Pokok bahasan III : MEDIUM KULTUR JARINGAN

Pendahuluan
Salah satu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja kultur jaringan
adalah pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang benar pada
medium kultur. Medium yang dipergunakan pada kultur in vitro tumbuhan ada
bermacam-macam. Pemilihan medium tergantung pada jenis tanaman yang
digunakan, selera, tujuan serta perhitungan masing-masing peneliti. Isi dan
komposisi dari medium kultur dirancang secara khusus untuk tujuan yang
berbeda. Medium MS, singkatan dari nama penemunya, Murashige dan Skoog
atau LS singkatan dari Linsmaier dan Skoog merupakan medium yang sangat
banyak digunakan untuk kultur kalus dan regenerasi berbagai tanaman, medium
ini mengandung garam-garam mineral dengan konsentrasi tinggi dan senyawa N
dalam bentuk ammonium dan nitrat ; medium B5 (Gamborg) banyak digunakan
untuk kultur suspensi sel tanaman leguminosae; Nitsch & Nitsch, N6 (Chu)
banyak digunakan untuk serealia dan tanaman lain; medium WPM (Lloyd dan
McCown) untuk kultur jaringan tanaman berkayu; Vacin dan Went (VW) dan
Knudson C banyak digunakan untuk anggrek; medium Kao dan Michayluk
digunakan untuk kultur protoplas Cruciferae, Gramineae dan Leguminosae. Pada
dasarnya tidak ada satu macam medium kultur yang dapat memberikan
pertumbuhan optimal untuk semua sel, penggantian medium atau salah satu
komponen

medium

seringkali

diperlukan

untuk

merespon

setiap

type

pertumbuhan dari satu macam eksplan. Studi literature sangat diperlukan untuk
mengembangkan atau memodifikasi medium kultur, modifikasi dari medium
kultur yang telah ada umumnya didasarkan pada trial and error.

Tujuan Instruksional Khusus

Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa dapat menjelaskan
komponen dasar medium kultur jaringan, kebutuhan zat-zat anorganik dan
organik, substansi organik lamplek, bahan tambahan lain pada medium kultur
dan proses pembuatan medium .

Subpokok Bahasan : KOMPONEN DASAR MEDIUM KULTUR JARINGAN

Pendahuluan
Pada prinsipnya medium diberikan kepada sel-sel tanaman in vitro
dengan maksud memberikan nutrisi sesuai dengan kebutuhan sel-sel tanaman
tersebut secara alami sebagai tanaman utuh yang tumbuh dialam. Tumbuhan
dialam bebas bersifat autotrof, memerlukan nutrient sederhana yang terdapat
didalam tanah berupa garam-garam mineral dan air untuk meneruskan siklus
hidupnya. Hal ini dapat dipahami karena sebagian terbesar tubuh tumbuhan
tersusun atas unsur-unsur penyusun zat anorganik tersebut. Pada kultur in vitro
tumbuhan, untuk keperluan hidupnya, sel-sel pada eksplan juga memerlukan
nutrient yang komposisinya jauh lebih komplek karena eksplan sedikit banyak
telah kehilangan sifat autotrofnya.

Materi subpokok bahasan 1

Komponen dasar dari medium kultur dapat bermacam-macam, secara
umum medium kultur jaringan harus mengandung unsur-unsur sebagai berikut:
1. Garam-garam anorganik:
a. Unsur makro : C, H, O, N, S, P, K, Ca dan Mg
b. Unsur Mikro : Cl, B, Mo, Zn, Cu, Fe dan Co
2. Zat-zat organic
a. Gula
b. Myo-Inositol
c. Vitamin
d. Asam-asam amino
e. Zat pengatur tumbuh
3. Substansi organik komplek:
a. Air kelapa
b. Ekstrak buah-buahan
c. Ekstrak yeast
d. Pepton
e. Tripton
f.

Hydrolisat kasein, dll

4. Bahan pemadat
a. Agar-agar
b. Gelrite
c. Phytagel
d. Sea Plaque Agarose, dll.
5. pH
6. Bahan tambahan lain misalnya arang aktip.

Kebutuhan zat-zat anorganik

Unsur makro.
Air merupakan zat terbanyak pada tubuh tumbuhan, oleh karena itu air
juga merupakan bagian terbesar didalam medium kultur. Air selain sebagai
bahan untuk membentuk material tubuh, juga sebagai medium untuk reaksireaksi kimia dan fisika. Air juga berguna untuk transport dan distribusi zat-zat
yang terlarut didalamnya. Pada medium kultur jaringan digunakan air murni yang
sudah mengalami demineralisasi, deionisasi dan didestilasi dengan gelas dua
kali.
Kebutuhan garam-garam mineral didalam jaringan kurang lebih sama
dengan tanaman utuh. Garam-garam mineral merupakan gabungan unsur-unsur
esensial makro dan mikro. Konsentrasi optimum dari tiap-tiap komponen untuk
mencapai kecepatan pertumbuhan yang maksimal sangat bervariasi. Menurut
Gamborg dan Shylluk (1981) biasanya berkisar antara 25-60mM.
Unsur makro dibutuhkan dalam jumlah cukup besar, pada umumnya
diberikan dalam bentuk persenyawaan. George dan sherrington (1984)
menyebutkan beberapa persenyawaan makronutrien yang umum digunakan
pada medium kultur jaringan, antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O;
NaNO3; CaCl2. 2H2O; MgSO2. 7H2O; KCl; KH2PO4; NH4H2PO4; NaH2PO4. 2H2O;
Na2SO4; (NH4)2SO4; NH4Cl; K2SO4.
Nitrogen (N)
Nitrogen diberikan dalam bentuk persenyawaan yang bermacam-macam,
antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O; NaNO3; NH4H2PO4; (NH4)2SO4;
NH4Cl. Kebutuhan N terbesar adalah untuk menyusun asam-asam nukleat,
protein, sebagai koenzym atau persenyawaan lain yang mengandung N seperti

klorofil, alkaloid, derivat purin dan pirimidin dan beberapa hormon endogen.
Sumber nitrogen pada medium kultur adalah ion ammonium (NH4)+ dan nitrat
(NO3)-. Jumlah ion ammonium yang digunakan berkisar antara 2-8 mM,
sedangkan nitrat berkisar antara 25-40 mM. Pengambilan unsur nitrat
memerlukan pH rendah, sebaliknya pengambilan ammonium menyebabkan
pembebasan H+ sehingga medium menjadi asam. Medium Murashige dan Skoog
(MS) menyediakan nitrogen dalam bentuk garam NH4NO3, ini merupakan strategi
yang baik dan mempunyai keuntungan ganda, karena selain sumber N nya
lengkap juga dalam bentuk garam effeknya terhadap penurunan pH medium
berkurang (George dan Sherrington, 1984).

Fosfor (P)
Fosfor

diberikan

pada

medium

kultur

jaringan

dalam

bentuk

persenyawaan KH2PO4 atau K2HPO4; NH4H2PO4; NaH2 PO4. Ion PO total yang
diberikan pada medium bervariasi antara 0,5 - 20 mM/1. Unsur P didalam sel
diubah menjadi persenyawaan RNA dan DNA, zat-zat yang sangat penting yang
bertanggung jawab atas sifat-sifat keturunan. Unsur P diperlukan sebagai
aktifator ensim untuk memacu pertumbuhan pada jaringan meristematik.
Kelebihan unsur P dapat menghambat pertumbuhan eksplan, karena akan terjadi
persaingan penyerapan dengan unsur lain seperti seng (Zn), besi (Fe) dan
tembaga (Cu).

Kalium (K)
Kalium diberikan pada medium dalam bentuk KNO3; KH2PO4 atau
K2HPO4, KCl; dan K2SO4. Ion K+ total yang diberikan pada medium bervariasi
antara 1,837-25.18 mM/1. Unsur K sangat diperlukan untuk memacu
pembelahan sel, sintesa karbohidrat dan protein, pembuatan klorofil serta untuk
mereduksi nitrat (Kyte, 1983). Kalium berpengaruh pada hidratasi, menambah
atau mengurangi hidratasi pada misel seiiingga mempengaruhi keluar masuknya
nutrien ke dalam sel.

Sulfur (S)
Sulfur atau belerang diberikan pada medium dalam bentuk MgSO4. 7H2O;
(NH4)2SO4; K2SO4; FeSO4.7H2O; MnSO4.4H2O; ZnSO4. 7H2O; CuSO4. 5H2O.

Pemberian belerang berkisar antara 0,75 - 3 mM/1. Sulfur ada didalam beberapa
molekul protein dan koenzym. Memacu perkembangan akar, juga berguna untuk
ketahanan atau proteksi tubuh tumbuhan. Belerang diserap dalam bentuk SO4=,
antara lain dijadikan aneurin, biotin, persenyawaan asam amino yang ada
belerangnya misalnya, cystein, methionin.

Calcium (Ca)
Calcium atau kapur diberikan pada medium dalam bentuk Ca(NO3).
4H2O; CaCl2.2H2O; Ca3 (PO4)2. Pemberian ion Ca berkisar antara 1-3 mM/l.
Pemakaian Ca-nitrat ada kelemahannya karena sangat higroskopis, sehingga
didalam wadahnya seringkali (dijumpai kristalnya berair. Sebaiknya Ca-nitrat
dibuat larutan stok dan disimpan didalam kulkas. Ca-fosfat juga ada
kelemahannya yaitu tidak mudah larut. Untuk melarutkannya, sejumlah tertentu
Ca-fosfat dimasukan kedalam Erlenmeyer 50 ml, kemudian diberi beberapa tetes
HCl 0,1 N campuran ini digojok sambil dipanasi sampai larut (tampak jemih).
Calcium diperlukan untuk pembentukan dinding primitive, sebagai Capectat yaitu bagian integral dari dinding sel, penting sebagai kation selular dan
kofaktor enzym. Calcium mempengaruhi hidratasi, permeabilitas dan penyerapan
nutrient. Calcium juga mempengaruhi tingginya pH, menetralisir racun, misalnya
pada asam oksalat. Asam oksalat dengan Ca akan menjadi Ca-oksalat
berbentuk kristal dan diisolasi atau dimumifikasikan ikklam sel tertentu menjadi
sel-sel kristal.

Magnesium (Mg)
Magnesium terutama diberikan pada medium dalam bentuk MgSO4.
7H2O. Magnesium diperlukan sebagai elemen utama dalam pembentukan
klorofil, berperan penting sebagai aktivator ensim terutama dalam proses
fosforilasi dan sintesis protein dengan cara membentuk komplek ensim-substrat.
Unsur mikro
Unsur hara mikro adalah unsur yang diperlukan dalam jumlah sedikit.
Fungsinya belum diketahui secara pasti, tetapi tidak adanya zat-zat ini dapat
menyebabkan kelainan pertumbuhan. Air dan bahan kimia yang tingkat
kemurniannya rendah seringkali terkontaminasi oleh unsur hara mikro. Bentuk

persenyawaan hara mikro yang umum digunakan pada beberapa medium kultur
menurut George dan Sherrington (1984) adalah: MnSO4.4H2O; ZnSO4. 7H2O;
H3BO3; KI; CuSO4. 5H2O; NaMoO4. 2H2O; CoCl2. 6H2O; FeCl3. 6H2O; Fe III
citrate; FeSO4.7H2O; NaFeEDTA; Na2EDTA. 2H2O; Fe(SO4)3; Fe III tartrate.
Besi (Fe)
Besi diperlukan dalam jumlah sedikit lebih banyak daripada unsur mikro
yang lain, diberikan dalam bentuk chelat. Pemberian Fe bersama-sama dengan
NaEDTA dimaksudkan agar besi tetap pada jangkauan pH yang luas dalam
jangka waktu yang lama sehingga dapat diserap oleh jaringan tanaman. Fe
berperan penting dalam sintesis klorofll, konfersi energi pada fotosintesis dan
respirasi dengan melakukan reduksi oksidasi, bagian dari sitokrom. Besi
diberikan pada medium kultur jaringan berupa FeCl3. 6H2O; Fe III citrate;
FeSO4.7H2O; NaFeEDTA 2H2O; Fe(SO4)3; Fe III tartrate.
Boron (B)
Boron diberikan pada medium kultur sebagai asam borak (boric acid,
H3BO3). Berperan dalam translokasi karbohidrat, juga terlibat dalam difsrensiasi
seluler dan perkembangan. Ikatan boron organis memungkinkan adanya
diferensiasi dan penyusunan

struktur

halus dari dinding

sel sehingga

memudahkan transport karbohidrat dan penyerapan ion kedalam sel; sebagai

aktifator dan inaktifator bagi zat pengatur tumbuh. Kalau boron kurang zat
pengatur tumbuh menjadi terlalu banyak sehingga menghambat pertumbuhan.

Molybdenum (Mo)
Molybdenum

diberikan

pada

medium

sebagai

sodium

molybdat

(Na2MoO4. 2H2O) berpartisipasi pada konfersi nitrogen ke ammonia dan fiksasi

nitrogen, ikut dalam metabolisme protein, sintesis asam askorbat, kofaktor enzim.

Manganese (Mn)
Manganese merupakan elemen esensial yang terdapat pada membran
kloroplas, berperan sebagai aktifator ensim dengan bertindak sebagai perantara
pada proses fosforilasi atau sebagai gugus redok Mn++. Bahan pembentuk klorofil
dan aktip dalam fotosintesa, metabolisme protein dan pembentukan vitamin C.

Pada medium kultur diberikan dalam bentuk MnSO4.

Cobalt (Co)
Cobalt merupakan elemen dari molekul vitamin B komplek, esensial untuk
fiksasi nitrogen. Pada medium kultur jaringan diberikan dalam bentuk
persenyawaan Cobalt Oiloride (CoCl2).
Zincum (Zn)
Zincum berperan sebagai aktifator ensim, penyusun khlorofil, pemacu
pembentukan zat pengatur tumbuh terutama IAA. Pada medium kultur jaringan
diberikan dalam bentuk one sulfate (ZnSO4).
Cuprum (Cu)
Cuprum merupakan bagian dari ensim, Cu bereaksi menjadi komponen
phenolase, lactase dan askorbat oksidase. Ikut ambil bagian dalam proses
fotosintesis dan reduksi nitrit. Cuprum diberikan pada medium kultur jaringan
dalam bentuk Cupric sulfate (CuSO4 5H20).
Chlorine (Cl)
Chlorine sebagai ion berpengaruh terhadap aktifitas ensim, memacu
proses fotosintesis. Chlorine diberikan pada medium kultur jaringan berupa
calcium chloride (CaCl2)
Kebutuhan zat-zat organik
Zat-zat organik adalah persenyawaan yang mengandung karbon,
ditambahkan pada medium kultur jaringan berupa gula, myo-Inositol, vitamin,
asam-asam amino dan zat pengatur tumbuh. Zat-zat organik tersebut biasanya
tidak diberikan pada tanaman karena tanaman dapat mensintesis sendiri, tetapi
pada kultur in vitro, karena eksplan yang digunakan umumnya berukuran sangat
kecil dan tidak marnpu mensintesis sendiri semua zat-zat organik tersebut, maka
zat-zat organik harus ditambahkan pada medium.

Gula
Tumbuhan dialam bebas mencukupi kebutuhan gula dengan mengasimilasi CO2

pada proses fotosintesa, dengan pertolongan klorofil dan sinar matahari,

dijadikan glucose kemudian dijadikan pati, selulose dan persenyawaanpersenyawaan lain. Pada kultur in vitro, sel dan jaringan tumbuhan belum
sempurna dalam melakukan asimilasi fotoautotrof, sehingga diperlukan gula
sebagai sumber karbon dan enersi. Selain sebagai sumber enersi bagi sel dan
jaringan, gula juga berfungsi sebagai penjaga keseimbangan tekanan osmotik
potensial didalam medium. Gula pada umumnya diberikan pada medium kultur
berupa sukrosa atau komponen-komponennya seperti monosakarida glukosa
atau fruktosa. Sukrosa pada medium kultur ditambahkan sebanyak 30 gr/l.
Glukosa atau D-glukosa biasanya ditambahkan dengan konsentrasi 20 - 30 gr/l,
tergantung dari jenis eksplan. Sukrosa ternyata lebih berpengaruh dalam
perkembangan kalus, sedangkan pengaruhnya terhadap organogenesis belum
dapat dipastikan (George dan Sherrington, 1984). Pada kultur mikrospora
beberapa spesies tanaman digunakan maltosa, maltosa dihidrolisis lebih lambat
dibandingkan dengan sukrosa, ini memberi pengaruh yang lebih baik pada
mikrospora yaitu dapat memacu embryogenesis (Indrianto et al. 1999).

Myo-Inositol
Myo-Inositol ditambahkan pada medium untuk membantu diferensiasi dan
pertumbuhan jaringan. Myo-Inositol ikut serta dalam beberapa reaksi metabolik
penting yang berhubungan dengan pembelahan sel. Myo-Inositol merupakan
perantara pada perubahan glukosa menjadi asam galakturonat juga sebagai
prazat untuk pektin dan penyusun dinding sel.

Vitamin
Vitamin ditambahkan pada medium untuk mempercepat pertumbuhan,
diferensiasi kalus. Vitamin berfungsi sebagai kofaktor atau bagian dari molekul
kofaktor dari reaksi-reaksi ensimatis penting, vitamin juga berfungsi protektif.
Seperti halnya zat pengatur tumbuh, vitamin juga mempengaruhi (menstimulasi)
inisiasi, pertumbuhan dan perkembangan akar. George dan Sherrington (1984)
memasukan beberapa macam vitamin yang umum digunakan pada berbagai
medium dasar, antara lain: Thiamin-HCl, Nicotinic acid, Pyridoxin-HCl, Ca Dpanthothenate, Folic acid, Choline chloride, Riboflavin, yang kesemuanya
merupakan anggota dari vitamin B kompleks. Ascorbic acid dan adenin juga

sering ditambahkan pada medium. Vitamin labil terhadap pemanasan, dianjurkan

untuk selalu menggunakan filter steril jika akan ditambahkan pada medium.
Thiamin merupakan vitamin yang esensial terdapat pada hampir semua
medium kultur jaringan tumbuhan, cenderung mempercepat pembelahan sel
pada meristem akar tetapi tidak berpengaruh terhadap pemanjangan sel.
Thiamin merupakan bagian prostetik yang terdapat didalam sel, berperan
sebagai koensim dalam reaksi yang menghasilkan enersi dari karbohidrat dan
memindahkan enersi. Thiamin diberikan dalam jumlah yang bervariasi dari kirakira 0,1 sampai 30 mg/l (Doods dan Roberts, 1983).
Nicotinic acid (niacin) penting dalam reaksi-reaksi ensimatis disamping
peranannya sebagai prekursor dari beberapa alkaloid. Ascorbic acid sering
ditambahkan pada medium, terutama untuk mencegah terjadinya pencoklatan
pada permukaan irisan jaringan yang disebabkan karena terjadinya reaksi
oksidasi senyawa polyphenol menjadi quinon yang berwarna coklat, vitamin disini
berfungsi sebagai antioksidan.

Asam-asam amino
Asam amino merupakan sumber N organik , penyusun protein dan asam
nukleat, lebih cepat diambil oleh sel dan jaringan tanaman dari pada N anorganik
didalam medium kultur jaringan. Adapun asam amino yang umum ditambahkan
pada medium adalah: Glutamine, Glycine, L-Cyteine, L-Arginine, L-Aspartic acid,
L-Methionine.

Zat pengatur tumbuh

Selain nutrisi, zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen
medium bagi pertumbuhan, perkembangan dan diferensiasi. Zat pengatur
tumbuh aktif pada konsentrasi rendah dan diproduksi didalam tubuh tanaman itu
sendiri (endogen). Untuk keperluan kultur jaringan telah dibuat zat pengatur
tumbuh sintetik, tanpa zat pengatur tumbuh pertumbuhan eksplan akan
terhambat bahkan mungkin tidak tumbuh sama sekali. Zat pengatur tumbuh
dikelompokan dalam beberapa grup: Auksin, Sitokinin, Gibberellin, Abscisic acid,
dan Ethylene.

Auksin
Indole-3-acetic acid (IAA) merupakan auksin alamiah yang terdapat pada
sebagian besar tumbuhan. Disintesis dari tryptophane terutama di primordia
daun, daun muda dan pada kecambah. IAA ditransport dari sel ke sel dengan
arah basipetal (dari pucuk ke akar). IAA berperan dalam mempengaruhi
pemanjangan sel; pembelahan sel; diferensiasi jaringan faskuler; inisiasi
pembentukan akar; mempengaruhi dominasi apikal; zona absisi pada daun dan
buah; pembungaan; pemasakan buah, dll.
IAA mudah larut dalam alkohol. Penggunaan IAA pada medium kultur
kerap kali kurang menguntungkan karena mudah rusak oleh cahaya, oksidasi
ensimatik dan pemanasan pada saat proses sterilisasi dengan autoclave.
Penggunaan auksin sintetik lebih menguntungkan karena lebih stabil. Auksin
sintetik yang umum digunakan pada medium adalah: 2,4-dichlorophenoxyacetic
acid (2,4-D); 1-naphthaleneacetic acid (NAA) dan indole-3-butyric acid (IBA).
Beberapa persenyawaan seperti dicamba (3,6-dichloro-O-anisic acid) dan
picloram (4-amino-3,5,6-trichloro-2-pyridinecarboxilic acid) pada konsentrasi
tinggi merupakan herbisida, digunakan sebagai auksin substitusi.
Kultur in vitro tumbuhan yang pada mulanya memerlukan auksin eksogen
untuk pertumbuhannya, secara gradual atau bahkan secara tiba-tiba dapat hilang
dan tidak memerlukan auksin lagi, hal yang demikian disebut sebagai habituasi
terhadap auksin. Penggunaan auksin secara tunggal pada umumnya sudah
cukup mampu untuk menginduksi pembentukan dan pertumbuhan kalus, tetapi
untuk

beberapa

tanaman

yang

rekalsitran

akan

lebih

membantu

jika

menggunakan lebih dari satu jenis auksin secara simultan. Pada kultur jaringan
tanaman monokotil, terutama rumput-rumputan dan palem, juga pada kultur in
vitro umbi akar wortel, memerlukan auksin sintetik seperti 2,4-D dengan dosis
yang cukup tinggi. Penghilangan atau pengurangan kadar auksin pada sub kultur
berikutnya dapat memacu produksi embrio somatik atau organ adventiv.
Pertumbuhan kultur juga dapat dipacu dengan penambahan substansi yang
dapat mengatur tingkatan IAA endogen misalnya, dopamine dapat menghambat
aktifitas IAA oksidase sehingga tidak terjadi oksidasi terhadap IAA, akibatnya
pertumbuhan jaringan dan organ pada kultur in vitro menjadi lebih baik.
Penghambat sintesis auksin seperti 5-hydroxy-nitrobenzyl bromide (HNB) dan 7azaindole memacu embryogenesis somatik pada kultur kalus citrus yang telah

mengalami habituasi.

Sitokinin
Sitokinin adalah derivat dari adenin, kinetin (6-furfurylaminopurin) dan
zeatin adalah sitokinin alami yang umum digunakan secara meluas pada medium
kultur. Sitokinin disintesis melalui modifikasi biokimia dari adenin, terjadi pada
ujung akar dan biji yang tumbuh. Kebalikan dari auksin, sitokinin ditransport
melalui xylem dari akar ke pucuk. Sitokinin hanya aktip jika ada auksin,
pemberian sitokinin bersama auksin pada medium kultur dapat memacu
pembelahan sel dan morfogenesis. Sitokinin mempengaruhi transport auksin,
pertumbuhan kuncup lateral (mematahkan dominasi apikal), perkembangan
daun, menghambat proses penuaan daun dan mempengaruhi perkembangan
kloroplas. Sitokinin sintetik seperti N6-benzylaminopurine (BAP) lebih sering
digunakan pada medium kultur jaringan.
Phenylurea, substansi aktip yang terdapat pada air kelapa mempunyai
efek yang sama dengan zeatin, penggunaannya memerlukan konsentrasi yang
lebih

tinggi.

komersial

Thidiazuron

digunakan

(N-phenyl-N-l,2,3-thiazol-5-ylurea),

sebagai

defoliant,

karena

yang

kemampuannya

secara
untuk

menstimulasi produksi ethylene, dapat digunakan untuk memacu pembentukan

dan proliferasi tunas in vitro. Substansi lain yang mempunyai aktifitas seperti
sitokinin adalah endosperm cair pada kecambah jagung.
Diferensiasi selular dan morfogenesis in vitro terutama dikendalikan oleh
interaksi antara konsentrasi auksin dan sitokinin yang diberikan pada medium
kultur. Manipulasi rasio auksin: sitokinin dapat mempengaruhi organogenesis,
pada

perbandingan

auksin/sitokinin

tinggi

memacu

pembentukan

akar,

perbandingan yang sebaliknya akan memacu pembentukan tunas. Jika

perbandingan auksin sitokinin seimbang hanya terbentuk kalus.

Gambar 3.1. Efek auksin + sitokinin (George dan Sherrington, 1984)

Ada beberapa perkecualian:
1. Proliferasi tunas aksiler pada beberapa spesies tanaman dapat dipacu
dengan auksin bersama sitokinin.
2. Induksi kalus pada beberapa monokotil dapat dipacu pada medium yang
ditambahkan auksin dengan konsentrasi tinggi tanpa sitokinin.
3. Morfogenesis in vitro pada monokotil dipacu pada medium dengan auksin
konsentrasi rendah atau tanpa auksin.

Gibberellin (GA)
Pada 1926 Kurasawa mendapatkan kecambah padi yang tumbuh
abnormal karena terinfeksi oleh sejenis jamur Gibberella fujikuroy. Substansi
yang menyebabkan pertumbuhan seddling padi menjadi sangat cepat (abnormal)
tadi diketahui sebagai gibberelic acid (GA3). Gibberellin merupakan zat pengatur
tumbuh yang dalam bentuk larutan pada temperatur tinggi mudah kehilangan
sifatnya sebagai zat pengatur tumbuh. Gibberellin merupakan keluarga
persenyawaan yang didasarkan pada struktur entgibberellane. Ada 34 gibberellin

yang telah diidentifikasi secara kimia, beberapa diantaranya ditemukan pada

embryo dimana dapat memicu produksi alfa amilase yang dapat mengubah
cadangan makanan pada biji menjadi gula sehingga dapat digunakan oleh
embryo untuk pertumbuhannya. Gibberellin disintesis dari asam mevalonat pada
jaringan muda dari tunas dan biji yang sedang berkecambah, ditransport di
dalam xylem dan phloem. Gibberellin berpengaruh pada pertumbuhan batang,
pembesaran dan pembelahan sel, induksi perkecambahan biji, produksi ensim
selama perkecambahan, pembentukan bunga. Seperti halnya auksin, gibberellin
juga dapat memacu pembentukan akar, George dan Sherrington (1984)
mengatakan bahwa pacuan pembentukan akar dapat terjadi karena gibberellin
dapat menyebabkan peningkatan jumlah auksin endogen. Pada medium kultur
yang biasa digunakan adalah GA3.
Abscisic acid (ABA)
Abscisic acid (ABA) adalah persenyawaan tunggal dengan berat molekul
264,31, larut dalam NaHCO3 cair, kloroform, aceton dan ether. ABA disintesis
dari asam mevalonat pada daun-daun tua terutama sebagai respon terhadap
stres air (kekeringan). ABA ditransport dari daun melalui phloem, ABA dapat
bergerak ke akar didalam phloem dan kemudian kembali ke pucuk melalui xylem.
ABA berperan pada penutupan stomata, transport fotosintat kearah biji-biji yang
sedang tumbuh. Pada kultur in vitro tumbuhan, ABA digunakan untuk
menginduksi embryogenesis mikrospora, ABA juga dapat menghambat proses
perkecambahan yang terlalu dini pada embryo somatik.

Ethylene
Ethylene adalah zat pengatur tumbuh yang berbentuk gas, disintesis dari
methionine didalam berbagai jaringan tumbuhan sebagai respon terhadap stres.
Pada umumnya gas ethylene disintesis pada jaringan-jaringan yang mengalami
senescence atau yang mengalami penuaan. Ethylene bergerak secara berdifusi
dari tempat sintesisnya. Perananya adalah dalam membebaskan dormansi,
diferensiasi dan pertumbuhan tunas, pembentukan akar adventiv, pemasakan
buah, induksi pembungaan dll. Ethylene jarang dipergunakan pada kultur in vitro.
Penggunaan ethylen inhibitor seperti silver nitrate atau sulfat (ZnSO4), cobalt
atau nickel chloride (CoCl2) dan asam salisilat pada medium kultur dapat

iraeningkatkan regenerasi pucuk dan produksi embryo somatik, tetapi hasilnya

sering kali koetradiktif. Ethylen dapat mempercepat perusakan sitokinin dan
menstimulasi perakaran pada kultur in vitro.
Zat pengatur tumbuh yang umum digunakan pada kultur jaringan

Zat pengatur tumbuh

Singkatan

Berat Molekul

Abscisic acid

ABA

264,3

Indole-3-acetic acid

IAA

175,2

Naphthaleneacetic acid

NAA

186,2

2,4-Dicholorophenoxyacetic

2,4-D

221,04

IBA

203,2

6-Furfurylaminopurine

Kinetin

215,2

6-Benzyl-aminopurine

BA

225,2

2Ip

203,3

Zeatin

219,2

GA3

346,4

Indole-3-butyric acid

N ( -isopentenyl)-adenine
Trans-6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl)
amino purine
Gibberelic acid

Sabstansi organik komplek

Substansi

organik

komplek

biasanya

belum

dikenal

benar

isi

komposisinya, termasuk didalamnya pepton, tripton, hydrolisat casein, yeast

ekstrak, malt ekstrak, dan bermacam-macam tanaman seperti, air kelapa,
endosperm jagung, ekstrak pisang, tomat, kentang, jeruk, nanas dll. Substansisubstansi komplek ini jika digunakan terlalu tinggi dapat merugikan pertumbuhan
sel, disarankan untuk melakukan pengujian dahulu dengan interval 1- 5 g/1,
untuk menetapkan pengaruhnya terhadap pertumbuhan. Jumlah air kelapa yang
biasanya ditambahkan pada medium adalah 2-15 % v/v. Substansi organik
kompleks ini kelemahannya tidak konsisten kadarnya dan tidak diketahui dengan
pasti komposisinya.

pH medium
pH merupakan simbol dari derajat keasaman atau kebasaan dari larutan

yang ditunjukan dengan konsentrasi ion hidrogen. pH tertentu diperlukan untuk

pertumbuhan jaringan tanaman agar tidak mengganggu fungsi membran sel dan
sitoplasma. pH yang diperlukan pada medium kultur biasanya berkisar antara 4,6
-5,8. Pengaturan pH medium dilakukan dengan menggunakan sodium hydroxyde
(1M NaOH), digunakan untuk menaikan pH medium (menjadi lebih alkalin, basa)
dan hydrochloric acid (1M HC1), untuk menurunkan menjadi lebih asam. pH
medium harus dipertahankan konstan selama kultur berlangsung karena akan
mempengaruhi ketersediaan nutrien yang dapat diserap oleh sel dan jaringan
tanaman untuk pertumbuhannya. Ada suatu persenyawaan komplek yang
mampu membuat pH suatu medium tetap pada jangkauan tertentu, misalnya besi
yang berikatan dengan chelat. KH2PO4 juga dapat berfungsi sebagai buffer.
pH juga penting pada proses embryogenesis somatik pada kultur umbi
akar wortel, stadium preglobular embryo dapat dipertahankan dan ditingkatkan
jumlahnya pada medium dengan pH dibawah 4,5. Jika pH dinaikkan, embryo
somatik melanjutkan pertumbuhannya melalui tahapan-tahapan yang normal
seperti pada embryo zygotik, yaitu globular, jantung, torpedo dan cotyledonary
(atau equivalen dengan system yang berlaku pada monokotil).

Bahan pemadat (Gelling agent)

Gelling agent digunakan untuk memadatkan medium, bahan pemadat
yang sering digunakan pada medium adalah agar-agar (7-10 g/l), bahan pemadat
lain (Jarang digunakan) adalah gelrite, gelrite lebih bening dari agar-agar.
Pemakaian gelrite juga lebih sedikit untuk mencapai kepadatan yang sama
dengan agar, yaitu 2 g/l. Agarose juga sering digunakan untuk kultur protoplas
dan

mikrospora.

Penggunaan

bahan

pemadat

ini

megandung

banyak

kelemahan:
1. Hanya sebagian eksplan yang kontak dengan medium
2. Terjadi gradient nutrisi yang tidak sama
3. Mobilitas hara menjadi kurang baik
4. Terjadi akumulasi zat-zat toksik yang dikeluarkan oleh eksplan.

Beberapa macam medium dasar

Ada beberapa macam medium dasar, pada umumnya diberi nama sesuai
dengan nama penemunya. Beberapa diantaranya adalah:

1. Medium Murashige dan Skoog (MS) (1962), medium yang paling populer
digunakan untuk hampir semua macam tanaman, terutama tanaman
herbaceus. Medium ini paling banyak digunakan untuk kultur kalus dan
tunas, mempunyai konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi, dan
senyawa N dalam bentuk ammonium dan nitrat.
2. Medium Gamborg (B5) (1968), digunakan untuk kultur suspensi sel
kedele, alfalfa dan legume lain.
3. Medium White (W63) (1963), merupakan medium dasar dengan
konsentrasi garam-garam mineral yang rendah, digunakan untuk kultur
akar.
4. Medium Vacint dan Went (VW) (1949), digunakan untuk kultur embryo
anggrek.
5. Medium Nitsch dan Nitsch, digunakan untuk kultur mikrospora dan kultur
sel pada tembakau
6. Medium N6, Chu (1978), digunakan untuk kultur jaringan serealia
terutama padi
7. Medium WPM (Lloyd dan McCown, 1980), untuk tanaman berkayu
8. Medium Kao dan Michayluk (1975) digunakan untuk kultur protoplas
Cruciferae, Grarmneae dan Leguminosae.
(George & Sherrington, 1984).
PEMBUATAN MEDIUM MURASHIGE & SKOOG
Untuk membuat medium kultur jaringan, kita harus menimbang setiap
komponen bahan kimia yang tertera pada resep. Langkah ini menjadi kurang
praktis, memakan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Selain itu timbangan
yang digunakan untuk menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang
tidak tersedia. Jalan keluar yang harus ditempuh adalah dengan membuat
larutan stok, setiap larutan stok dapat dipergunakan untuk 40, 50 dan bahkan
100 liter medium.
Larutan stok dibuat menjadi beberapa kelompok : stok besi (iron), stok
mikronutrien, stok vitamin dan stok hormon. Untuk makronutrien tidak dibuat
stok, jadi harus ditimbang satu persatu, tetapi jika diperlukan dapat dibuat larutan
stok secara tunggal, tidak dikelompokkan menjadi satu.

Yang

perlu

diperhatikan

dalam

pembuatan

larutan

stok

adalah

kepekatannya. Larutan stok yang dibuat terlalu pekat akan mengalami

pengendapan sejalan dengan lama waktu penyimpanan, jika hal ini terjadi stok
harus dilarutkan dengan pemanasan terlebih dahulu sebelum digunakan. Larutan
stok harus disimpan dalam lemari es (kulkas). Larutan stok kadang-kadang
terkontaminasi, ditumbuhi mikroorganisme, stok yang terkontarninasi tidak dapat
dipergunakan lagi. Jadi kebersihan harus dijaga dan jangan membuat larutan
stok terlalu banyak.
Bahan dan alat:
1. Tabel formula dan bahan-bahan kimia untuk medium MS
2. Akuades
3. Aluminum foil, kertas timbang, tissue, kertas label
4. Timbangan analitik
5. Gelas piala 600 ml, 50 ml
6. Labu takar 100 ml, gelas ukur 100 ml
7. Erlenmeyer 1000 ml, 100 ml, 50 ml, atau botol kultur
8. Pipet, pengaduk
9. Magnetic stirrer dengan hot plate
10. pH meter
11. Autoclave, millipore filter, pompa fakum

I. Pembuatan larutan stok untuk medium MS

A.

Stok besi (IRON): dalam 200 ml (40 kali konsentrasi)

1. Ditimbang 1.492 mg Na2EDTA dan 1.112 mg Fe2SO4.7H2O, kedua bahan
tersebut dilarutkan dalam kira-kira 75 ml akuades secara terpisah.
Larutan Fe2SO4.7H2O dipanaskan sampai hampir mendidih, kemudian
masukan larutan Na2EDTA sedikit demi sedikit sambil diaduk (dengan
magnetik stirrer). Kedua larutan akan tercampur, bening dan berwarna
kuning emas, jika larutan keruh, tambahkan beberapa tetes HCl 1 N lalu
dipanaskan. Biarkan mendingin pada suhu kamar, tambahkan akuades
sampai volume menjadi 200 ml. Masukan dalam botol khusus berwarna
gelap, beri label:
IRON. MS 40X, 5 ml/I

2. Simpan dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 5 ml

larutan stok besi.

B.

Stok Mikronutrien : dalam 100 ml (100 kali konsentrasi)

Mikronutrien diperlukan dalam jumlah sangat sedikit, oleh karena itu stok

mikronutrien dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran.

1. Ditimbang bahan-bahan kimia mikronutrien dengan timbangan analitik,
masing-masing
MnSO4. H2O

2.230 mg

ZnSO4.4 H2O

860 mg

H3BO3

620 mg

KI

83 mg

NaMoO4. 2H2O

25 mg

CuSO4. 5H2O

2,5 mg

CoCl2. 6H2O

2,5 mg

2. Masukan satu persatu dalam gelas piala 200 ml yang berisi akuades
kurang lebih 80 ml. Setiap kali memasukan bahan kimia harus segera
dilarutkan

(diaduk),

baru

kemudian

bahan

berikutnya.

Jangan

memasukan semua bahan kimia kemudian dilarutkan, akan terjadi

presipitat (endapan). Untuk melarutkan bisa dibantu dengan magnetik
stirrer.
3. Larutan yang sudah jadi ditambahkan akuades sampai volume menjadi
100 ml.
4. Masukan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label:
MIKRO MS 100X, 1 ml/I.
5. Simpan dalam kulkas, untuk membuat medium MS 1 liter, diperlukan 1 ml
stok mikro
C. Stok Vitamin, dalam 200 ml (50 kali konsentrasi) Vitamin dapat dibuat dalam
satu wadah sebagai stok campuran
1. Ditimbang bahan-bahan dibawah ini:
Glycine
Nicotinic acid

100 mg
25 mg

Pyridoxine-HCl

25 mg

Thiamine-HCl

5 mg

2. Larutkan satu persatu dalam gelas piala 600 ml yang berisi akuades
(steril) kira-kira sebanyak 150ml.
3. Tambahkan akuades steril sampai volume mencapai 200 ml
4. Masukan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label:
VITAMIN MS. 5OX, 4 ml/I
5. Simpan dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 4 ml
stok vitamin.

D. Stok zat pengatur tumbuh

Zat pengatur tumbuh diperlukan dalam jumlah yang sangat terbatas.
Kelarutan dari masing-masing zat juga berbeda-beda. Biasanya stok zat
pengatur tumbuh dibuat dengan kepekatan 100-500 mg/l.
Siok Kinetin : 500 mg/l (500 ppm)
1. Timbang kinetin 50 mg, masukan dalam gelas piala 100 ml
2. Teteskan sedikit larutan HCl 1 N dan dipanaskan sebentar sampai larut,
sambil diaduk tambahkan 20 ml akuades panaskan sebentar sampai
larutan menjadi jernih.
3. Setelah dingin, masukan dalam labu takar 100 ml, tambahkan akuades
sampai volume menjadi 100 ml.
4. Pindahkan dalam erlenmeyer 100 ml atau wadah lain yang bersih, tutup
rapat, beri label:
KINETIN 500 ppm
5. Simpan dalam kulkas.
Stok IAA; NAA; 2,4-D; IBA : 500 mg/l (500 ppm)
1. Timbang IAA; NAA; 2,4-D dan IBA secara terpisah masing-masing
sebanyak 50 mg, masukan masing-masing bahan dalam gelas piala 100
ml.
2. Teteskan beberapa tetes larutan KOH 1 N dengan hati-hati panaskan
sampai larut benar (jernih), sambil diaduk tambahkan 20 ml akuades,
untuk

mempercepat

proses

pelarutannya

dapat

dibantu

dengan

pemanasan
3. Pindahkan dalam labu takar 100 ml, tambahkan akuades sampai volume
menjadi 100 ml.
4. Pindahkan dalam wadah stok, tutup yang rapat, beri label pada masingmasing wadah :
IAA 500 ppm

2,4-D 500 ppm

NAA 500 ppm

IBA500 ppm.

5. Simpan dalam lemari es.

E. Myo-Inositol dan Sukrose: karena jumlahnya cukup banyak,tidak dibuat stok,
ditimbang setiap kali membuat media.

II. Pembuatan medium MS padat sebanyak 1 liter

1. Siapkan erlenmeyer 1000 ml yang berisi 500 ml akuades
2. Timbang setiap komponen bahan kimia makronutrien (sesuai dengan
label), larutkan satu persatu, untuk mempercepat pelarutan dapat dibantu
dengan magnetic stirrer.
3. Masukan 5 ml larutan stok IRON
4. Masukan 1 ml larutan stok MIKRONUTRIEN
5. Masukan 4 ml larutan stok VITAMIN
6. Masukan zat pengatur tumbuh (sesuai kebutuhan)
7. Timbang 100 mg Myo-Inositol, masukan dalam erlenmeyer dan larutkan
8. Timbang 30 g sukrose, masukan dalam erlenmeyer dan larutkan.
9. Tambahkan akuades sampai volume mencapai 1000 ml
10. Ukur pH menjadi 5,6 - 5,8 dengan penambahan HCl atau KOH.
11. Timbang 8 g agar-agar, masukan dalam erlenmeyer, panaskan (sambil
diaduk) sampai agar-agar larut.
12. Dalam keadaan masih cair, bagilah media kedalam botol kira-kira 40
ml/botol.
13. Tutup rapat dengan aluminum foil dan beri label sesuai dengan
perlakuan.
14. Masukan kedalam autoclave dan sterilisasi pada suhu 121C selama 15
menit dengan tekanan 15 psi.
15. Setelah tekanan turun sampai 0, medium yang sudah steril segera

dikeluarkan dari autoclave, jangan menunggu sampai dingin didalam

autoclave.
16. Medium yang sudah steril disimpan dalam ruang penyimpanan.

Latihan soal-soal
1. Sebutkan dan jelaskan dengan singkat 5 komponen dasar dari medium
kultur!
2. Apa keunggulan medium Murashige dan Skoog !
3. Jelaskan apa kelemahan digunakannya medium agar!
4. Jelaskan peranan auksin dan sitokinin pada proses diferensiasi in vitro!
5. Jelas mengapa micronutrient harus dibuat larutan stok!

Petunjuk jawaban latihan soal-soal

1. Ingat komponen dasar medium kultur j aringan!
2. Ingat keunggulan medium MS
3. Ingat kelemahan medium agar!
4. Ingat peran auksin dan sitokinin!
5. Ingat pembuatan medium!