LAPORAN PRAKTIKUM VIROLOGI

ISOLASI BAKTERIOFAG

Disusun Oleh:
Kelompok 3
1. Dhea Amandari (2230801067)
2. Ainun Shihah (2230801078)

Dosen Pengampu:
Riri Novita Sunarti, M.Si

PROGRAM STUDI S1 BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI RADEN FATAH
PALEMBANG
2023
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Virus adalah satu set dari satu atau lebih molekul genom berupa asAm
nukleat (RNA atau DNA), yang biasanya dibungkus oleh selubung pengaman
berupa protein selubung atau lipoprotein dan hanya dapat memperbanyak diri
dalam sel inang hidup yang sesuai dengan memanfaatkan metabolisme,
materi, dan energi dari sel inang Virus merupakan unit elemen yang masih
menunjukkan tanda kehidupan sehingga virus dapat juga didefinisikan
sebagai organisme aseluler yang mempunyai genom yang hanya dapat
bereplikasi dalam sel mang dengan menggunakan perangkat metabolism sel
inang untuk membentuk seluruh komponen virus.
Seperti pada virus lainnya, bakteriofag atau yang biasa disebut
dengan fag memiliki karakteristik tersendiri yaitu memiliki struktur yang
sederhana. Bakteriofag atau fag memiliki ukuran yang sangat berukuran
nanometer (Moineau, 2013) yaitu sekitar 24-400 nm panjang. Struktur pada
bakteriofag terdiri dari protein dan materi genetik. Selain itu bakteriofag
memiliki beragam bentuk variasi morfologi. Bakteriofag memiliki protein
dan kepala kapsid yang memiliki fungsi untuk melindungi materi genetik,
materi genetik pada bakteriofag terdiri atas DNA atau RNA (baik double-
stranded atau single-stranded) (Schrader, 2014).
Keberadaan bakteriofag tersebar luas di alam. Lingkungan yang
ditempati oleh bakteri inang merupakan sumber ke- beradaan berbagai jenis
fag yang dapat dii- solasi untuk berbagai tujuan Meskipun demikian jumlah
bakte riofag yang sudah teridentifikasi di dunia masih terbatas sehingga pe
nelitian terkait isolasi dan identifikasi bakteriofag terus dilaksanakan di
berbagai negara di dunia. Kelimpahannya yang sangat tinggi di alam.
keberadaan- nya sebagai mikroflora alami pada makanan, kemampuan qntuk
menginfeksi dan membunuh sel bakteri in- ang melalui proses lisis dan
spesifitas dalam menyerang inang target (Shende et al., 2017).
B. Tujuan
Adapun tujuan dari praktikum ini yaitu
1. Untuk mengetahui apakah bakteriofag dapat dijadikan sebagai biokontrol
pertumbuhan Escherichia coli pada makanan dan minuman.
2. Untuk mengetahui konsentrasi optimum dari bakteriofag dalam
melisiskan Escherichia coli pada daging ayam dan susu kedelai.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Pengertian Bakteriofag
Bakteriofag merupakan virus yang menyerang bakteri. Bakteriofag
merupakan salah satu alternatif untuk mengatasi masalah infeksi bakteri
patogen. Penggunaan bakte-riofag dipertimbangkan lebih menguntungkan
dibandingkan antibiotik, Bakteriofag hanya menginfeksi patogen target,
sehingga mikro- flora normal di usus tidak terganggu, kedua bakteriofag
mereplikasi diri pada bakteri dan menghancurkan sel bakteri inang dengan
sem- purna melalui proses lisis nya (Strydom dan Witthuhn, 2015)
Bakteriofag merupakan virus yang menginfeksi bakteri. Bakteriofag
mampu membunuh sel bakteri secara langsung atau dengan menggabungkan
DNA virus ke dalam kromosom bakteri inangnya Pemanfaatan kemampuan
bakteriofag tersebut dapat digunakan untuk mengontrol biofilm dan
mengurangi penggunaan chemical sanitizer (Nurizkiawan,2011).
Bateriofag merupakan virus parasit bakteria yang dapat
menghancurkan sel hakteri dengan melisiskan dinding selnya. Bakteriofag
mengontrol populasi bakteri jenis tertentu secara spesifik serta efektif dengan
cara menginjeksikan materi genetik (DNA atau RNAJ untuk bereplikasi
menjadi partikel virus menggunakan mesin reproduksi sel bakteri dan
selanjutnya keluar serta menyebar dengan melisiskan sel tersebut. Karakterini
dimanfaatkan dalam pengembangan agen terapi di berbagai bidang. Berbagai
jenis bakter memiliki kemungkinanan dapat diinfeksi oleh setidaknya satu
jenis bakteriofag (Acheson, 2011).

B. Metode Isolasi Bakteriofag

Ada beberapa isolasi mikroba yakni, Metode gores atau streak plate
menggunakan loop ose dan menggoreskannya ke permukaan media agar
dengan pola tertentu. lalu metode tuang atau pour plate yaitu mencampur
suspensi bakteri dengan medium agar pada suhu 50°C dan menuangkannya
pada cawan petri. kemudian metode sebar atau spread plate dilakukan dengan
menuangkan suspensi bakteri ke atas medium agar kemudian menyebarkannya
secara merata menggunakan trigalski atau L glass (Mikdarullah & Aditiya
Nugraha, 2017)
Dalam melakukan isolasi bakteriofag terdapat beberapa tahapan yaitu
Tahapan pertama, yaitu amplifikasi bakteriofag dengan cara suspensi biofilm
dimasukkan ke dalam erlenmeyer sebanyak 40 mL ditambah 5 ml LB cair 10x
dan 5 mL kultur E. coli umur 24 jam yang telah diremajakan pada media LB
cair, dan diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam pada shaker 100 rpm.
Tahap kedua adalah filtrasi bakteriofag dengan mensentrifugasi kultur
bakteriofag pada kecepatan 2000 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil dan
difiltrasi dengan syringe menggunakan membran filter 0,20 µm steril. Filtrat I
diamplifikasi ulang dengan menambahkan 1 mL LB 10x dan 5 mL E. . coli ke
dalam 4 mL filtrat I. Campuran diinkubasi selama 24 jam dan dilakukan
filtrasi II (Brown, 2012)
Filtrat I dan filtrat II disimpan pada suhu 4 °C. Plaque assay Kultur E.
coli dibuat dengan memasukkan 1% E. coli 24 jam pada 50 mL LB cair dan
diinkubasi pada shaker kecepatan 100 rpm, 24 jam. Optical Density (OD) E.
coli diukur, kemudian sebanyak 0,5% kultur diinokulasikan pada 10 mL LB
cair. E. coli diukur OD600 per jam dengan spektrofotometri hingga
didapatkan OD 0,2 yang merupakan awal log phase. Filtrat bakteriofag
diencerkan hingga 10-8 .
Masing- masing pengenceran diambil sebanyak 0,1 mL dan
dimasukkan ke dalam 0,5 mL E. coli OD 0,2 kemudian diinkubasi selama 10
menit dalam waterbath inkubator. Kontrol dibuat dengan menambahkan 0,5
mL E. coli. Masing-masing perlakuan ditambahkan 6 mL LB semi padat,
kemudian dituangkan ke dalam media LB padat dan diinkubasi pada suhu 37°
C selama 24 jam. Pengamatan berupa plak yang terbentuk pada cawan petri,
dan dilakukan perhitungan titer bakteriofag (Brown, 2012)
C. Penggunaan Bakteriofag
Sifat bakteriofag yang sangat spesifik menyerang bakteri tertentu
sangat menguntungkan karena menjadikan aman saat bakteriofag dikonsumsi
manusia. Berdasarkan United States Food and Drug Administration (2006),
bakteriofag pada keju dapat digunakan untuk membunuh bakteri Listeria
monocytogenes kemudian Penggunaan bakteriofag dalam membunuh
bakteri patogen penyebab foodborne disease memberikan alternatif
pemecahan masalah dalam penggunaan antibiotik. dari segi keamanan,
virulent phage AS BRE BRAW (bakteriofag yang eksklusif mengakibatkan
lisis) memiliki banyak keuntungan Sebagai biokontrol maupun agen terapi
karena kemampuannya dalam menyerang spesifik bakteri dengan spesifisitas
yang tinggi tanpa mengganggu mikrobiota lainnya (Coffey et al. (2010)
Banyaknya keuntungan dari penggunaan bakteriofag dan trend
konsumen dalam mengikuti konsep back to nature menjadikan penelitian
tentang bakteriofag semakin menjadi perhatian dunia.. Beberapa penelitian
tentang isolasi bakteriofag yang telah dilakukan antara lain: isolasi bakteriofag
dari sampah diperoleh bakteriofag yang mampu menghambat pertumbuhan
enam isolat Salmonella spp isolasi bakteriofag dari sayur asin diperoleh
bakteriofag yang mampu menghambat pertumbuhan enam strain bakteri
Leuconostoc fallax (Smith et al., 2006)

D. Tantangan dan Prospek Isolasi Bakteriofag

Bakteriofag tidak diragukan lagi merupakan ancaman terbesar dalam
produksi makanan fermentasi, terutama dalam industri susu, yang secara
terbuka mengakui masalah bioteknologi ini. Industri susu menggunakan
sejumlah besar sel bakteri (107 sel / ml) dalam pengolahan susu untuk
menghasilkan keju, yogurt, buttermilk, dan produk fermentasi lainnya. Pada
tahun 1935, Whithead dan Cox mendemonstrasikan bahwa proses fermentasi
susu, yang didorong oleh bakteri asam laktat, dapat diperlambat atau bahkan
dihentikan oleh fag yang mematikan.
 Selama dekade berikutnya, banyak publikasi melaporkan adanya fag
yang menyebabkan masalah di pabrik susu industri. Kontaminasi fag sangat
mempengaruhi, bahkan dalam konsentrasi rendah, karena dapat menyebabkan
hilangnya produk sepenuhnya karena lisis strain bakteri yang disukai (Labrie
dan Moineau, 2010).
Masalah dapat diatasi dengan menggunakan agen antimikroba yang
dapat mendegradasi biofilm dengan mekanisme berbeda dengan antibiotik dan
disinfektan. Pemanfaatan bakteriofag merupakan salah satu metode yang
efektif untuk mengontrol pertumbuhan biofilm. Bakteriofag memenuhi
persyaratan/kebutuhan tersebut karena bersifat non toksik, spesifik, dan
efektif. Bakteriofag sebagai agen antibiofilm berdasarkan beberapa penelitian
ahli dinilai efektif untuk mendegradasi senyawa polisakarida penyusun
matriks polimerik ekstraselular biofilm (Chan dan Abedon, 2015; Esmat et al.,
2018).

E. Aplikasi Bakteriofage dalam Pengendalian Bakteri Patogen

Aplikasi bakteriofage dalam pengendalian bakteri patogen telah
menjadi bidang penelitian yang menarik dalam beberapa tahun terakhir di
Indonesia. Bakteriofage merupakan virus yang memiliki kemampuan untuk
menginfeksi dan menghancurkan bakteri tertentu. Keunikan ini membuat
mereka menjadi agen potensial dalam upaya pengendalian bakteri patogen
yang mempengaruhi industri pertanian, pangan, dan kesehatan manusia.
Dalam konteks ini, studi tentang aplikasi bakteriofage dalam pengendalian
bakteri patogen di Indonesia telah menjadi fokus utama penelitian yang
dilakukan oleh para ilmuwan.
Salah satu contoh penerapan bakteriofage dalam pengendalian bakteri
patogen terjadi dalam bidang pertanian. Penyakit tumbuhan yang disebabkan
oleh bakteri patogen dapat menyebabkan kerugian yang signifikan dalam
produksi pertanian. Dalam hal ini, bakteriofage dapat digunakan sebagai
alternatif pengendalian alami yang lebih berkelanjutan daripada penggunaan
bahan kimia sintetis seperti pestisida. Beberapa penelitian di Indonesia telah
menunjukkan potensial bakteriofage dalam mengendalikan bakteri patogen
seperti Xanthomonas spp. dan Ralstonia solanacearum pada tanaman tomat
dan cabai (Rachmawati, 2017).
Penggunaan bakteriofage dalam pengendalian bakteri patogen pada
tanaman juga memberikan manfaat terhadap kelestarian lingkungan
pertanian, dengan mengurangi pencemaran bahan kimia dan dampak
negatifnya pada organisme non-target. Studi lain yang dilakukan di Indonesia
oleh Yuhantini dan tim menunjukkan bahwa beberapa bakteriofage memiliki
kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen pada tanaman
padi (Yuhantini, 2014). Oleh karena itu, penggunaan bakteriofage sebagai
agen pengendalian bakteri patogen dalam pertanian di Indonesia memiliki
potensi yang signifikan.
Selain pertanian, aplikasi bakteriofage juga berperan penting dalam
pengendalian bakteri patogen pada industri pangan dan peternakan. Bakteri
patogen seperti Salmonella dan Escherichia coli (E. coli) merupakan
penyebab umum keracunan makanan dan infeksi yang membahayakan
kesehatan manusia. Penggunaan antibiotik dalam pengendalian bakteri
patogen pada hewan ternak telah menimbulkan masalah resistensi antibiotik
yang semakin mendesak.
Dalam hal ini, bakteriofage dapat menjadi alternatif yang efektif dan
aman dalam mengendalikan bakteri patogen pada hewan ternak di Indonesia.
Penelitian yang dilakukan oleh Rillos dan tim menunjukkan bahwa
penggunaan bakteriofage yang spesifik dalam mengendalikan bakteri patogen
pada daging ayam dapat memberikan hasil yang positif (Rillos, 2017).
Penelitian lain yang dilakukan oleh Rusdi dan tim menunjukkan
bahwa beberapa bakteriofage efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri
patogen pada produk susu seperti Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
(Rusdi, 2017). Oleh karena itu, penggunaan bakteriofage dalam industri
pangan dan peternakan menjadi alternatif yang menarik dan berpotensi di
Indonesia.
 Meskipun aplikasi bakteriofage dalam pengendalian bakteri patogen
memiliki potensi yang menjanjikan, masih ada beberapa tantangan yang perlu
diatasi. Salah satu tantangan utama adalah identifikasi dan isolasi
bakteriofage yang efektif terhadap bakteri patogen tertentu. Karakteristik unik
setiap bakteriofage dan inang bakteri yang spesifik mempengaruhi efektivitas
mereka dalam pengendalian bakteri patogen. Oleh karena itu, diperlukan
penelitian lebih lanjut dalam mengidentifikasi dan mengisolasi bakteriofage
yang efektif dan spesifik terhadap bakteri patogen yang merupakan masalah
di Indonesia.
Selain itu, keamanan penggunaan bakteriofage juga perlu
diperhatikan. Potensi transfer genetik antara bakteriofage dan bakteri inang
menjadi perhatian, karena dapat mempengaruhi stabilitas genetik bakteri
patogen dan memberikan dampak yang tidak diinginkan.
Untuk mengatasi tantangan-tantangan tersebut, penelitian berkualitas
tinggi dan berkelanjutan tentang aplikasi bakteriofage dalam pengendalian
bakteri patogen di Indonesia sangat penting. Dalam berbagai studi yang telah
dilakukan, dapat dilihat bahwa potensi penggunaan bakteriofage sebagai agen
pengendalian dalam berbagai sektor telah terbukti efektif dan menjanjikan.
Dalam perspektif ke depan, penelitian tentang aplikasi bakteriofage dalam
pengendalian bakteri patogen di Indonesia perlu terus dilakukan guna
mengembangkan strategi yang lebih efektif dan spesifik.
Dengan demikian, diharapkan penggunaan bakteriofage sebagai agen
pengendalian bakteri patogen dapat membantu mengurangi dampak patogen
pada pertanian, industri pangan, dan kesehatan manusia, serta memberikan
kontribusi positif dalam menghadapi tantangan yang terkait dengan keamanan
pangan dan kesehatan di Indonesia.
 BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM

A. Tempat dan Waktu

Praktikum Isolasi Mikroba Virologi di selenggarakan pada hari Kamis

tanggal 5 Oktober 2023, bertempat di Laboratorium Terpadu, Fakultas Sains
dan Teknologi, UIN Raden Fatah Palembang.

B. Alat dan Bahan

Adapun Alat dan Bahan yang disiapkan pada Isolasi Bakteriofag, yaitu
1. Alat

Erlenmeyer, Gelas Ukur, Magnetic Stirrer, Spatula,Batang Pengaduk,

Tabung Reaksi, Rak Tabung, Jarum Inokulum, Pipet Tetes, Suntikan,
Cawan Petri, Gelas Beker, Tabung Eppendorf, Bunsen, Korek Api,
Autoklaf, Mikropipet Hot Platechopper, Timbangan Analitik, Kertas
Label, Alat Tulis, LAF (Laminar Air Flow), Plastik Wrap, Tip (1000μ dan
100 Μ), Sentrifuge, Kulkas, Spektrofotometer UV-VIS, Saringan Milipore
0,22u, Vortex, Incubator, dan Lemari Penyimpanan.

2. Bahan
Adapun bahan yang digunakan adalah Aquades Steri, Kassa, Kapas,
Alkohol 70, Etanol, Nacl 0.9%, Fisiologis CaCl2, Media Lactose Broth
(LB), media NASM Buffer, EMBA, Daging Ayam, Koleksi Isolat yaitu
Bakteorifag (Fag), Escherichia coli.

C. Cara Kerja

Adapun cara kerja pada Praktikum Isolasi Bakteriofag, diantaranya:

1. Bakteri yang tumbuh dilakukan pemurnian dengan cara membuat media
EMBA pada tabung reaksi miring lalu gores bakteri yang sudah ada.
Selanjutnya, inkubasi di inkubator shaker selama 24 jam
2. Kultur Pertama: Masukkan 5 ml LB + 1 ml sampel bakteri hasil inkubasi
pada tabung miring dan inkubasi shaker selama 30 menit
3. Kultur Kedua: Masukkan 5 ml LB + 10 ml sampel (air dari tempat
pengambilan sampel, sampel paling pertama) + 5 ml kultur pertama dalam
botol kultur. Selanjutnya, di inkubasi di inkubator shaker selama 48 jam
disebut suspensi
4. 10 ml suspensi masukkan kedalam tabung sentrifuge lalu di beri label
penanda.
5. Lakukan sentrifuge selama 20 menit dengan 3X pengulangan, kecepatan
2.500 rpm, atau 5 menit dengan 1 pengulangan, dengan kecepatan 3000
rpm.
6. Filtrasi: Supernatan dipisahkan dari pelet dengan menggunakan jarum
suntik, ganti jarum dengan saringan filtrat, masukkan ke tabung reaksi ±
10 ml
7. Kultur Ketiga: Masukkan 5 ml LB dalam tabung reaksi + E. coli 1 ml dari
tabung miring peremajaan. Selanjutnya, inkubasi shaker selama 30 menit
8. Hasil Inkubasi: ambil 100 μl fage (hasil filtrasi). Masukkan dalam tabung
reaksi, inkubasi selama 30 menit
9. Metode Pencawanan Double Layer: a) Tuang Media NA dalam cawan
petri besar sebagai layer pertama tunggu hingga memadat, b) Sediakan soft
agar (LB + Swallow) sebanyak 5 ml, c) masukkan 5 ml soft agar dalam
hasil inkubasi kedua (fage + E. coli), d) lakukan vortex di setiap tabung
reaksi, e) tuangkan diatas media NA dalam cawan petri, f) inkubasi selama
24 jam
10. Amati Plak yang terbentuk dari hasil pencawanan double layer
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
No. Gambar Keterangan
1. Bakteri yang tumbuh dilakukan
pemurnian dengan cara membuat
media EMBA pada tabung reaksi
miring lalu gores bakteri yang sudah
ada. Selanjutnya, inkubasi di
inkubator shaker selama 24 jam

Sumber: Ainun, 2023

Sumber: Rosa, 2023

Sumber: Rosa, 2023

2. Kultur Pertama: Masukkan 5 ml
LB + 1 ml sampel bakteri hasil
inkubasi pada tabung miring dan
inkubasi shaker selama 30 menit
3. Kultur Kedua: Masukkan 5 ml LB
+ 10 ml sampel (air dari tempat
pengambilan sampel, sampel
paling pertama) + 5 ml kultur
pertama dalam botol kultur.
Selanjutnya, di inkubasi di
inkubator shaker selama 48 jam
disebut suspensi

Sumber: Ainun, 2023

Sumber: Ainun, 2023

4. 10 ml suspensi masukkan
kedalam tabung sentrifuge lalu di
beri label penanda

Sumber: Dhea, 2023

Sumber: Dhea, 2023

 Sumber: Dhea, 2023
5. Lakukan sentrifuge selama 20 menit
dengan 3X pengulangan, kecepatan
2.500 rpm, atau 5 menit dengan 1
pengulangan, dengan kecepatan 3000
rpm.

Sumber: Dhea, 2023

Sumber: Dhea, 2023

6. Filtrasi: Supernatan dipisahkan dari
pelet dengan menggunakan jarum
suntik, ganti jarum dengan saringan
filtrat, masukkan ke tabung reaksi ±
10 ml.

Sumber: Ainun, 2023

 Sumber: Ainun, 2023

Sumber: Ainun, 2023

7. Kultur Ketiga: Masukkan 5 ml LB
dalam tabung reaksi + E. coli 1 ml
dari tabung miring peremajaan.
Selanjutnya, inkubasi shaker selama
30 menit

Sumber: Ainun, 2023

8. Hasil Inkubasi: ambil 100 μl fage
(hasil filtrasi). Masukkan dalam
tabung reaksi, inkubasi selama 30
menit

Sumber: Ainun, 2023

Sumber: Anisa, 2023

9. Metode Pencawanan Double Layer:
a) Tuang Media NA dalam cawan
petri besar sebagai layer pertama
tunggu hingga memadat, b) Sediakan
soft agar (LB + Swallow) sebanyak 5
ml, c) masukkan 5 ml soft agar dalam
hasil inkubasi kedua (fage + E. coli),
d) lakukan vortex di setiap tabung
reaksi, e) tuangkan diatas media NA
dalam cawan petri, f) inkubasi
Sumber: Ainun, 2023 selama 24 jam

Sumber: Ainun, 2023

Sumber: Ainun, 2023

10. Plak yang terbentuk dari hasil
pencawanan double layer
1) PU 3-3
2) SK 1-1
3) SK 1-1
4) PU 3-3

(1) Sumber: Ainun, 2023

 (2) Sumber: Ainun, 2023

(3) Sumber: Ainun, 2023

(4) Sumber: Ainun, 2023

B. Pembahasan
Pertumbuhan bakteri adalah proses yang penting dalam penelitian
mikrobiologi. Untuk mengisolasi dan memurnikan bakteri tertentu, metode
pemurnian diperlukan. Salah satu metode yang umum digunakan adalah
dengan menggunakan media EMBA.
Proses pemurnian dimulai dengan menyiapkan tabung reaksi yang
diletakkan dalam posisi miring. Pada tabung reaksi tersebut, kita akan
membuat media EMBA yang akan menjadi tempat pertumbuhan bakteri.
Media EMBA ini terdiri dari nutrisi yang diperlukan oleh bakteri untuk
tumbuh, seperti larutan LB (Luria Broth) yang mengandung berbagai nutrisi
penting.
Setelah media EMBA siap, kita akan memindahkan atau menggoreskan
bakteri yang sudah ada ke dalam tabung tersebut. Bakteri ini dapat berasal dari
sampel yang telah diinkubasi sebelumnya. Penambahan bakteri ke media
EMBA bertujuan untuk memperoleh koloni bakteri yang murni.
Selanjutnya, tabung reaksi dengan media EMBA dan bakteri akan
dimasukkan ke dalam inkubator shaker. Inkubator shaker ini memberikan
kondisi lingkungan yang optimal bagi pertumbuhan bakteri dengan
menggabungkan pergerakan dan suhu yang tepat. Proses inkubasi dilakukan
selama 24 jam agar bakteri dapat tumbuh dengan baik.
Setelah 24 jam inkubasi, kultur pertama akan diambil sejumlah 1 ml
dan dicampur dengan 5 ml larutan LB di dalam botol kultur. Kultur pertama ini
kemudian diinkubasi kembali selama 48 jam di dalam inkubator shaker. Proses
ini menghasilkan suspensi bakteri yang mengandung banyak bakteri yang
berbeda-beda.
Selanjutnya, suspensi bakteri tersebut akan dipisahkan menggunakan
sentrifugasi. Suspensi akan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge dan diputar
dengan kecepatan tertentu selama 20 menit dengan 3 kali pengulangan, atau 5
menit dengan 1 kali pengulangan. Proses sentrifugasi ini akan menyebabkan
bakteri terpisah menjadi supernatan (cairan) dan pelet (endapan).
Supernatan yang mengandung bakteri akan dipisahkan dari pelet
menggunakan jarum suntik. Kemudian, supernatan akan dilewatkan melalui
saringan filtrat dan masuk ke dalam tabung reaksi sekitar 10 ml. Proses ini
disebut filtrasi, yang bertujuan untuk memisahkan bakteri dari residu yang
tidak diinginkan.
Selanjutnya, kita akan melakukan kultur ketiga dengan menggunakan 5
ml larutan LB dalam tabung reaksi dan menambahkan 1 ml bakteri E. coli dari
tabung miring peremajaan. Proses inkubasi shaker selama 30 menit akan
dilakukan untuk memastikan bakteri tumbuh dengan baik dalam media LB.
Setelah itu, ambil 100 μl fage (hasil filtrasi) dan masukkan ke dalam
tabung reaksi. Proses inkubasi selama 30 menit akan dilakukan lagi. Proses ini
akan memungkinkan bakteriofage atau virus yang menginfeksi bakteri tumbuh
dalam media.
Selanjutnya, kita akan menggunakan metode pencawanan Double Layer
untuk mengamati plak yang terbentuk dari hasil pencawanan. Proses ini
melibatkan beberapa langkah. Pertama, tuang media NA dalam cawan petri
besar sebagai layer pertama tunggu hingga memadat. Lalu, sediakan soft agar
(LB + Swallow) sebanyak 5 ml. Soft agar ini akan digunakan sebagai layer
kedua. Kemudian, masukkan 5 ml soft agar ke dalam hasil inkubasi kedua
(fage + E. coli) dan lakukan vortex di setiap tabung reaksi untuk memastikan
campuran homogen. Setelah itu, tuangkan campuran tersebut di atas media NA
dalam cawan petri. Terakhir, inkubasi selama 24 jam akan dilakukan untuk
memungkinkan pertumbuhan bakteri dan pembentukan plak.

Pada akhirnya, hasil pencawanan double layer akan diamati. Plak yang
terbentuk adalah daerah yang terlihat bening dan tidak ada pertumbuhan
bakteri. Plak ini merupakan daerah di mana bakteriofage telah menginfeksi dan
membunuh bakteri yang sensitif terhadap mereka.
Proses pemurnian bakteri dengan menggunakan metode media EMBA,
inkubasi, dan filtrasi merupakan langkah-langkah yang penting dalam
menyediakan bakteri murni untuk penelitian mikrobiologi. Selain itu, metode
pencawanan double layer juga penting untuk mempelajari interaksi antara
bakteri dan bakteriofage. Semua langkah tersebut membutuhkan ketelitian dan
kehati-hatian agar hasil yang didapatkan akurat dan dapat diandalkan dalam
penelitian yang dilakukan.
 DAFTAR PUSTAKA

Brown, A. E. 2005. Beason's Microbiological Application Compete Versions:

Laboratory Manual and General Micribiology. 9th Edition. The
McGraw-Hill Companies. New York.
Chan, B.K. and Abedon, S.T., 2015. Bacteriophage and their enzyme in biofilm
control. Current Pharmaceutical Design, 21, pp. 85 – 99.
Esmat, M.M., Abdelhamid, A.G., Esmael, A., Nasr-Eldin, M.A., Abolmaaty, S., Hassan,
M.G. and Khattab, A.A., 2018. Antibiotics and phage sensitivity as
intervention and controlling Escherichia coli isolated from clinical speciments.
Journal of Pure and Applied Microbiology. doi://DX.DOI.ORG/10.22207/
JPAM11.4.12
Labrie S, Moineau S. 2010. Bacteriophages in Industrial Food Processing:
Incidence and Control in Industrial Fermentation, p 199-216. In Sabour
P, Griffiths M (ed), Bacteriophages in the Control of Food-and
Waterborne Pathogens. ASM Press, Washington, DC. doi:
10.1128/9781555816629.ch10
Mikdarullah, & Aditiya Nugraha. (2017). Teknik Isolasi Bakteri Proteolitik Dari Sumber
Air Panas Ciwidey, Bandung Mikdarullah dan Aditiya Nugraha. Buletin
Teknik Litkayasa Akuakultur, 15(1), 11–14.
Rachmawati, I. (2017). "Isolasi, Identifikasi dan Uji Viabilitas Bakteriofage
Penyebab Pembusukan Buah Cabai (Capsicum annum L.) di Pasar
Tradisional" (Tesis). Universitas Gadjah Mada.
Rillos, M. R. L., et al. (2017). "Isolasi dan Karakterisasi Bakteriofage pada Isolat
Escherichia coli dari Sapi perah". Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner,
22(2), 116-128.
Rusdi, I. (2017). "Uji Aktivitas Bakteriofage pada Escherichia coli dan
Staphylococcus aureus Isolat Susu" (Karya Tulis Ilmiah). Poltekkes
Kemenkes Makassar.
Schrader, K., Probert, W. S., and McQuaid, C. 2014. Isolation and Identification of an
Enterobacter cloaca Strain Producing a Novel Subtype of Shiga Toxin Type 1.
Jurnal Clin Microbiol. 52(7): 2346-2351.
Shende, R, K, Hirpurkar, S, D, Sannat, C, Rawat, N, Pandey, V. 2017. Isolation and
characterization of bacteriophages with lytic activity against common bacterial
pathogens. Veterinary World. 10(8):973-978
Smith, Carey G.V., Billington C, Comelius A.J. Heinemann J.A. 2006. Isolation and
Characterization of Bacteriophages infecting Salmonella spp.
Strydom, A, Witthuhn, C, R. 2015. Listeria monocytogenes: a target for bacteriophage
biocontrol. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety.
14(6):694-704
Yuhantini, E., et al. (2014). "Bakteriofage Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)
dalam Pengendalian Penyakit Hawar Daun Bakteriis Xoo pada Padi di
Wonogiri". Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, 20(1), 25-30.