LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN TAHAN ASAM

Kamis, 12 Maret 2015
Kelompok II
Senin, Pukul 10.00 13.00 WIB

Nama

NPM

R.A Siti Nur Azizah

260110130013

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015

Nilai

TTD

( Sani ) ( Casuarina )

PEWARNAAN TAHAN ASAM

I.

Tujuan
Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri
tak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam
pewarnaan (Ziehl-Neelsen). Memahami setiap langkah dan reaksireaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.

II.

Prinsip
a. Pewarnaan tahan asam atau disebut juga pewarnaan ziehl Neelsen
merupakan teknik pewarnaan yang digunakan untuk mewarnai
bakteri golongan Mycrobacterium ( M. tuberculosis/ M. leprae )
dan Actinomycetes.
b. Penetrasi zat warna merupakan mekanisme masuknya zat warna ke
dalam dinding sel atau membrane sel, yang disebut juga sebagai
difusi zat.
c. Impermeabilitas dinding sel bakteri tahan asam memiliki sifat
impermeable terhadap zat pewarna atau bahan kimia lainnya
karena susunan dinding selnya yang terdiri dari lemak dengan
arabinogalaktan dan peptidiglogikan di bawahnya.
d. Pewarnaan dengan pemanasan pada dinding sel bakteri bertujuan
untuk memuaikan dinding sel sehingga zat pewarna dapat masuk,
pada pemanasan ini tidak terlalu panas karena akan menyebabkan
dinding sel bakteri rusak.

III.

Teori Dasar
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur
dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang
hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel
bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan
metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk

mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel

bakteri melalui serangkaian pengecatan (Mastra, Nyoman, dkk. 2014).
Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya
sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan
biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri
ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan
zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Bakteri
tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu
berantai karbon (C) yang panjangnya 8 95 dan memiliki dinding sel
yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid
yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang
termasuk

BTA

antara

lain

Mycobacterium

tuberculose,

Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis,

dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah bakteri
patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat
tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA).
Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan.
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan
kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya.
Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat
mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci
dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat
berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena
larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol
fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).
Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat
warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%.
Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat
mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang
dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah
pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu

pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan.

Fungsi

pemanasan

untuk

melebarkan

pori-pori

lemak

BTA

sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan
pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah
dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup
pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna
merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol
fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah
penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan
asam akan berwarna biru (Lay, 1994).
Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan
mempunyai sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan
sensitivitas yang tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom.
Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras dengan
lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x
sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak
ada yaitu mikroskop fluorescens (Martin.,2013).
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang lurus atau sedikit
melengkung, tidak berspora dan tidak berkapsul. Bakteri ini berukuran
lebar 0,3 0,6 mm dan panjang 1 4 mm. Dinding M. tuberculosis sangat
kompleks, terdiri dari lapisan lemak cukup tinggi (60%) (Rinda, 2014 ).
Penyusun utama dinding sel M. tuberculosis ialah asam mikolat, lilin
kompleks (complex-waxes), trehalosa dimikolat yang disebut cord factor,
dan mycobacterial sulfolipids yang berperan dalam virulensi. Asam
mikolat merupakan asam lemak berantai panjang (C60 C90) yang
dihubungkan dengan arabinogalaktan oleh ikatan glikolipid dan dengan
peptidoglikan oleh jembatan fosfodiester. Unsur lain yang terdapat pada
dinding sel bakteri tersebut adalah polisakarida seperti arabinogalaktan
dan arabinomanan. Struktur dinding sel yang kompleks tersebut
menyebabkan bakteri M. tuberculosisbersifat tahan asam, yaitu apabila

sekali diwarnai akan tetap tahan terhadap upaya penghilangan zat warna
tersebut dengan larutan asam alcohol (Pearce Evelyn.,2009 )
Di samping ciri-ciri ini, kadar resap pewarna pada sel yang tahan
asam adalah rendah dibandingkan dengan sel tak tahan asam. Ciri-ciri ini
disebabkan oleh perbedaan komposisi kimia (secara kuantitatif dan
kualitatif) bakteria tahan asam dan bakteria tak tahan asam. Mikobakteria
yang tahan asam mempunyai karbohidrat, alkohol dan asam lemak (seperti
asam mikolik) yang tersendiri. Oleh yang demikian, dalam tata cara ini
object glass perlu dipanaskan sehingga uap keluar karena, dalam hal ini,
pemanasan digunakan untuk terlaksananya pewarnaan dalam jangka waktu
yang optimal (Syahrurachman, dkk, 1994 ).
IV.

Alat bahan
4,1 Bahan :
-

Aquadest

Asam Alkohol

Karbol Fuksin

Metilen Blue

Minyak Emersi

Suspensi bakteri Mycrobacterium tuberculosis

4.2 Alat :
No.

Nama Alat

1.

Bak pewarna

Gambar Alat

2.

Botol semprot

3.

Cawan petri

4.

Kaca preparat

5.

Kapas

6.

Kertas saring

7.

Mikroskop

8.

Pembakar spiritus

9.

Pipet tetes

10.

Ose

Rak tabung
1.

V.

Prosedur
Disediakan kaca obyek yang bersih dan dibuat olesan dari suspensi
bakteri, digenangi olesan bakteri dengan pewama karbol fuksin selama
5 menit, sambil dipanaskan di atas penangas air. Jaga jangan sampai
terlalu panas, mendidih atau kering. dibuang zat wama yang berlebih,
lalu dibilas dengan air suling. dibilas dengan zat pemucat alkohol-asam
selama 15 detik atau sampai latar belakang olesan berwarna merah
muda pucat. digenangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen
selama 2 menit, dibuang zat warna yang berlebih, dibilas dengan air
suling, lalu dikeringkan dengan kertas saring. diteteskan sedikit
minyak imersi pada preparat, lalu diperiksa di bawah mikroskop.
dimulai dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu diganti
dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. diamati dan digambarkan
hasilnya. Bakteri tahan asam (ZN + ) akan berwarna merah dan bakteri
tidak tahan asam (ZN -) akan berwarna biru.

VI.

Data Pengamatan
Perlakuan
Ditambahkan

karbol

Hasil
fuchsin

sambil dipanaskan, dibilas dengan

air dan keringkan.
Ditambah

asam

alcohol,dibilas

dengan air dan keringkan.

Ditambah metilen blue, dibilas
dengan air dan keringkan
Ditambah minyak emersi

VII.

Pembahasan
Pada praktikum ini dilakukan teknis aseptis, hal ini bertujuan untuk
mencegah atau meminimaliskan adanya kontaminasi mikroorganisme
baik pada sampel atau praktikan sendiri. Pada praktikum kali ini
dilakukan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasi dan
mengamati bakteri yang bersifat tahan asam, bakteri ini disebut tahan
asam karena akan mempertahankan zat warna perimer ketika
ditambahkan larutan asam, bakteri ini memiliki rantai karbon 8-95 dan
dinding selnya terdiri dari lapisan lilin, asam lemak mikolat, dan lipid
sampai 60 % dari berat dinding selnya, sehingga dengan tebalnya
kadar lipid pada dinding sel

menyebabkan bakteri ini sulit untuk

dilakukan dengan pewarnaan biasa dan perlu perwarnaan khusus.

Pada praktikum ini menggunakan pewarnaan ziehl neelsen untuk
identifikasi dan pengamatan bakteri tahan asam, karena metode ini
merupakan salah satu metode pengujian bakteri tahan asam yang
cukup sederhana dan memiliki spesipisitas dan sensitivitas yang cukup
tinggi. Pada praktiknya hal yang pertama dilakukan adalah pengolesan
sampel pada kaca preparat secar aseptis dalam hal ini sampel yang

digunakan

merupakan

Mycrobacterium

tuberculosis,

dengan

mengambil kaca preparat yang terendam dalam etanol kemudian

dikeringkan dengan kapas sampai benar-benar kering, perendaman
kaca preparat ini bertujuan untuk membunuh bakteri dari praktikum
sebelumnya yang masih melekat pada permukaan kaca preparat.
Dimana etanol ini memiliki dua mekanisme dalam membunuh bakteri
yakni dengan denaturasi protein dan pelarutan membrane lemak pada
bakteri. Setelah kaca preparat kering selanjutnya dibuat pola lingkaran
pada bagian belakang kaca preparat yang berfungsi sebagai tanda
olesan bakteri atau sampel. Kemudiaan menyalakan api spiritus untuk
melakukan fiksasi dan menjaga agar lingkungan pada proses
pemindahan sampel dari cawan petri ke kaca preparat tetap dalam
keadaan steril atau mencegah kontaminan lain masuk ke dalam sampel.
Hal pertama yang dilakukan adalah fiksasi ose terlebih dahulu untuk
mencegah adanya kontaminan yang menempel pada ose, fiksasi ose ini
dilakukan dari ujung kawat dekat batang kaca ose menuju ujung loop
ose, hal ini dilakukan agar panas yang dihantarkan merata serta jika
ose dalam keadaan basah tentu sisa larutan pada ujung loop ose akan
lebih efisien untuk dikeringkan dengan cara ini, selanjutnya ose
dibiarkan dingin di tempat yang masih dekat dengan panas spiritus hal
ini bertujuan agar ketika ose dimasukan ke dalam sampel tidak
menyebabkan bakteri yang terkandung dalam sampel mati akibat panas
dari ose. Selanjutnya mengambil sampel sebanyak satu loop ose dalam
keadaan aseptis,dan oleskan ke atas kaca preparat, dimana teknik
pengolesan sampel harus diperhatikan karena jika olesan terlalu tebal,
maka sel-sel bakteri akan bertumpuk-tumpuk sehingga sulit untuk
menentukan bentuk sel individu dan jika olesan terlalu tipis dapat
menylulitkan pengamatan secara mikroskopis. Selanjutnya dilakukan
fiksasi pada sampel, yang bertujuan untuk merekatkan sel bakteri pada
preparat objek, setelah itu sampel yang telah difiksasi digenangi denga
karbol fuksin selama 5 menit dan dilakukan pemanasan, lama waktu

yang dibutuhkan bertujuan untuk agar zat warna karbol fuksin ini
dapat berpenetrasi secara sempurna ke dalam dinding sel bakteri, dan
dimana karbol fuksin ini merupakan zat pewarna primer yang
mengandung fucsin basa dan fenol, sehingga dengan adanya fenol
pada karbol fuksin ini dapat berfungsi untuk melunakan lapisan lilin
pada dinding sel bakteri sehingga cat warna fuksin dapat masuk ke
dalam sel, hal ini tentu dibantu dengan proses pemanasan yang
mengakibatkan terbukanya pori-pori lemak yang menutupi dinding sel
bakteri sehingga fungsi fenol pada karbol fuksin dapat berjalan dengan
baik, namun pada pemanasan ini sampel harus dijaga jangan sampai
mengering atau terlalu panas karena akan menyebabkan bakteri mati
dan tidak akan dapat teridentifikasi. Selanjutnya dilakukan pencucian
dengan mengaliri aquadest pada sampel, hal ini bertujuan untuk
mencegah adanya kelebihan zat warna pada sampel, kemudian
ditambahkan asam alcohol selama 15 detik, penambahan ini
diperlukan untuk melakukan pemucatan pada bakteri yang dimana hal
ini akan menentukan bakteri tersebut tahan asam atau tidak dimana
jika bakteri bersifat tahan asam, bakteri tersebut tidak akan melepaskan
zat warna primer sebelumnya, namun jika non BTA maka bakteri akan
melepaskan zat warna primernya. Penambahan asam alcohol ini tidak
boleh dilakukan secara berlebihan karena akan menyebabkan
overdekolorization sehingga BTA dan non BTA tidak dapat
dipisahkan, namun jangan pula terlalu sedikit dalam penambahan asam
alcohol pada bakteri karena akan menyebabkan underdecolorization
yang dapat menyebabkan zat warna pada non BTA tidak seluruhnya
terlepas yang mengakibatkan terjadinya ketidak akuratan dalam proses
identifikasi dan pengamatan apda sampel. Selanjutnya dialiri aquadest
untuk menutup pori-pori bakteri sehingga tidak terjadi lagi proses
pemucatan oleh asam alcohol, dan dikeringkan dengan kertas saring
untuk menyerap kelebihan aquadest pada sampel bakteri. Kemudian
preparat sampel bakteri digenagi dengan metilen blue yang berfungsi

sebgai pewarna tandingan, dimana pewarna ini yang akan menunjukan

adanya bakteri non tahan asam, karena bakteri ini akan melepaskan
pewarna primer dan menyerap pewarna sekunder atau tandingan.
Kemudian dibilas dengan aquadest yang berfungsi untuk mencegah
adanya kelebihan zat warna pada sampel, selanjutnya dikeringkan
dengan kertas saring yang erfungsi unuk menyerap kelebihan aquadest
pada sampel, selanjutnya ditambahkan minya emersi karena cahaya
yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda, yaitu udara
dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu
membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan
pembiasan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan
pembiasan yang mendekati garis normal adalah minyak emersi. Selain
itu, minyak emersi juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau
identik dengan kaca,sehingga dapat memfokuskan sampel bakteri pada
pengamatan
dilakukan

mikroskop,
pengamatan

Setelah
dengan

ditambahkan
menggunakan

minyak
mikroskop

emersi
pada

perbesaran 10 x 10 dan 10 x 100, berdasarkan hasil praktikum ini

diperoleh hasil pengamatan latar belakang berwarna biru terang dan
basil bakteri berwarna merah pucat, hal ini menunjukan adanya bakteri
tahan asam pada sampel yakni berupa Mycrobacterium tuberculosis,
bakteri ini bersifat pathogen di dalam tubuh baik pada manusia
maupun hewan, dan bersifat kronis karena mebutuhkan waktu yang
lama agar menimbulkan infeksi pada host nya, berbentuk batang
langsing, lurus atau berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik,
tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri
gram positif.

VIII. Kesimpulan dan Saran

8.1 Kesimpulan
1. pewarnaan dengan teknik ziehl neelsen merupakan peawarnaan
untuk melakukan identifikasi dan pengamatan bakteri tahan asam,
dimana pada prosesnya menggunakan karbol fuksin sebagai zat
pelunak dinding sel bakteri yang disertai pemnasan untuk memuaikan
pori-pori sel bakteri, dan penambahan asam alcohol berfungsi sebgai
zat pemucatan, serta metilen blue sebagai pewarna tandingan.
2. Perbedaan antara bakteri tahan asam ( BTA ) dan bakteri non tahan
asam adalah dilihat dari hasil akhir pewarnaan, dimana pada BTA akan
menghasilkan warna merah pucat atau warna zat primernya
ssedangkan non BTA akan memiliki warna biru atau sesuai dengan
pewarna tandingannya.
8.2 Saran
Dalam praktikum ini, diharapkan seluruh praktikan menggunakan
APD (Alat Pelindung Diri ),serta dapat meningkatkan dan ketelitian
dan keterampilan dalam melakukan identifikasi dan pengamatan
bakteri.

DAFTAR PUSTAKA
Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo
Persada.
Martin. 2013. Pewarnaan BTA. Tersedia online di :
http://majour.maranatha.edu/index.php/jurnal-kedokteran/article/view/65/pdf
[diakses pad 16-03-2015 ].
Mastra, Nyoman, dkk. 2014. Bakteriologi. Denpasar : Politektnik Kesehatan
Denpasar Jurusan Analis Kesehatan.
Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri,
penerjemah; Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari: Anatomy
and Physiology for Nurses.
Rinda. 2014. Bakteri 1. Bakteri tahan Asam. Tersedia online di:
http://rindachie.weng.com/menu/labs/bakteri-5.html [ diakses pad 16-03-2015 ].
Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi.
Jakarta: UI Press.