Test positif

Warna merah

Warna merah muda, merah,

orange
Tidak berwarna merah muda,

Test negatif

Warna kuning setelah 15 merah, orange setelah 30 menit

menit

i. Manfaat enzim
Untuk mengurangi hambatan energi aktivasi pada suatu reaksi sehingga proses terjadinya
reaksi lebih cepat.
V. Kesimpulan
V.1 Isolasi Mikroorganisme dari Suatu Campuran
V.1.1 Metode Cawan Gores
Hasil isolasi dengan metode cawan gores menghasilkan koloni Bacillus subtilis dari
campuran mikroorganisme Bacillus subtilis dan Zymomonas mobilis.
V.1.2 Metode Cawan Tuang
Hasil isolasi dengan metode tuang menghasilkan koloni dari Trichoderma
harzianum

dari

campuran

mikroorganisme

Rhizopus

oligosprorus,

Trichoderma

harzianum, dan Aspergillus niger.

V.2 Uji Biokimia (Uji Methyl-Red-Voges-Proskauer (MR-VP Test))
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

20

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
Dari hasil percobaan dan pengamatan dapat diperoleh kesimpulan bahwa jamur
Rhizopus oligosporus tidak dapat membentuk asetil methyl carbinol sebagai asam organik.
V.3 Uji Hidrolisa (Hidrolisa Gelatin)
Dari hasil percobaan dan pengamatan dapat disimpulkan bahwa jamur Rhizopus
oligosporus tidak memiliki enzim gelatinase, yakni suatu enzim yang memiliki
kemampuan menghidrolisis gelatin menjadi asam amino yang ditunjukkan dengan tidak
adanya perubahan menjadi fase cair setelah didinginkan pada suhu 0-5C.
Daftar Pustaka
Direktorat Pembinaan Sekolah Menengah Kejuruan. 2013. Mikrobiologi. Jakarta : Kementrian
Pendidikan dan Kebudayaan
Greenwood, J.R. dkk. 1991. Test for Detecting Degradation of Gelatin : Comparison of Five
Methods. California : American Society for Microbiology.
Hendrianie, Nunik. 2001. Diktat Kuliah Mikrobiologi Industri. Surabaya: Institut Teknologi
Sepuluh Nopember.
Madigan, Michael dkk. 2012. Biology of Microorganism. Wageningen : Pearson Education Inc.
Pelczar, Michael dan Chan . 2007. DASAR-DASAR MIKROBIOLOGI. Jakarta : Universitas
Indonesia.
Prescott, Harley. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. New York : The Mc Graw-Hill
Company.
Sumarsih, Sri. 2003. MIKROBIOLOGI DASAR. Yogyakarta : Universitas Pembangunan Nasional
Veteran Yogyakarta.
Svehla, G. 1979. TEXTBOOK OF MACRO AND SEMIMICRO QUALITATIVE INORGANIC
ANALYSIS. Belfast : Queens University.
Tortora, G. dkk. 2010. Microbiology : An Introduction, 10th edition. San Francisco : Pearson
Education Inc.
http://www.neogen.com/ Diakses pada tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 19.10 WIB.
http://www.fda.gov/ Diakses pada tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 22.01 WIB.
http://www.mastgpr.com/ Diakses pada tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 19.20 WIB.
http://www.biolabs.tmcc.edu/ Diakses pada tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 22.30 WIB.
http://www.repository.usu.ac.id/ Diakses pada tanggal 28 Maret 2015 pada pukul 23.40 WIB.

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

21

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Industri

(2015)
http://www.catalog.hardydiagnostics.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 09.03
WIB.
http://www.catalog.hardydiagnostics.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 10.26
WIB.
http://www.link.springer.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 11.18 WIB.
http://www.himedialabs.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 11.40 WIB.
http://www.thermoscientific.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 12.26 WIB
http://www.ijs.sgmjournals.org/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 22.30 WIB
http://www.imgkid.com/ Diakses pada tanggal 29 Maret 2015 pada pukul 23.04 WIB

Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

22