Alkaloid antitumor dimurnikan (harringtonine. Isoharringtonine.

Dan
homoharringtonine) dari Cephalotaxus
harringtonia telah diisolasi di pabrik percontohan. Langkah-langkah pengolahan
utama termasuk ekstraksi
bahan tanaman dengan etanol, isolasi alkaloid fraksi mentah oleh ekstraksi
kloroform. pendahuluan
pemisahan alkaloid mentah oleh 10-tabung distribusi lawan. konsentrasi alkaloid
aktif
dengan kromatografi kolom. dan pemisahan akhir dari alkaloid aktif dengan 200tabung lawan
distribusi. Dari 455 kg bahan tanaman. sekitar 330 9 dari alkaloid mentah
diperoleh yang
menghasilkan 36 9 dari tiga dimurnikan ester cephalotaxine aktif.
Beberapa alkaloid yang diisolasi dari pohon cemara. Cephalotaxus
harringtonia. telah menunjukkan activitv signifikan
terhadap L-121O atau P388 leukemia pada tikus '(Mikolajczak. e't
al .. 1972: Powell. et al .. 1972). Alkaloid aktif. \ Vhich
adalah ester dari cephalotaxine (1). termasuk harringtonine OI).
isoharrim: MIL tonine. homoharringtonine iIVi. dan deoxv
harringto ~ ine (Vi. Operator dan ~ mber lain Cephal ~ Taxus
alkaloid yang ditemukan di seluruh pohon tetapi yang paling
terkonsentrasi dalam biji dan ditemukan dalam jumlah yang lebih kecil
di akar. batang. dan daun (Perdue. et al .. 1970), Besar
jumlah benih telah tersedia untuk pengolahan,
Daun juga mengandung konsentrasi tinggi lipid dan
bahan etanol-larut lainnya yang membentuk ulet
emulsi yang sulit untuk memproses.
Alkaloid II dan IV ha \ 'e keduanya telah dibersihkan untuk preclini
cal farmakologis e \ 'aluation oleh: \ Kanker ational
Lembaga atas dasar activitv awal mereka. Alkaloid IV

saat ini disukai lebih dari alkaloid II karena SH (; kegiatan ws pada tingkat dosis
sedikit lebih rendah dan tersedia dalam lebih besar
kuantitas.
Makalah ini menjelaskan proses oilot-tanaman yang digunakan untuk
mendapatkan
jumlah gram thre alkaloid antitumor yang sangat dimurnikan
dari bahan tanaman Cephalotaxus. Proses
dikembangkan untuk memberikan jumlah alkaloid untuk
pengujian praklinis dan memberikan panduan untuk diproyeksikan
persiapan skala yang lebih besar.
Bagian eksperimental
Prosedur umum. Langkah-langkah proses utama termasuk:
(A) memotong dan grinding pohon defoliated. termasuk
akar, untuk ukuran partikel yang cocok untuk ekstraksi pelarut: (b)
ekstraksi bahan tanaman dengan 95% etanol
(EtOH): (c) konsentrasi ekstrak oleh penguapan
diikuti oleh pembubaran asam berair dan kemudian ekstraksi
dengan kloroform (CHCb) untuk menghapus lipid dan lainnya
campur bahan; (D) basification dan ekstraksi
alkaloid mentah dari solusi dasar dengan CHCb: (e)
pemisahan awal dari alkaloid oleh lawan 10-tube
distribusi (CCD) antara CHCb dan McIlvaine dunia
penyangga; (F) konsentrasi alkaloid aktif
kromatografi kolom; dan (g) pemurnian aktif
alkaloid (II. III, dan IV) dengan CCD dalam alat 200-tabung.
Seluruh proses diuraikan dalam Gambar 1. Semua ekstraksi
dilakukan pada suhu kamar (27 2 C). dan pelarut
evaporasi dilakukan di bawah tekanan rendah pada
25-40 C.

Sebuah pembibitan komersial di Oregon tersedia 25 pohon. Cephalotaxus

harringtonia (Forbes) K. Koch var. harringtonia
cv. Fastigiata. Pohon-pohon yang dipanen di .January
dan dikeringkan pada suhu kamar sampai .June sebelum grinding.
Akar dan cabang yang lebih rendah pertama kali dipotong menjadi pendek
potongan yang dipotong untuk chip 6,5 cm dengan Appleton
chipper. Cabang atas dipotong menjadi 2.5 hingga 5.0 potongan-cm
dalam pemotong Taylor-Stiles. Grinding akhir terkelupas dengan
materi dan dedaunan hijau untuk ca. Chip 0,7-cm adalah
dilakukan dengan pabrik gesekan, pola piring waveline 6l-cm
ganda disk. 1800 rpm setiap disk, didorong oleh dua ::;. Motor O-hp
(Bauer Bros .. Springfield. Ohio).
Bahan dasar mendalami dengan 95% etanol (EtOH)
di tertutup 210-1. tangki stainless steel: EtOH. meteran volumetrically.
ditambahkan dan tertuang melalui steel
pompa baja. Cairan curam disaring melalui horisontal
plat filter (Sparkler) sebelum terkonsentrasi di
stainless steel tunggal efek. sirkulasi alami. kenaikan
film evaporator untuk menghapus etanol.
Ekstraksi dengan CHCb dilakukan di 245-1. tahan karat
tangki baja. Sebuah pompa stainless steel dengan Tet10n kemasan
dan selang tembaga t1exible dipompa CHCb tersebut. Sebuah dial-skala
mengukur CHCb. dan CHCl3 dan lapisan berair
dicampur dengan pengaduk udara didorong. Awal IO-tabung
CCD alkaloid mentah dilakukan di 19-1. Guci.
CHCl3 ekstrak terkonsentrasi di satu-efek evaporator
(Presisi Ilmiah I.
Kromatografi kolom pecahan lawan

dilakukan dalam :) x 'TO-cm kolom kaca dilengkapi dengan Teflon yang

kran. Kolom yang dikemas dengan kegiatan Woelm
kelas III alumina netral (50 pertunjukan dari campuran alkaloid).
Semua tahapan pemisahan alkaloid dimonitor oleh
kromatografi lapis tipis (tic) dari Precoated 20 x 20 cm
Silica Gel F-254 piring. 0,25 mm ketebalan (Brinkmann
Instrumen. Inc). Pelat dikembangkan dengan CH30HCHCb
(15:85 v dan bintik-bintik divisualisasikan dengan yodium
uap. Analisis ekstrak dan konsentrat di berbagai
tahap isolasi dibuat dengan ekstraksi umum
Prosedur untuk alkaloid mentah dilaporkan sebelumnya (Powell.
1972).
Pemisahan akhir dari fraksi alkaloid kaya harringtonine. isoharringtonine. dan
homoharringtonine dilakukan di
200-tabung Craig-Post aparat (40 ml dari kedua atas dan
fase yang lebih rendah per Tubel. Kemurnian alkaloid terisolasi adalah
diperiksa oleh spektrometri inframerah dengan Perkin ElmerModel 137 instrumen 0% solusi dalam CHCb) dan oleh nuklir
resonansi magnetik dengan alat Varian HA-Ioo
(CDCb solusi). Prosedur dan Hasil rinci
Ekstraksi Bahan Tanaman. Ekstraksi etanol
bahan tanaman tanah Cephalotaxus dilakukan di
dua batch. Batch pertama terdiri dari 240 kg tanah
pohon atas dan cabang-cabang yang lebih rendah dari daun tanaman dikurangi (
Bagian A): oleh sebagian analisis A berisi 97 g alkaloid.
Bahan tanaman dibagi rata di antara 10
kontainer. dan cukup 95% EtOH 1: 3:.. "3 l / kg pohon)
ditambahkan untuk menutupi itu. Setelah bahan tanaman direndam selama
48 jam. ekstrak EtOH didekantasi dengan pompa dan disaring.

Prosedur ini diulang dua kali tambahan

tetapi dengan 1,6 1. dari EtOH / kg pohon yang diperlukan untuk setiap curam.
Residu dianalisis untuk sisa alkaloid dipulihkan
setelah setiap seduhan dan tiga steeps dihapus sekitar 95% dari
alkaloid diekstrak. The EtOH ekstrak 0210 1.1
digabungkan dan diuapkan sampai volume 14.11.
Bagian pohon B. 215 kg cabang yang lebih rendah dan akar. adalah
diekstraksi sama. Curam pertama diperlukan 3,8 I. dari
EtOH: kg bahan tanaman. Tiga steeps tambahan menggunakan
1,9 1. dari EtOH / kg pohon yang diperlukan untuk hampir lengkap
ekstraksi alkaloid. The EtOH ekstrak 11515
1.1 digabungkan dan terkonsentrasi untuk volume 1: 3,9 1.
Dengan analisis konsentrat. Bagian A berisi ca.
85 g total reco \ "rable alkaloid dan bagian B yang terkandung
ca. 250 g.
Isolasi Alkaloid mentah. EtOH terkonsentrasi
ekstrak bagian pohon A dilarutkan dalam 140 I. 2,5%
larutan asam tartarat berair dan larutan asam adalah
kemudian dengan lembut diaduk bersama-sama dengan: 32 I. dari CHCb. Kuat
pengadukan dihindari untuk mencegah pembentukan emulsi stabil.
Lapisan diizinkan untuk memisahkan selama 1 jam sebelum
fase rendah (CHCI 3) telah dihapus. Tiga ekstraksi chch tambahan dibuat. Proses
ini dihapus
lipid dan lainnya relatif nonpolar netral dan asam
bahan meninggalkan alkaloid dasar dalam air yang
fase. Larutan asam berair kemudian membuat dasar
untuk pH 9,1 dengan penambahan 3,45 I. dari NH40H terkonsentrasi.
Bahan Alkaloidal yang pulih dari solusi dasar
dengan lima 28-1 berturut-turut. CHCl3 ekstraksi. Pengendapan

periode 22 jam yang diperlukan antara setiap ekstraksi.

Ekstrak gabungan CHCl3 'yang melewati No I
"Vhatman kertas filter dan diuapkan sampai volume 1,5 I.
Ekstrak CHCb porsi Sebuah pohon yang terdapat 74 g alkaloid
(87'10 recovery).
Ekstrak etanol dari bagian pohon B dirawat di
cara yang sama dengan Porti \) n A. kecuali bahwa ekstraksi awal
melibatkan empat 28-1. bagian dari CHCI3. Bergabung
CHCb ekstrak terkonsentrasi ke 4.0 I. dan berisi
ca. 253 g campuran alkaloid (ca. pemulihan roO'1o).
Pemisahan awal dari Alkaloid oleh IO-Tube
CCD. Alkaloid gabungan berkonsentrasi dari bagian pohon
A dan B.: 330 g. diencerkan dengan CHCl3 ke 14 I. dan
setengah dari jumlah ini ditempatkan di pertama CCD "tabung"
(Salah satu Guci ro) bersama dengan 7 1. dari: penyangga vlcIlvaine ini.
pH 5 (McIlvaine. 1921). Selama seluruh prosedur. itu
penyangga air adalah fase diam dan CHCb. itu
fase gerak. Buffer dan CHCl3 dicampur secara menyeluruh
oleh agitasi mekanik setelah setiap transfer. lapisan
diizinkan untuk memisahkan. dan lapisan CHCl3 adalah
dipompa ke tabung berikutnya yang lebih tinggi. Setelah sembilan transfer yang
alkaloid yang didistribusikan di seluruh tabung ro. Itu
isi setiap kemudian dibuat dasar. pH 9,0-9,3. dengan
: 364 ml NH40H terkonsentrasi per tabung: isi
setiap diaduk secara menyeluruh: lapisan diizinkan untuk
terpisah: dan chch lapisan ditarik off. Berair
lapisan dicuci dua kali dengan 2 I. dari CHCb. Seluruh The
Proses kemudian digandakan dengan sisa 7 I. dari

konsentrat alkaloid mentah. dan fraksi yang sesuai dari

dua berjalan digabungkan.
Gabungan chch ekstrak dari tabung saya berikan.
setelah penguapan sampai kering. 128,3 g alkaloid. Tabung 2
menghasilkan 47,7 g: tabung: 3. 12,6 g: tabung 4. 12,2 g: tabung 5. 13,4
g: tabung 6. 14,4 g: tabung 7. 18,3 g; tube 8. 22.0 g: tabung 9.
25,8 g: dan tabung 10. 20,7 g alkaloid. Dengan demikian total 315
g alkaloid adalah Reco \ 'ered dari aslinya: 330 g
alkaloid campuran mengalami CCD pemulihan i95'7c).
Hasil dari IO-tabung CCD lebih jelas digambarkan
oleh pelat tic pada Gambar 2. Tabung I dan 2 yang terkandung
hampir cephalotaxine murni i 176 GJ. Harringtonine dan ruang kosong
merupakan campuran dari beberapa alkaloid tidak
dianggap lebih lanjut dalam makalah ini. ; Fraksi ini juga
terkandung sejumlah kecil II dan IV.
homoharringtonine. terpisahkan oleh tle. terkonsentrasi
di tabung: 3 sampai 6 dan ada. tambahan lagi. Resolusi parsial
dari dua alkaloid. Isoharringtonine ditemukan
terutama dalam tabung 6 sampai 9 dengan beberapa tumpang tindih dalam
tabung 5 dan
ro. Campuran beberapa homoerythrina dan alkaloid lainnya
juga hadir dalam tabung 8 sampai 10.
Kolom Kromatografi dari Lawan pecahan.
Pecahan 3 sampai 8 dari 10 tabung CCD masing-masing
dilarutkan dalam minimal benzena-etil eter (4: 1 viv)
dan dikromatografi pada alumina netral untuk mendapatkan lanjut
pengayaan dari alkaloid aktif II-IV. Kolom
dielusi bertahap dengan 1..S I. benzena-etil eter
(4: 1 v / VI 1.5 I. eter 1,5 l:... "Leoh dalam eter 11:19

vivl. dan 1 .. '5 I. dari MeOH dalam eter (1:. 3 vivi Kolom yang
kemudian dicuci dengan 1 l. dari 10% asam asetat berair diikuti
oleh 0 .- '5 l. H20. Fraksi 12.'5 ml setiap dikumpulkan
dan setelah pemeriksaan oleh tic. pecahan yang sesuai adalah
dikombinasikan. Berlawanan fraksi 8 dibagi dan
dikromatografikan dalam dua bagian ll-g terpisah (SA dan
8B). Hasil dari berbagai kolom berjalan dirangkum
pada Tabel 1. Lnder set kondisi kromatografi Pemisahan Alkaloid II. AKU AKU AKU.
dan IV oleh CCD. Pecahan
dari masing-masing kolom run dikumpulkan berdasarkan
Komposisi (Tabel I). Kombinasi lanjut alkaloid
II-IV kemudian dibuat untuk memberikan empat fraksi sebagai berikut: (11
12,03 g (campuran II dan IV); (2) 10.90 g (III dengan kecil
jumlah IV); (3) 11,03 g (jumlah hampir sama II. III.
dan IV): dan (4) 7,35 g (terutama III). Masing-masing fraksi ini
dimurnikan lebih lanjut dengan CCD. Fraksi L di CHCb.
dibagi rata di antara yang pertama 10 tabung dari 200 tabung
Aparat CCD. Kloroform adalah fase diam dan
McIlvaine ini penyangga, pH 5. adalah fase atas (40 ml
setiap fase per tabung). Periode menetap dari 10 menit digunakan
antara transfer. Dalam sistem ini, II bermigrasi menjelang IV.
dan IV bergerak maju dari III. Fraksi 2 dan 3 dibagikan
sama dan setelah setiap distribusi (190 transfer) a
Plot berat diperoleh. Alkaloid diisolasi dengan membuat
isi tabung dasar dengan NH40H dan penggalian
mereka ke CHCb.
Hasil dari tiga distribusi pertama adalah sebagai berikut.
(11 isi gabungan dari tabung 101-134 menghasilkan 6,02 g
IV dan tabung 146-179 memberi 3,88 g II. Beberapa tumpang tindih

hadir dalam tabung 135-145. yang menghasilkan L15 g

mi.xture II dan IV. (2) Tabung 40-70 memberi 7.89 g III
dan tabung 110-140 diberikan 1,48 g IV. Tidak adanya
alkaloid II dalam menjalankan ini ret1ects pemisahan parsial II
dan IV diraih sebelumnya 10-tabung CCD. (3) Tabung
46-75 menghasilkan 0,77 g III dan tabung 91-1: 35 memberi 7.98 g
IV. Campuran II dan IV. 1,34 g. itu pulih dari Distribusi akhir dilakukan pada
sebagian kecil "0
menambahkan untuk itu campuran dari II dan IV yang tersisa dari DLST. 1butio ~
s 1 dan 3. Distribusi sampel akhir ini. 9,84
g. memberi 5.76 g III (tabung 40-70. 1,15 g IV (tabung 116.140).
dan L:. 38 g II (tabung 146-1'701 Sebuah plot berat ini
pemisahan ditunjukkan pada Gambar; 3 sebagai contoh dari pemisahan
dicapai.
Hasil dan persentase total alkaloid dan dimurnikan
alkaloid aktif dari 455 kg kering C. tanaman harringtonia
materi dirangkum dalam Tabel II. Selain ini.
179 g relatif murni aku terisolasi.
Kesimpulan
Atas dasar hasil kami. secara teknis layak untuk
mengisolasi 100-g kuantitas IV baik dengan skala-up proses
diuraikan atau dengan melakukan batch isolasi.
Beberapa ratus gram IV diperlukan untuk awal
uji klinis. Pada Cephalotaxus ini ekstrak tumbuhan yang
satu-satunya sumber praktis IV atau dari berbagai ester aktif