Isolasi Bakteriofage Litik Sebagai Agen Biosanitasi Buana, dkk

Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol.2 No.2 p.36-42, April 2014

36

ISOLASI BAKTERIOFAG LITIK SEBAGAI AGEN BIOSANITASI PADA
PROSES PELISISAN BAKTERI PEMBENTUK BIOFILM

Lytic Bacteriophage Isolation Utilized as Bio-sanitation Agent for
Combating Biofilm Forming Bacteria

Efendi Oulan Gustav Hakim Nata Buana
1
*, Agustin Krisna Wardani
1


1) Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, FTP, Universitas Brawijaya Malang
Jl. Veteran, Malang 65145
*Penulis Korespondensi, Email: Efendioulan@gmail.com

ABSTRAK

Biofilm merupakan salah satu masalah sanitasi yang umum dihadapi industri
pangan sehingga upaya untuk mengurangi pembentukannya selalu dilakukan.
Langkah yang umum digunakan adalah dengan menggunakan chemical sanitizers.
Akan tetapi, penggunaan chemical sanitizers justru dapat menyebabkan resistensi
biofilm dan mengontaminasi produk yang dihasilkan. Alternatif solusi dengan
menggunakan agen biologis seperti bakteriofag memiliki potensi yang besar dimana
penggunaannya tidak menimbulkan dampak negatif seperti pada chemical sanitizers.
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahapan utama-konfirmasi biofilm
menggunakan metode TCP dan TM, serta isolasi bakteriofag menggunakan metode
double layer. Analisis data dilakukan secara deskriptif kuantitatif. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa bakteri target yang digunakan mampu membentuk biofilm,
sedangkan dari proses isolasi didapatkan tiga isolat bakteriofagBS6, BS8, dan
UA7.

Kata kunci: Bakteriofag, Biofilm, Bio-sanitasi

ABSTRACT

Biofilm as one of the hygiene problem of food industry has led to many
exploration of its elimination method. Mostly, chemical sanitizers are preferred by food
industry for its elimination. However, the use of chemical sanitizeris not safe enough in
which the sanitizers may increase the resistance of biofilm and contaminate the food
product. Exploration of biological entities such as bacteriophage has been considered
as a promising way as it does not give such risks.
This research was divided into twomain partsbiofilm confirmation using TCP
and TM method, followed by bacteriophage isolation using double layer method.
Results showed that the target bacteria could form biofilm using the two method, while
isolation process resulted in three bacteriophages namelyBS6, BS8, and UA7.

Keywords: Bacteriophage, Biofilm, Bio-sanitation

PENDAHULUAN

Biofilm merupakan suatu bentuk adaptasi bakteri yang menempel pada suatu
permukaan, berkoloni, dan menyelubungi dirinya sendiri dalam suatu matriks.
Mayoritas bakteri (menguntungkan ataupun tidak) seringkali dijumpai dalam bentuk
biofilmnya. Perkembangan dan pembentukan biofilm telah menimbulkan beberapa
dampak negatif terhadap berbagai bidang dikarenakan sifat alami dari biofilm yang
lebih resisten terhadap antimikroba sehingga sulit untuk dihilangkan [1]. Perindustrian
(baik pangan ataupun non pangan) merupakan salah satu bidang yang sampai saat ini
Isolasi Bakteriofage Litik Sebagai Agen Biosanitasi Buana, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol.2 No.2 p.36-42, April 2014
37

terus memberikan perhatian pada pembentukan biofilm sebagai salah satu masalah
sanitasi. Sekali biofilm terbentuk pada sebuah lini produksi, maka biofilm tersebut akan
menjadi sumber kontaminasi bagi bahan pangan yang melewati lini produksi yang
sama [2].Selain itu, biofilm memiliki ketahanan terhadap antimikroba 100 1000 kali
lebih kuatdibandingkan dengan bakteri planktonik [3] sehingga usaha eliminasinya
menjadi lebih sulit.
Solusi yang telah diterapkan industri untuk mengontrol pembentukan biofilm
adalah dengan menggunakan bahan kimia (sanitizer) seperti senyawa pengoksidasi
(klorin, H
2
O
2
), surfaktan, dsb. Akan tetapi, penggunaan bahan-bahan kimia tersebut
memiliki keterbatasan. Penggunaan sanitizer atau disinfektan tidak efektif untuk
mengontrol biofilm dan dapat menimbulkan resistensi biofilm [1]. Selain itu,
penggunaan bahan-bahan kimia tersebut di industri pangan dapat menimbulkan resiko
kontaminasi silang dan menyebabkan keracunan. Keterbatasan tersebut menjadikan
perlunya mencari alternatif solusi lain yang lebih aman untuk mengontrol biofilm.
Salahsatu alternatif solusi potensial yang bisa digali adalah penggunaan virus bakteri/
bakteriofag yang mampu melisiskan bakteri pembentuk biofilm.
Bakteriofag merupakan virus yang menginfeksi bakteri dan mampu membunuh
sel bakteri tersebut secara langsung atau mengintegrasikan DNA virus ke dalam
kromosom bakteri inang [4]. Kemampuan membunuh tersebut berpotensi untuk terus
digali dan dimanfaatkan untuk mengontrol bakteri pembentuk biofilm. Dengan
memanfaatkan kemampuan bakteriofag, maka penggunaan sanitizer dapat dikurangi
ataupun diintegrasikan dengan bakteriofag sebagai upaya pengontrolan biofilm yang
lebih aman. Penelitian bakteriofag masih tergolong baru di Indonesia, dimana isolasi
dan aplikasinya untuk biokontrol patogen telah dan hanya dilakukan oleh peneliti dari
Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, FTP UB Malang [5]. Selain itu, penelitian
bakteriofag untuk mengontrol biofilm yang telah dilakukan masih berada pada skala
laboratorium dan belum dikenal luas sehingga penelitian ini masih harus dilakukan
dalam skala yang sama untuk memperkenalkan lebih baik bakteriofag itu sendiri
sebelum akhirnya diterapkan pada industri dan masuk ke dalam tahap aplikasi.

BAHAN DAN METODE

Bahan
Bahan kimia dalam penelitian ini antara lain, akuades, alkohol 70%, kristal
violet, iodin, etanol 95%, safranin, detergen komersial (soklin white), NaCl, CaCl
2

monohidrat, phosphate buffer saline (PBS) yang diperoleh dari toko kimia Makmur
Sejati Malang. Media pertumbuhan bakteri yang digunakan antara lain, nutrient agar
(NA) (Pronadisa), nutrient broth (NB) (Pronadisa), MRS agar (MRSA) (Oxoid), MRS
broth (MRSB) (Oxoid), trypticase soy broth (TSB) (Merck), Luria Bertani broth (LBB)
(Difco), dan agar (Pronadisa) yang diperolehdari Laboratorium Mikrobiologi Pangan
Jurusan Teknologi Hasil Pertanian FTP UB.
Biakan bakteri untuk penelitian ini antara lain Pseudomonas fluorescens
(belum ber-strain) yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi
FMIPA UB dan Escherichia coli ATCC 25922 yang diperoleh dari Laboratorium
Mikrobiologi Pangan Jurusan Teknologi Hasil Pertanian FTP UB. Sampel yang
digunakan untuk isolasi bakteriofag antara lain air laut (pantai Ngliyep, Kecamatan
Donomulyo, Kabupaten Malang dan toko Mutiara Malang), air sawi asin (diperoleh dari
Hypermart Malang Town Square), usus ayam dan babat sapi (diperoleh dari pasar
Bunulrejo, Kecamatan Klojen, Kodya Malang).

Alat
Kompor listrik (Maspion S-300), autoklaf (HL-36 AE Hirayama), kulkas (Toshiba),
LAF (lokal dan Magnehelic), inkubator (Binder dan Barnstead), oven (Binder),
sentrifuse dingin (Hettich Sentrifugen/ Micro 22 R dan Thermo Scientific), timbangan
digital (Mettler Toledo), spektrofotometer (Jenway 6305), colony counter (WTW BZG
Isolasi Bakteriofage Litik Sebagai Agen Biosanitasi Buana, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol.2 No.2 p.36-42, April 2014
38

30), shaker waterbath (Memmert), stomacher (Seward), vortex (LW Scientific dan GSA
MX-S), orbital shaker (Cole Parmer), mikroskop (Micros Austria), mikropipet (Socorex,
Finpipette Digital, Nichiryo, dan Eppendorf), kamera mikroskop (Cannon G10), pipet
aid (Drummond), filter steril 0.22m (Sartorius), syringe steril (Unzen Syringe).
Perangkat gelas dan non gelasgelas beaker, tabung reaksi, labu erlenmeyer, labu
ukur, pipet ukur, cawan petri diameter 20cm, cawan petri diameter 6cm, kuvet, blue
tip, yellow tip, microtube, tube sentrifuse 15mL, stainless steel slide, slide glass, cover
glass, ose, bunsen, korek api, rak tabung reaksi.

Desain Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dengan menggunakan metode deskriptif kuantitatif.
Pelaksanaan penelitian dilaksanakan dalam empat tahapan.

Tahapan Penelitian
1. Konfirmasi bakteri pembentuk biofilm
2. Preparasi sampel dan isolasi inang
3. Isolasi bakteriofag
4. Uji kekeruhan bakteriofag/ turbidity test

Metode Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dengan menggunakan beberapa metode. Pada
tahapan konfirmasi pembentukan biofilm, metode yang digunakan adalah Tissue
Culture Plate (TCP) dan Tube Method (TM) [6,7]. Proses isolasi bakteri inang
menggunakan serial dilution dan spread plate [5], sedangkan proses isolasi
bakteriofag menggunakan metode double layer [5], serta uji kekeruhan atau turbidity
test [5].

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Konfirmasi Bakteri Pembentuk Biofilm
Konfirmasi pembentukan biofilm diawali dengan pembuatan kurva
pertumbuhan masing-masing isolat bakteri target. Hal ini dibutuhkan untuk mengetahui
jumlah sel yang terbentuk dan besarnya OD (Optical Density) pada jam-jam tertentu.

Gambar1. Kurva Pertumbuhan (A) P. fluorescens dan (B) E. coli

A
B
Isolasi Bakteriofage Litik Sebagai Agen Biosanitasi Buana, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol.2 No.2 p.36-42, April 2014
39

Waktu pertumbuhan isolat yang menghasilkan OD>0.240 digunakan sebagai
acuan untuk memperbanyak sel agar biofilm dapat terbentuk dengan baik [7].
Konfirmasi pembentukan biofilm dilanjutkan dengan penumbuhan biofilm oleh kedua
isolat bakteri target menggunakan metode TCP dan TM.Hasil dari TCP dan TM untuk
masing-masing isolat bakteri target disajikan pada Gambar 2 dan Gambar 3.



Gambar 2.Pembentukan Biofilm oleh (A) P. fluorescensdan (B) E. coli dengan Metode
TCP
Keterangan:
A pembentukan biofilm pada stainless steel slide
B pembentukan biofilm pada tabung reaksi dan diwarnai dengan kristal violet
biofilm yang terbentuk



Gambar 3.Pembentukan Biofilm oleh (A) P. fluorescensdan (B) E. colidengan Metode
TM

Konfirmasi biofilm menggunakan TCP dan TM telah membuktikan bahwa P.
fluorescens dan E. coli yang digunakan dalam penelitian ini (sebagai bakteri target)
mampu untuk membentuk biofim.

2. Isolasi Bakteri Inang dan Bakteriofag
Hasil isolasi bakteri inang dan bakteriofag disajikan pada Tabel 1. Sampel
dengan bakteri inang yang teramati memiliki plaque dapat dipastikan positif memiliki
bakteriofag. Semakin banyak jumlah plaque yang teramati, maka semakin tinggi pula
konsentrasi bakteriofag di dalam sampel.Isolat inang yang positif membentuk plaque
antara lain air laut (2 isolat), air sawi asin (1 isolat), babat sapi (4 isolat), dan usus
ayam (1 isolat). Sampel usus ayam tidak terdokumentasikan sebagai akibat plaque
yang terbentuk kurang jelas, sedangkan sampel tanah dan susu segar tidak
menunjukkan adanya plaque.





A B
A B
Isolasi Bakteriofage Litik Sebagai Agen Biosanitasi Buana, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol.2 No.2 p.36-42, April 2014
40

Tabel 1. Hasil Isolasi Bakteri Inang dan Bakteriofag dari Beberapa Sampel
Sampel
Jumlah
Isolat
Bakteri
Inang
Nama
Bakteri
Inang
Pembentukan
Plaque
Jumlah
Bakteri
Inang
dengan
Plaque
Nama
Bakteri
Inang
dengan
Plaque
Air Laut 9 AL + 2 AL7 ; AL8

Tanah
Perumahan
8 TP - - -

Air Sawi
Asin
10 SA + 1 SA5

Susu Segar 6 SS - - -

Babat Sapi 10 BS + 5
BS4 ; BS6
; BS7
BS8 ; BS9

Usus Ayam 10 UA + 1 UA7
*Keterangan:
(+) (terbentuk plaque)
()(tidak terbentuk plaque)

Plaque dapat terbentuk pada sampel diakibatkan keberadaan bakteriofag yang
tinggi. Air laut setidaknya mengandung 50 juta bakteriofag setiap mililiternya [8],
sedangkan pada air sawi asin, dimungkinkan adanya peran bakteriofag dalam suksesi
BAL selama fermentasi [9]. Plaque terbentuk akibat difusi keluar oleh virion yang
berkembang akibat infeksi bakteri [10]. Akan tetapi, perlu dilakukan konfirmasi lanjutan
untuk mengetahui aktivitas litik dari bakteriofag yang ada pada sampel dengan plaque.
Konfirmasi bakteriofag dilanjutkan dengan uji kekeruhan untuk masing-masing isolat
bakteri inang yang positif terbentuk plaque. Dari uji kekeruhan diketahui hanya 3 isolat
bakteri inang yang menunjukkan perbedaan signifikan antara inang terinfeksi dan tidak
terinfeksi, yaitu BS6, BS8, dan UA7.


Gambar 4. Hasil Turbidity Test Isolat Inang Usus Ayam dan Babat Sapi

Keterangan:
1 Kontrol : tanpa penambahan bakteriofag
2 Infeksi : dengan penambahan bakteriofag



B C
A
1 2
1 2 1 2
Isolasi Bakteriofage Litik Sebagai Agen Biosanitasi Buana, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol.2 No.2 p.36-42, April 2014
41






Gambar 5. Pembentukan Plaque pada (A)AL7, (B)AL8, (C)SA5, (D)BS4, E(BS6),
F(BS8), G(UA7)

Ketidakmampuan beberapa isolat inang untuk menjadi jernih dalam media cair
tetapi mampu menunjukkan plaque pada media padat disebabkan oleh beberapa
kemungkinan diantaranya, terdapat bakteriofag yang hanya mampu melisiskan bakteri
inang pada media agar sebagai akibat perbedaan kondisi lingkungan antara media
padat dengan cair [11], pertumbuhan host yang terlalu cepat [11], dan sistem
pertahanan terhadap infeksi bakteriofag secara alami [12]. Namun demikian, diduga
kuat bahwa penyebab utama ketidakmampuan isolat inang untuk menjadi jernih dalam
media cair lebih disebabkan oleh kondisi lingkungan media yang berbeda dan
pertumbuhan host yang terlalu cepat. Alasan berupa sistem pertahanan alami dari
inangakan menyebabkan ketidakmampuan isolat inang untuk menjadi jernih di media
cair dan tidak menunjukkan plaque di media padat, sehingga alasan ini tidak dapat
digunakan.
A B
C D
E F
G
Isolasi Bakteriofage Litik Sebagai Agen Biosanitasi Buana, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol.2 No.2 p.36-42, April 2014
42


SIMPULAN

Hasil konfirmasi biofilm dengan menggunakan metode TCP dan TM
menunjukkan bahwa bakteri target yang digunakan dalam penelitian ini mampu untuk
membentuk biofilm. Pada proses isolasi bakteriofag, didapatkan tiga isolat bakteriofag
dengan nama BS6, BS8, dan UA7. Ketiga isolat tersebut dapat digunakan lebih
lanjut untuk proses aplikasi pada biofilm.

DAFTAR PUSTAKA

1) Simes, M., Simes,L.C., and Vieira,M.J. 2008. A Review of Current and
Emergent Biofilm Control Strategies. LWT-Food Science and Technology Vol. 43,
573 583.
2) Wirtanen, G. and Salo,S. 2007. Microbial Contaminants & Contamination Routes
in Food Industry. VTT Symposium 248 on 1st Open Seminar Food Safety and
Hygiene Networking within New Member States and Associated Candidate
Countries. Finland.
3) Sillankorva, S.M. 2008. Use of Bacteriophages to Control Biofilms. Dissertation
Thesis. University of Minho and University of Oulu. Portugal and Finland.
4) Budzik, J.M. 2003. Phage Isolation and Investigation. Dartmouth Undergraduate
Journal of Sciences Vol. III No. 1, 37 43.
5) Nurizkiawan, Z. 2011. Isolasi Bakteriofag dan Aplikasinya Dalam Mengendalikan
Bakteri Patogen Untuk Meningkatkan Keamanan Pangan. Skripsi. Universitas
Brawijaya. Malang.
6) Cerca, N., Pier,G.B., Vilanova,M., Oliviera,R., and Azeredo,J. 2004. Influence of
Batch or Fed Batch Growth on Staphylococcus epidermidis Biofilm Formation.
Letters in Applied Microbiology Vol.39, 420 424.
7) Mathur, T., Singhal,S., Khan,S., Upadhyay,D.J., Fatma,T., and Rattan,A. 2006.
Detection of Biofilm Formation Among the Clinical Isolates of Staphylococci: an
Evaluation of Three Different Screening Methods. Indian Journal of Medical
Microbiology Vol. 24 No. 1, 25 29.
8) Travis, J. 2003. All the Worlds Phage. Science News Vol. 164 No.2, pp. 26 28.
9) Breidt, F, McFeeters,R.F., Perez-Diaz,I., and Lee, C.H. 2013. Fermented
Vegetables. Dalam M.P. Doyle and R.L. Buchanan (ed.). Food Microbiology:
Fundamental and Frontiers, 4th ed. ASM Press. Washington, DC.
10) Clokie, M.R.J. and Kropinski,M. 2009. Bacteriophages: Methods and Protocols,
Volume 1: Isolation, Characterization, and Interactions, vol. 501. Humana Press.
New York.
11) Charles Fortier, L. and Moineau,S. 2009. Phage Production and Maintenance of
Stocks, Including Expected Stock Lifetimes. Dalam M.R.J. Clokie and M. Kropinski
(ed.). Bacteriophages: Methods and Protocols, Volume 1: Isolation,
Characterization, and Interactions, vol. 501. Humana Press. New York.
12) Garneau, J.E. and Moineau,S. 2011. Bacteriophages of Lactic Acid Bacteria and
Their Impact on Milk Fermentations. Proceedings of 10
th
Symposium on Lactic
Acid Bacterium. Netherland.