Standar Nasional Indonesia

SNI 01-27821998/Rev.1992

Metoda pengujian susu segar

Berdasarkan usulan dari Departemen Pertanian

standar ini disetujui oleh Badan Standardisasi Nasional
menjadi Standar Nasional Indonesia dengan nomor :
SNI 01-2782-1998/Rev.1992

Penerbitan standar ini dilakukan setelah memperhatikan semua data

dan masukan dari berbagai pihak. Kritik dan saran untuk penyempurnaan standar ini,
dapat disampaikan kepada :

BADAN STANDARDISASI NASIONAL - BSN

Gedung Manggala WanabaktiBlok IV Lantai 4
Badan Standardisasi Nasional - BSN

Jl. Jend. Gatot Subroto, Senayan, Jakarta 10270

Telepon 62 - 21 - 5747043, 5747044 Fax. 62 - 21 - 5747045
E-mail : bsn-std@rad.net.id

PUSAT STANDARDISASI DAN AKREDITASI

BADAN AGRIBISNIS, DEPARTEMEN PERTANIAN
Kantor Pusat Departemen Pertanian Gedung D
Jalan Harsono RM No. 3 Ragunan - Pasar Minggu
Jakarta 12550
Tlp./Fax. (021) 7815880
Edisi 1999

Metoda pengujian susu segar

Pendahuluan
Standar ini merupakan Revisi SNI 01-2782-1992 mengenai Cara Uji Susu Segar
untuk menyempurnakan standar serta metoda pengujian susu segar sehingga
diperoleh adanya keseragaman dalam keakuratan, ketelitian, spesifisitas dan
sensitifitas hasil serta keberulangan yang stabil.
Standar ini disusun sebagai hasil pembahasan Rapat-rapat Teknis, Prakonsensus dan
terakhir dirumuskan dalam Rapat Konsensus Nasional.
Hadir dalam rapat-rapat tersebut wakil-wakil dari lembaga penelitian, perguruan
tinggi, produsen, konsumen dan instansi yang terkait lainnya.
Sebagai acuan Cara Uji Susu Segar ini diambil dari:
1)

AOAC, Official Methods of Analysis (1995)

2)
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food
(1992)
3)

Bundesegestzblatt, Jahrgang (1995)

4)

Hasil - hasil penelitian pengujian

Metoda pengujian susu segar

Uji penetapan berat jenis

Ruang lingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk mengukur berat jenis (B.J) susu segar.

Prinsip

Benda padat yang dicelupkan ke dalam suatu cairan akan mendapatkan tekanan ke
atas seberat volume cairan yang dipindahkan. Berat jenis diukur di antara suhu 20 300C kemudian disesuaikan pada :

BJ.

27,50 76 cm Hg.
27,50

Pereaksi

Tidak diperlukan.

Peralatan

a)
Satu Laktodensimeter yang ditera pada suhu 27,5oC (harus ditera ulang tiap
tahun)
b)

Dua buah gelas piala berukuran 500 ml untuk menghomogenkan susu

c)

Satu tabung besar

d)

Termometer.

1 dari 82

Prosedur pengujian

5.1

Pengukuran B.J dilakukan minimum 3 (tiga) jam setelah pemerahan.

5.2
Homogenkan susu dengan sempurna (dituangkan dari gelas piala satu ke
gelas piala lainnya), kemudian dengan hati-hati dituangkan kedalam tabung tanpa
menimbulkan buih.
5.3
Dengan hati-hati laktodensimeter dicelupkan ke dalam susu dalam tabung
tadi, biarkan timbul dan tunggu sampai diam.
5.4
Baca skala yang ditunjukkan dan angka yang terbaca menunjukkan angka
ke-2 dan ke-3 dibelakang koma, sedangkan desimal ke-4 dikira-kira.
Contoh :
Bila skala yang terbaca adalah 28, maka angka yang didapat adalah 1,0280
5.5
Lakukan pengukuran sebanyak tiga kali berturut-turut, masing-masing
dilakukan setelah membenamkan kembali laktodensimeter.
5.6
Temperatur susu diukur dengan ketelitian 0,5oC dan tandon Hg dari
termometer haruslah berada di dalam susu pada waktu pengukuran dilakukan.

Hasil Uji

Untuk laktodensimeter yang ditera pada 27,50C, bila temperatur susu

adalah 29oC sedangkan skala rata-rata adalah 28 maka yang dicatat adalah :
6.1

BJ.

290 C

76 cm Hg = 1,0280

27,5 C
6.2
Untuk setiap kelebihan atau kekurangan suhu sebesar 10C dilakukan
penyesuaian berat jenis sebesar koefisien muai susu setiap derajat Celcius yakni
0,0002

BJ.

27,50

76 cm Hg

27,5

=
2 dari 82

1,0280 + (29 - 27,5) x 0,0002

=
=

1,0280 + 0,0003
1,0283.

6.3. Bila laktodensimeter yang digunakan ditera pada 150C, maka perhitungan harus
disesuaikan sebagai berikut:

BJ.

27,50

76 cm Hg

1,0280

76 cm Hg

1,0280

15

27,5
BJ.
0,0002
150

BJ.

27,50

1,0280 + 0,003

1,0283

+ (29-27,5) x

76 cm Hg

0
1,0283 x BJ air pada 15 C
BJ air pada 27,50C

76 cm Hg

1,0280

27,50
0

27,5
BJ.
0,0002
150

6.4

1,0280 + 0,003

1,0283

+ (29-27,5) x

Tabel 1 memperlihatkan berat jenis dan volume air pada beberapa suhu.

3 dari 82

Tabel 1
Berat jenis dan volume air pada beberapa suhu
Suhu

BJ

Volume

Suhu

(0C)

BJ

Volume

(0C)

1,000000

1,0000

25

0,997069

1,0029

15

0,999126

1,0009

26

0,996808

1,0032

17,5

0,998710

1,0013

27

0,996538

1,0035

20

0,998229

1,0018

27,5

0,9966538

1,0036

21

0,998017

1,0020

28

0,996258

1,0038

22

0,997795

1,0022

29

0,995969

1,0040

23

0,997663

1,0024

30

0,995672

1,0043

24

0,997321

1,0027

4 dari 82

Pengukuran kadar lemak dengan metoda Gerber

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda pemeriksaan rutin penentuan kadar lemak susu
penuh, susu yang sebagian lemaknya diambil, susu yang tidak dihomogenisasi dan
susu yang dihomogenisasi menggunakan metoda Gerber.

Definisi

Metoda Gerber adalah prosedur empiris untuk menentukan nilai kadar lemak susu
dalam satuan gram lemak per 100 ml susu.

Prinsip

Asam sulfat pekat merombak dan melarutkan kasein dan protein lainnya, sehingga
menyebabkan hilangnya bentuk dispersi lemak. Pemisahan lemak dipercepat dengan
penambahan amil alkohol yang akan mencairkan lemak dengan panas yang
ditimbulkannya. Dengan sentrifugasi akan menyebabkan lemak terkumpul dibagian
skala dari butirometer.

Pereaksi

a)

Asam sulfat (H2SO4) 90 - 91% (BJ pada 200 C = 1.818 + 0,003 g/ml)

Penampakan: tidak berwarna atau lebih terang dari warna kuning pucat serta tidak
mengandung endapan.
b)

Amil alkohol (BJ pada 200 C = 0,811 + 0,002 g/ml)

Penampakan: jernih dan tidak berwarna.

5

Peralatan

a)

Butirometer yang dilengkapi sumbatnya.

b)

Penangas air (650C + 20C).

c)

Sentrifus (1100 + 50 rpm).

5 dari 82

d)

Pipet otomat 1 ml + 0,05 ml (amil alkohol).

e)
Pipet otomat 10 ml (asam sulfat pekat), dapat juga digunakan pipet biasa
yang dilengkapi bola karet (untuk penghisap) pada ujungnya.
f)

Pipet khusus 10,75 ml.

Prosedur

6.1
Metoda ini berlaku untuk 3 jenis susu: susu penuh, susu yang sebagian
lemaknya diambil dan susu yang tidak dihomogenisasi.
6.1.1 Masukkan 10 ml asam sulfat pekat ke dalam butirometer.
6.1.2 Tambahkan 10,75 ml contoh susu dan 1 ml amil alkohol. Urutan dari
pemasukan bahan ke dalam butirometer harus runtut seperti cara di atas.
6.1.3 Butirometer disumbat sampai rapat, kemudian dikocok sehingga bagianbagian di dalamnya tercampur rata.
6.1.4 Setelah terbentuk warna ungu tua sampai kecoklatan (terbentuk karamel),
masukkan butirometer ke dalam sentrifus dan disentrifusi pada 1200 rpm selama 5
menit.
6.1.5 Kemudian masukkan butirometer ke dalam penangas air dengan suhu 650 C
selama 5 menit.
6.1.6 Setelah itu, bacalah skala yang tertera pada butirometer. Skala tersebut
menunjukkan kadar lemak.
6.2

Untuk susu yang dihomogenisasi

6.2.1 Cara pengerjaan contoh sama dengan di atas, hanya setelah pembacaan
skala, butirometer kembali disentrifusi dan dimasukkan ke dalam penangas air (650
C), lalu skala dibaca kembali.
6.2.2

Ulangi cara tersebut sebanyak dua sampai tiga kali.

6.2.3 Apabila perbedaan hasil pembacaan skala antara 2 dan 3, antara 3 dan 4
lebih dari 0.05%, maka pengukuran ini dianggap salah.

Hasil Uji

6 dari 82

Kadar lemak adalah angka yang ditunjukkan oleh skala dinyatakan dalam persen.
Perhitungan kadar bahan kering tanpa lemak (BKTL)

Metoda 01 : Dengan menggunakan Rumus Fleischmann

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk perhitungan kadar bahan kering tanpa lemak
dalam susu segar dengan cepat.

Prinsip

Untuk tujuan ini diperlukan persentase kadar lemak dan berat jenis susu.

BK = 1,311 x L + 2,738 100 (BJ - 1)

BJ
dimana :

BK

Kadar Bahan Kering

Kadar Lemak susu

BJ

Berat Jenis susu

Penetapan Kadar Bahan Kering Tanpa Lemak berdasarkan rumus :

BKTL = BK - L

dimana :

BKTL

Bahan Kering Tanpa Lemak

BK

Kadar Bahan Kering

Kadar Lemak susu.

7 dari 82

Prosedur

3.1
Setelah angka kadar lemak, dan BJ didapatkan, maka angka-angka tersebut
dimasukkan ke dalam rumus, kemudian dihitung secara biasa, atau
3.2

Masukkan angka-angka tersebut kedalam tabel-tabel.

Hasil Uji

Hasil uji Kadar Bahan Kering Tanpa Lemak susu dinyatakan dalam persen (%).

8 dari 82

Tabel 2
Penyesuaian untuk lemak

Lemak

1,31 L

Lemak

1,31 L

Lemak

1,31 L

Lemak

1,31 L

Lemak

1,31 L

1,0

1,31

2,5

3,28

4,0

5,24

5,4

7,07

6,8

8,91

1,1

1,44

2,6

3,41

4,1

5,37

5,5

7,21

6,9

9,04

1,2

1,57

2,7

3,54

4,2

5,50

5,6

7,34

7,0

9,17

1,3

1,70

2,8

3,67

4,3

5,64

5,7

7,47

7,1

9,30

1,4

1,83

2,9

3,80

4,4

5,76

5,8

7,60

7,2

9,43

1,5

1,97

3,0

3,93

4,5

5,90

5,9

7,73

7,3

9,56

1,6

2,10

3,1

4,06

4,6

6,03

6,0

7,86

7,4

9,69

1,7

2,23

3,2

4,19

4,7

6,16

6,1

8,00

7,5

9,83

1,8

2,36

3,3

4,32

4,8

6,29

6,2

8,12

7,6

9,96

1,9

2,49

3,4

4,45

4,9

6,42

6,3

8,25

7,7

10,09

2,0

2,62

3,5

4,59

5,0

6,55

6,4

8,38

7,8

10,22

2,1

2,75

3,6

4,72

5,1

6,68

6,5

8,51

7,9

10,35

2,2

2,88

3,7

4,85

5,2

6,81

6,6

8,65

8,0

10,48

2,3

3,01

3,8

4,98

5,3

6,94

6,7

8,78

9 dari 82

Tabel 3
Penyesuaian untuk BJ

BJ

2,738

100(B-1)

BJ

2,738

100(B-1)

BJ

2,738

100(B-1)
B

1,0220

5,89

1,0270

7,20

1,0320

8,49

1,0225

6,02

1,0275

7,33

1,0325

8,62

1,0230

6,16

1,0280

7,46

1,0330

8,75

1,0235

6,29

1,0285

7,59

1,0335

8,87

1,0240

6,42

1,0290

7,72

1,0340

9,00

1,0245

6,55

1,0295

7,85

1,0345

9,13

1,0250

6,68

1,0300

7,97

1,0350

9,26

1,0255

6,81

1,0305

8,10

1,0355

9,39

1,0260

6,94

1,0310

8,23

1,0360

9,51

1,0265

7,07

1,0315

8,36

Metode 02: Dengan menggunakan metoda pengeringan

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk perhitungan kadar BKTL pada susu segar,
krim, buttermilk dan susu kental tawar (tanpa gula).

Prinsip

Sejumlah contoh susu dikeringkan pada suhu yang tetap (konstan) sampai berat
kering yang konstan tercapai. Berat setelah pengeringan adalah berat bahan kering.

10 dari 82

Peralatan

a)

Timbangan analitik, skala 0:1 mg.

b)

Oven

c)

Eksikator

d)
Cawan dari bahan anti karat (alumunium, nikel, gelas) yang dilengkapi
dengan tutup, mempunyai dasar rata, tinggi sekitar 3 cm dengan garis tengah 6-8 cm.
e)

Penangas air

Prosedur

4.1
Keringkan cawan dan tutupnya dalam oven dengan suhu 102 + 20C
selama 30 menit.
4.2
Setelah itu masukkan cawan beserta tutupnya ke dalam eksikator sampai
suhunya sama dengan suhu kamar, kemudian timbang (G1).
4.3
Masukkan 3 ml contoh susu ke dalam cawan dan timbang kembali beserta
tutupnya (G2).
4.4
Letakkan cawan di atas penangas air (mendidih) selama 30 menit. Untuk
mencegah terbentuknya kulit, teteskan etanol sebanyak 5 - 10 tetes.
4.5
Masukkan kembali cawan ke dalam oven (suhu 102 + 20C) selama 1 jam
dan letakkan tutup cawan disamping cawan.
4.6
Tutup kembali cawan dan masukkan ke dalam eksikator dan biarkan hingga
suhu cawan sama dengan suhu kamar.
4.7

Timbang cawan beserta tutupnya (G3.1.).

4.8
Masukkan kembali cawan ke dalam oven selama 1 jam dan setelah itu
masukkan kembali ke dalam eksikator hingga suhunya sama dengan suhu kamar,
kemudian timbang lagi (G3.2.).
4.9
Lakukan prosedur tersebut sampai tercapai berat konstan (G3.1=G3.2) atau
selisih hasil pengukuran sebelum dan sesudahnya tidak melebihi 0,5 mg.

11 dari 82

Cara Perhitungan

Kadar Bahan Kering (%) = 100 x (G3 - G1)

G2 - G1
Dimana :

G1 = berat cawan dan penutupnya

G2 = berat cawan, penutupnya dan contoh
G3 = berat cawan, penutupnya dan bahan kering

Beda pengukuran ulang susu = 0,05 %.

Hasil Uji

Hasil uji kadar BKTL dinyatakan dalam persen (%).

12 dari 82

Uji protein menurut Kjeldahl

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda penentuan kadar protein susu segar dengan metoda
Kjeldahl.

Prinsip

Pemanasan contoh susu dalam asam sulfat pekat mengakibatkan terjadinya destruksi
protein menjadi unsur-unsurnya. Untuk mempercepat proses destruksi tersebut
sering ditambahkan kalium sulfat bersamaan dengan cupri sulfat (sebagai indikator)
sehingga gugusan N (organik) akan berubah menjadi gugusan amonium sulfat.
Melalui penambahan natrium hidroksida dan pemanasan terjadilah proses destilasi
dimana amonium sulfat akan dipecah menjadi amonia. Selanjutnya amonium yang
dibebaskan akan ditangkap oleh asam borat, sedangkan sisa asam borat yang tidak
bereaksi dengan amonia akan dititrasi dengan asam klorida o,1 N. Selisih jumlah
titrasi contoh dengan blanko merupakan jumlah ekivalen nitrogen.

Pereaksi

a)

Asam sulfat pekat (H2SO4) (BJ 1,84 pada 20o C)

b)

Cupri sulfat (CuSO4.5H2O)

c)

Kalium sulfat (K2SO4)

d)
Larutan natrium hidroksida (NaOH) 33% (500 gram NaOH dilarutkan
dalam 1.000 ml aquades)
e)

Larutan asam klorida (HCl) 0,1 N

f)

Asam borat 4% (40 gram asam borat dilarutkan dalam 1.000 ml aquades)

g)
Larutan indikator Kjeldahl (2 gram methyl red dan 1 gram methylen blue
dilarutkan dalam 1.000 ml etanol 96%).

Peralatan
13 dari 82

a)

Labu Kjeldahl 500 ml

b)

Timbangan skala 0,1 mg

c)

Labu erlenmeyer 500 ml

d)

Buret skala 0,05 ml

e)
Alat pelengkap lain untuk analisa protein (pemanas, alat destilasi, sumbat
penghubung)
f)

Pendingin Liebig

g)

Gelas ukur 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml

h)

Butir gelas, batu didih

Prosedur

5.1
Masukkan ke dalam labu Kjeldahl 5 gram contoh susu, batu didih, 10 gram
K2SO4 dan 0,25 gram CuSO4. Kemudian tambahkan 20 ml H2SO4 dan campur
dengan baik.
5.2.
Panaskan hingga tidak ada uap, teruskan pemanasan sampai mendidih dan
sekali-sekali labu diputar.
5.3.
Setelah cairan dalam labu terlihat jernih dan tak berwarna, teruskan
pemanasan selama 90 menit, kemudian didinginkan.
5.4
Setelah mencapai suhu kamar, tambahkan 150 ml aquades serta beberapa
butir batu gelas, campur dan biarkan hingga dingin.
5.5.
Di dalam erlenmeyer terpisah masukkan 50 ml asam borat, 4 tetes indikator
dan campurkan. Kemudian tempatkan di bawah pendingin (Leibig) sehingga ujung
pipa mengenai asam borat.
5.6.
Melalui dinding, masukkan secara perlahan-lahan dan hati-hati 80 ml larutan
NaOH ke dalam labu Kjeldahl sehingga NaOH tidak tercampur dengan isi dari labu
tersebut.
5.7.
Pasanglah labu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi. Panaskan labu
Kjeldahl, mula-mula secara perlahan-lahan sampai dua lapisan cairan tercampur,
kemudian panaskan dengan cepat sampai mendidih. Atur panasnya sampai terjadi
proses destilasi (waktu pemanasan minimum 20 menit).

14 dari 82

5.8.
Menjelang
berakhirnya proses destilasi letakkan erlenmeyer pada
tempat yang lebih rendah sehingga ujung pipa tidak menyentuh larutan asam borat
lagi.
5.9.
Dinginkan hasil destilasi (destilat) dan jaga agar larutan asam borat tidak turut
panas.
5.10.

Titrasi destilat dengan HCl 0,1 N.

5.11.

Lakukan prosedur diatas terhadap 5 ml aquades sebagai blanko/kontrol.

Cara Penghitungan

Kandungan protein (%) =

1,4 x N x (A - B) x 6,38
C

Keterangan

Normal HCl

Jumlah HCl yang digunakan untuk titrasi

contoh (ml)

Jumlah HCl
blanko (ml)

1,4

berat dari N (secara analitik), ekivalen untuk

1 ml HCl 0,1 N

Berat contoh susu yang digunakan

(gram)

Hasil Uji

Hasil uji kadar protein dinyatakan dalam persen (%).

15 dari 82

yang digunakan untuk titrasi

Uji warna, bau, rasa dan kekentalan

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda uji warna, bau, rasa dan kekentalan pada susu segar
secara organoleptik.

Definisi

Uji organoleptik adalah pengujian warna, bau, rasa dan kekentalan suatu produk
makanan dengan menggunakan indera manusia sebagai alat utama untuk mengetahui
kelainan-kelainan pada produk makanan tersebut.

Prinsip

Susu dapat berubah warna, bau, rasa, dan kekentalannya oleh sebab-sebab di
bawah ini:
3.1

Warna

3.1.1

Menjadi kebiruan bila ditambah dengan air ataupun dikurangi lemaknya.

3.1.2 Menjadi kemerahan bila mengandung darah dari sapi yang menderita
mastitis.
3.2

Bau

Lemak susu amat mudah menyerap bau dari sekitarnya.

3.3

Rasa

3.3.1

Susu menjadi terasa pahit oleh kuman pembentuk pepton.

3.3.2

Susu memiliki rasa lobak disebabkan oleh kuman coli.

3.3.3

Susu memiliki rasa sabun disebabkan oleh Bacillus lactis saponacei.

3.3.4

Susu memiliki rasa tengik disebabkan oleh kuman-kuman asam mentega.

3.3.5

Susu memiliki rasa anyir oleh kuman-kuman tertentu lainnya.

16 dari 82

3.4

Kekentalan

Susu akan berlendir bila terkontaminasi oleh kuman-kuman kokki yang berasal dari
air, sisa makanan atau dari alat-alat susu.

Pereaksi

Tidak diperlukan.

Peralatan

a)

Tabung reaksi

b)

Kertas putih sebagai latar belakang.

Prosedur

6.1.

Uji warna

6.1.1

Masukkan kurang lebih 5 ml susu ke dalam tabung reaksi.

6.1.2

Dengan latar belakang putih amati kelainan pada warna susu.

6.2.

Uji bau

6.2.1 Masukkan ke dalam tabung reaksi kurang lebih 5 ml susu, atau dapat pula
dipakai susu dalam tabung yang telah diuji warnanya pada butir 5.1. di atas,
kemudian dicium baunya.
6.2.2

Dipanaskan sampai mendidih, kemudian dicium baunya lagi.

6.3.

Uji rasa

6.3.1 Untuk pertimbangan kesehatan pemeriksa, maka susu harus dididihkan

dahulu sebelum dilakukan uji rasa.
6.3.2 Tuangkan sejumlah susu di telapak tangan kemudian dicicipi dan rasakan
adanya perubahan rasa susu.
6.4.

Uji kekentalan

17 dari 82

6.4.1

Masukkan kurang lebih 5 ml susu ke dalam tabung reaksi.

6.4.2

Miringkan tabung, kemudian tegakkan kembali.

6.4.3 Pada saat menegakkan tabung kembali perhatikan bagian susu yang
membasahi dinding terhadap kecepatan turunnya susu serta adanya butiran, lendir
dan sebagainya.

Hasil uji

Susu dianggap baik bila tidak dijumpai perubahan atau penyimpangan dalam warna,
bau, rasa maupun kekentalannya.

18 dari 82

Uji titrasi keasaman Soxhlet Henkel

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda pengukuran derajat asam susu dengan cara titrasi.

Definisi

Yang dimaksud dengan derajat asam Soxhlet Henkel adalah jumlah ml NaOH 0,25
N yang diperlukan untuk menetralisasi asam yang berada dalam 100 ml susu dengan
phenolphthalein sebagai indikator.

Pereaksi

a)

Larutan 0,25 N NaOH.

b)
Larutan Phenolphthalein 2% (2 g phenolphtalein dilarutkan dalam 100 ml
ethanol 96%).
c).

Larutan Cobalt Sulfat (5 gram CoSO4. 7H2O, dilarutkan dalam aquadest

sampai 100 ml) sebagai zat warna standar (kontrol) untuk memastikan bahwa reaksi
pengikatan asam dalam susu oleh NaOH telah mencapai titik netral.

Peralatan

a)

Buret dengan skala 0,05 - 0,1 ml.

b)

Dua buah labu erlenmeyer 50 ml.

c)

Pipet berskala.

Prosedur

5.1.

Ke dalam labu erlenmeyer masing-masing diisikan 50 ml susu.

5.2.

Tambahkan 2 ml phenolphthalein.

5.3.
Salah satu dari labu erlenmeyer tersebut dititrasi dengan larutan 0,25 N
NaOH hingga terbentuk warna merah muda yang tetap bila dikocok.
19 dari 82

5.4.
Sebagai warna pembanding, susu di dalam labu erlenmeyer kedua ditambah
dengan 1 ml larutan cobalt sulfat (CoSO4. 7H2O). Warna standar ini hanya dapat
dipakai maksimum 3 jam. Setelah 3 jam harus diganti yang baru.

Cara Penghitungan

Derajat Soxhlet (0SH) adalah jumlah 0,25 N NaOH yang digunakan dikalikan nilai
dua. Misalnya dalam titrasi diperlukan 3,5 cc 0,25 N NaOH untuk menetralkan 50
ml susu, maka derajat keasamannya adalah:

3,5 x 100 ml = 70 SH
50ml

Hasil Uji

Hasil uji titrasi keasaman susu segar dinyatakan dalam derajat Soxhlet (0SH).

20 dari 82

Uji alkohol

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk memeriksa dengan cepat derajat keasaman
susu segar.

Prinsip

Kestabilan sifat koloidal protein-protein susu tergantung pada selubung air yang
menyelimutinya. Hal ini terutama pada kasein. Bila susu dicampur dengan alkohol
yang mempunyai sifat dehidrasi maka protein tersebut akan terkoagulasi sehingga
susu tersebut akan pecah. Semakin tinggi derajat keasaman susu yang diperiksa,
maka akan semakin rendah jumlah alkohol dengan kepekatan tertentu yang
diperlukan untuk memecahkan susu dengan volume yang sama. Percobaan mulai
positif pada derajat asam 8 - 90 SH.

Pereaksi

Alkohol 70% (tambahkan 74 ml alkohol 96% dengan 26 ml aquadest)

Peralatan

a)

Tabung reaksi.

b)

Gelas ukur 10 ml.

Prosedur

5.1.

Masukkan 5 ml susu ke dalam tabung reaksi.

5.2.

Tambahkan alkohol 70% dalam jumlah yang sama.

5.3.
susu.

Amati terhadap adanya gumpalan dan atau pemisahan bagian-bagian protein

21 dari 82

Hasil uji

Adanya butiran atau gumpalan susu menunjukkan reaksi positif.

22 dari 82

Uji katalase

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk menentukan adanya sel-sel radang (leukosit),
kuman dan adanya bahan organis seperti santan di dalam susu segar.

Prinsip

Di dalam susu terdapat enzim katalase yang dibentuk oleh sel-sel leukosit, kumankuman, reruntuhan sel ambing dan zat organis yang membebaskan oksigen (O2) dari
larutan peroksidanya (H2O2).

Pereaksi

Larutan H2O2 0,5 % (larutkan 1 ml H202 35% dengan 69 ml aquadest).

Peralatan

a)

Pipet steril 5 , 10 ml

b)

Tabung katalase

c)

Inkubator dengan suhu 37oC.

Prosedur

5.1.

Isi tabung katalase steril dengan 10 ml susu.

5.2.

Tambahkan 5 ml larutan H2O2 0,5 % ke dalamnya.

5.3.
Aduk dengan cara membalik-balikkan tabung, kemudian tempatkan
campuran susu tersebut di bagian tabung yang vertikal dan berskala dan jaga agar
jangan ada gelembung udara di puncaknya.
5.4.
C.

Sumbat tabung dengan kapas, kemudian masukkan ke dalam inkubator 370

23 dari 82

5.5.

Tetapkan volume gas O2 yang terkumpul di dalam puncak tabung setelah 3

jam.

Hasil Uji

Angka katalase adalah jumlah cc gas oksigen yang terkumpul di dalam puncak
tabung. Angka katalase maksimum adalah 3,0.

24 dari 82

Penentuan titik beku

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda penentuan titik beku susu segar untuk mengetahui
kemungkinan adanya pemalsuan susu dengan air.

Prinsip

Kenaikan atau penurunan titik beku susu adalah selisih antara titik beku air dengan
standar titik beku susu. Kenaikan titik beku menyatakan adanya indikasi
penambahan air, sedangkan penurunan titik beku menyatakan adanya indikasi
penambahan susu bubuk atau tepung.

Pereaksi

4.1.
Cairan pendingin dengan suhu kira-kira -40 C yang terbuat dari 2 gr NaCl
yang telah ditumbuk halus di dalam 200 cc air dan kemudian dimasukkan
kedalamnya 400 gr es.

Peralatan

a)
Kryoskop yang dilengkapi thermometer Beckmann dengan pembagian skala
hingga 0,0010 C.
b)

Tabung gelas yang kedua ujungnya terbuka.

c)

Tabung reaksi yang berdiameter 2,5 cm.

d)

Tabung reaksi berdiameter 5 cm.

e)

Bak cairan pendingin.

f)
Batang pengaduk terbuat dari logam yang tidak bereaksi terhadap susu,
berdiameter antara 1 - 1,5 mm.

25 dari 82

Prosedur

6.1
Dalam tabung reaksi berdiameter 2,5 cm dimasukkan 30 cc aquadestilata
yang telah dimasak dan didinginkan, kemudian tabung disumbat dengan gabus yang
mempunyai dua lubang.
6.2
Pada lubang pertama masukkan/tanamkan kristal es dan aduk cairan dengan
alat pengaduk, sedang lubang yang satu lagi dimasukkan thermometer Beckmann
dengan ujungnya tepat berada di pertengahan cairan.
6.3
Masukkan tabung ini ke dalam cairan pendingin berisolasi dengan suhu -2
sampai -60 C sambil diaduk terus secara teratur dan perlahan-lahan sampai suhu
dalam tabung mencapai 10 C dibawah titik beku air.
6.4
Masukkan tabung ke dalam tabung reaksi berdiameter 5 cm sehingga mantel
pendingin dan tabung pembeku tidak bersentuhan.
6.5
Kemudian masukkan keduanya ke dalam cairan pendingin kembali dimana
cairan pendingin harus kira-kira 4 cm lebih tinggi dari permukaan air di dalam tabung
pertama.
6.6
Ke dalam cairan pendingin dimasukkan kristal es murni kecil dan diaduk
secara merata. Penaikan tiang raksa harus diperhatikan hingga kira-kira selama 1
menit tiang raksa tidak bergerak lagi.
6.7
Bila hal ini sudah tercapai, ketuk thermometer perlahan-lahan dan tingginya
tiang air raksa diperiksa dengan loupe hingga 0,0010 C. Bila es yang terbentuk sudah
meleleh lagi, ulangi lagi cara kerja ini dengan catatan perbedaannya tidak boleh lebih
dari 0,0050 C.
6.8
Dengan cara yang serupa dilakukan perlakuan terhadap 30 cc susu. Akan
tetapi cairan hanya didinginkan sampai 1,50 C dibawah titik beku air dan yang
dimasukkan/ditanamkan adalah sepotong kecil susu beku. Perbedaan antara dua kali
penentuan tidak boleh lebih dari 0,0050 C.
6.9
Bila menggunakan thermometer yang tidak ditera lebih dahulu, hendaknya
dengan thermometer ini kita menentukan titik beku larutan 10 gr NaCl murni dalam 1
liter air, dimana titik ini harus -0,6030 C.

Hasil uji

26 dari 82

Hasil uji titik beku susu dinyatakan dalam derajat Celcius (0 C). Titik beku susu yang
memenuhi syarat mutu adalah -0,5200 C sampai -0,5600 C.

27 dari 82

Pengukuran angka refraksi metoda Ackermann

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk mengetahui kemungkinan adanya

penyimpangan terhadap susu.

Prinsip

Angka refraksi ditetapkan dari serum kalsium khlorida (CaCl2) susu yang
disesuaikan pada suhu 27,5o C, dan dihitung angka refraksinya.

Pereaksi

Serum CaCl2 20% (20 gr CaCl2 dilarutkan dalam 100 ml aquades) dengan BJ =
1,1375.
Bila larutan CaCl2 diencerkan dengan aquades (1:10) pada suhu 17,50C, maka
refraktometer harus menunjukkan angka 26.

Peralatan

a)

Refraktometer celup (Zeiss)

b)

Penangas air

c)

Corong

d)

Kertas saring

e)
Labu Erlenmeyer 50 ml/100 ml dilengkapi sumbat karet dengan pipa gelas
yang panjangnya + 22 cm.

Prosedur

5.1.

Masukkan 30 ml contoh susu ke dalam labu Erlenmeyer.

28 dari 82

5.2.

Tambahkan 0,25 ml larutan CaCl2 20%.

5.3.
Labu Erlenmeyer disumbat dengan sumbat yang dilengkapi gelas untuk
menghindari kehilangan cairan akibat penguapan.
5.4.

Letakkan labu Erlenmeyer dalam penangas air (mendidih) selama 15 menit.

5.5.

Dinginkan sampai terlihat ada pemisahan serum dengan endapan.

5.6.

Pisahkan serum dengan endapan melalui saringan.

5.7.

Serum dituang ke dalam cuvet sampai batas yang tertera.

5.8.
Celupkan refraktometer ke dalam cuvet dan baca skala yang tertera. Setelah
itu ukur suhu serum tersebut dengan termometer.
5.9.
Koreksi suhu serum yang didapat ke 27,50 C yang merupakan rata-rata suhu
kamar di Indonesia (Tabel 4).

Cara pengukuran

Cara pengukuran angka refraksi adalah seperti contoh di bawah ini:

Jika pada suhu 30o C didapatkan angka 18,0, maka kalau dikembalikan
pada 27,5o C akan menjadi : 18,0 + 0,75 = 18,75.
6.1

Jika pada suhu 20o C didapatkan angka 45,0, maka kalau dikembalikan
pada 27,5o C akan menjadi : 45,0 - 2,55 = 42,45.
6.2

29 dari 82

Tabel 4
Tabel Koreksi Untuk Pembacaan Refraktometer yang dicelupkan pada suhu
antara 20o C - 30o C terhadap suhu koreksi 27,5o C

12,55

17,6

22,5

27,35

32,2

37,1

41,9

46,7

300

+0,75

+0,75

+0,75

+0,75

+0,75

+0,75

+0,80

+0,80

290

+0,40

+0,40

+0,45

+0,45

+0,45

+0,45

+0,45

+0,45

280

+0,10

+0,10

+0,15

+0,15

+0,15

+0,15

+0,15

+0,15

27,50

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

270

-0,15

-0,15

-0,15

-0,15

-0,15

-0,15

-0,15

-0,15

260

-0,45

-0,45

-0,45

-0,45

-0,45

-0,45

-0,50

-0,50

250

-0,70

-0,70

-0,70

-0,75

-0,75

-0,75

-0,85

-0,55

240

-0,90

-0,95

-0,95

-1,05

-1,05

-1,05

-1,15

-1,20

230

-1,20

-1,20

-1,20

-1,30

-1,35

-1,35

-1,45

-1,55

220

-1,45

-1,45

-1,45

-1,55

-1,65

-1,65

-1,80

-1,0

210

-1,65

-1,65

-1,70

-1,80

-1,90

-1,95

-2,05

-2,25

200

-1,90

-1,90

-1,95

-2,05

-2,15

-2,25

-2,35

-2,55

30 dari 82

Uji reduktase

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk menentukan adanya kuman-kuman di dalam

susu segar dalam waktu cepat dengan menggunakan pereaksi warna indikator.

Prinsip

Di dalam susu segar terdapat enzim reduktase yang dibentuk oleh kuman yang
mereduksi zat warna indikator menjadi larutan yang tidak berwarna.

Metoda 01 : Uji reduksi biru metilen (Methylen blue reduction test)

Pereaksi

Larutan biru metilen yang dibuat dengan cara :

a)

Masukkan 10 mg methylen blue DAB7 ke dalam labu erlenmeyer steril.

b)

Tambahkan 100 ml aquades steril.

c)
Campur dengan baik dan simpan dalam temperatur 4-80 C dan terlindung
dari cahaya. Larutan ini dapat bertahan selama 4 minggu.

Peralatan

a)

Pipet steril 1, 25 ml.

b)
Tabung reduktase dengan batas melingkar pada 21 ml dilengkapi penyumbat
karet atau parafin untuk mencegah terjadinya reaksi oksidasi.
c)

Labu erlenmeyer.

d)

Inkubator atau penangas air dengan suhu 37o C yang terlindung dari cahaya.

Prosedur
31 dari 82

5.1.

Masukkan ke dalam tabung reduktase steril 1 ml larutan biru metilen.

5.2.

Tambahkan contoh susu sampai batas lingkar.

5.3.
Tutup tabung tersebut dengan sumbat, lalu campurkan biru metilen dengan
contoh susu dengan cara membolak-balikkan tabung (+ 3 kali) sampai warna biru
tersebar merata.
5.4.
Masukkan tabung ke dalam penangas air (37 + 10 C) selama 4 - 4,5 jam.
Letakkan penangas air di tempat yang terlindung dari cahaya. Bila menggunakan
inkubator, masukkan dulu tabung dalam penangas air (37 + 10 C) selama 5 menit
untuk menghangatkan baru dimasukkan ke dalam inkubator.

Cara Membaca Hasil

Pembacaan hasil dapat dimulai minimal setelah 2/3 dari warna sudah berubah
menjadi putih. Sebaiknya reaksi ditunggu sampai seluruh warna biru hilang.

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dalam satuan waktu, dimana waktu reduksi (angka reduktase)
menunjukkan waktu yang dibutuhkan sejak saat memasukkan tabung kedalam
inkubator/penangas air bersuhu 37o C sampai seluruh warna biru hilang.

32 dari 82

Tabel 5
Kualitas susu segar berdasarkan lamanya waktu reduksi

Waktu Reduksi

Kualitas Susu

0 menit - 20 menit

Jelek

20 menit - 2 jam

Kelas III

2 jam - 4,5 jam

Kelas II

4,5 jam - 5,5 jam

Kelas I

lebih dari 6 jam

Susu dicurigai telah mengalami perlakuan (dididihkan,

ditambah atau mengandung antibiotika, ditambah
desinfektan).

33 dari 82

Metoda 02 : Uji resazurin

Pereaksi

Larutan resazurin yang dibuat dengan cara :

1.1

Masukkan 1 ampul resazurin (Fa. Retorte) ke dalam labu erlenmeyer steril.

1.2
Larutkan dengan air panas, kemudian dengan aquades bersuhu 600 C.
Setiap ampul dapat dilarutkan dengan 250, 500 atau 1000 ml.
1.3
Larutan disimpan dalam tempat yang terlindung dari cahaya. Pembuatan
larutan jangan lebih dari 3 jam sebelum pemeriksaan dilaksanakan.

Peralatan

a)

Tabung reduktasi dengan batas lingkar 11 ml steril.

Sterilisasi tabung tidak boleh lebih dari 48 jam sebelum uji dilaksanakan.
b)

Sumbat karet steril.

Sterilisasi sumbat karet dilakukan dalam autoklaf selama 10 menit atau dalam air
mendidih selama 0,5 jam.
c)

Pipet steril 1, 10 ml

d)

Inkubator atau penangas air dengan suhu 37 + 1o C.

e)

Kartu standar warna.

Prosedur

3.1
Masukkan 1 ml zat warna dalam tabung reduktasi steril dan tambahkan 10
ml susu.
3.2

Tutuplah tabung dengan sumbat karet dan dibolak-balik minimal 3 kali.

3.3
Masukkan tabung ke dalam penangas air (37 + 10 C) selama 1 jam. Bila
akan menggunakan inkubator, maka tabung terlebih dahulu harus dimasukkan ke
dalam penangas air (37 + 10 C) selama 5 menit kemudian dimasukkan ke dalam
inkubator selama 55 menit.
34 dari 82

3.4
Pembacaan dapat dilakukan 1 jam setelah tabung reduktase tadi dikeluarkan
dari penangas air atau inkubator dan sebelum pembacaan dimulai hendaknya tabung
dimiringkan atau dibalikkan dahulu 1 kali.

Hasil uji

Cocokkan warna yang terbentuk dengan standar warna yang tersedia setelah lewat
waktu yang ditetapkan.

35 dari 82

Uji sedimen

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk mengetahui adanya kemungkinan penanganan

susu yang tidak higienis.

Prinsip

Kadar sedimen susu ditentukan dengan cara memusingkan susu dengan kecepatan
tinggi.

Pereaksi

Tidak diperlukan

Peralatan

a)

Tabung sentrifus Tromsdorf.

b)

Sentrifus dengan kecepatan 3000 rpm/menit.

Prosedur

5.1

Susu yang belum disaring dipanaskan hingga 60o C selama 5 menit.

5.2
Isi tabung Tromsdorf dengan susu yang telah dipanaskan tadi sampai garis
10 ml.
5.3

Susu tersebut disentrifusi selama 10 menit dengan putaran 3000 rpm/ menit.

5.4

Tabung dikosongkan dan dicuci dengan aquades steril.

5.5
Letakkan tabung terbalik diatas rak untuk beberapa waktu kemudian kadar
sedimen dibaca.
6

Hasil Uji

Hasil uji sedimen dinayatakan dalam persen (%).

36 dari 82

Pengujian cemaran mikroba

Pendahuluan

Pengujian cemaran mikroba dalam susu segar adalah bertujuan sebagai indikator
sanitasi dalam roses produksi atau penanganan susu serta sebagai indikator
kesehatan dan keamanan susu.
Berbagai macam uji mikrobiologi dapat dilakukan, meliputi uji kuantitatif mikroba
untuk menentukan kualitas, uji kualitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat
keamanannya, serta uji bakteri indikator untuk menentukan tingkat sanitasi susu
tersebut.

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda pengujian kuantitatif

Peralatan Umum

Catatan: Seluruh peralatan yang mengalami kontak langsung dengan contoh susu
yang diuji, pelarut maupun media biakan harus steril.
a)

Pipet yang disumbat dengan kapas dengan ukuran 1 ml, 5 ml atau 10 ml.

b)

Cawan petri, terbuat dari gelas atau plastik, berdiameter 90 - 100 mm.

c)

Tabung reaksi dengan kapasitas 20, 50 ml.

d)

Labu erlenmeyer.

e)

Inkubator.

f)

Pembakar Bunsen.

g)

Penangas air.

h)

Tube shaker/pengocok mekanis.

i)

Rak tabung reaksi.

j)

Penghitung koloni atau Hand Tally Counter.

37 dari 82

k)

Ose.

l)

Timbangan

m)

Spreader dari batang gelas/logam bengkok (hockey stick, spatel)

01- Penentuan Angka Lempeng Total pada 350C

Prinsip

Angka lempeng total (Total Plate Count) dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah
mikroorganisma yang terdapat dalam susu dengan metoda hitungan cawan.
Jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel
mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat
langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.

Media

Plate Count Agar (Standard Method Agar).

Prosedur

Umum : selama pengerjaan penuangan, beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah
sebagai berikut:
a)
Jaga agar tutup cawan tetap berada pada tempatnya kecuali pada saat akan
menambahkan larutan contoh atau media PCA tutup cawan jangan dibuka terlalu
lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar.
b)
Jarak waktu antara memipet larutan contoh hingga penuangan media PCA
ke cawan petri dilakukan dalam waktu tidak lebih dari 10 menit.
c)
Waktu antara dimulainya pengenceran sampai penuangan media pada cawan
petri terakhir tidak boleh lebih dari 20 menit.
d)
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi silang, maka semua pekerjaan
dilakukan di dekat nyala api Bunsen dan mulut segala bejana harus disterilkan
sebelumnya dengan nyala api Bunsen.

38 dari 82

3.1

Pemupukan dan penuangan media pada cawan

3.1.1

Siapkan contoh susu secara aseptis.

3.1.2 Lakukan pengenceran contoh susu secara desimal (menjadi pengenceran

1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya).
3.1.3 Letakkan labu erlenmeyer secara berderet dan masing-masing diberi tanda
1:10, 1:100, 1:1.000, dan seterusnya serta 1 (satu) labu erlenmeyer lainnya dengan
tanda K (Kontrol).
3.1.4 Deretkan pula cawan petri di depan labu erlenmeyer seperti dimaksud pada
butir 3.1.3 disesuaikan dengan pengencerannya. Untuk meningkatkan ketepatan
pengujian, sebaiknya pemupukan dilakukan secara duplo. Dengan mengetahui
sejarah contoh susu serta berdasarkan pengalaman, maka cemaran mikroba dalam
susu dapat diperkirakan jumlahnya secara kasar, sehingga pemupukan pada cawan
petri dapat diambil dari 3 atau 4 konsentrasi tertentu yang berurutan.
3.1.5 Bila diharapkan jumlah cemaran susu adalah 105, maka contoh susu
dikocok dengan shaker/pengocok mekanis dan dengan menggunakan pipet steril
pindahkan 0,1 ml ke dalam cawan petri bertanda 10-1 dan sebanyak 1 ml ke dalam
Buffered Peptone Water 0,1% dalam labu erlenmeyer I bertanda 1 : 10.
3.1.6

Kocok labu erlenmeyer (I) ini dengan shaker/pengocok mekanis, kemudian

dengan pipet steril dipindahkan 0,1 ml ke dalam cawan petri bertanda 10-2, dan 1
ml ke dalam labu Erlenmeyer II bertanda 1:100.
3.1.7

Lakukan prosedur yang sama untuk mempersiapkan pemupukan selanjutnya.

3.1.8 Dengan pipet steril, pindahkan 1 ml Buffered Peptone Water dari labu
Erlenmeyer bertanda K ke dalam cawan petri bertanda K.
3.1.9 Sementara itu tabung reaksi yang berisi 12 - 15 ml PCA dipanaskan dalam
penangas air sampai mencair, kemudian didinginkan sampai suhunya mencapai 40 50oC.
3.1.10 Tuangkan tiap 12 - 15 ml PCA tadi ke masing-masing cawan petri yang
sudah berisi larutan contoh.
3.1.11 Supaya larutan contoh dan media PCA dapat tercampur dengan baik, maka
lakukan gerakan searah gerakan jarum jam yang dilanjutkan dengan gerakan
berlawanan dengan arah jarum jam, atau dengan gerakan seperti angka delapan,
masing-masing sebanyak 5 kali. Selama pencampuran, jaga jangan sampai tutup
39 dari 82

cawan terkena campuran larutan contoh dan media tersebut. Biarkan cawan-cawan
tersebut pada posisi horisontal sampai mengeras.
3.2.

Inkubasi

3.2.1

Segera setelah media mengeras, cawan-cawan petri tersebut dibalik hingga

posisi tutupnya berada di bawah, dan masukkan ke dalam inkubator 35oC selama
48 jam
3.2.2 Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu
penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur
bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.

Penghitungan koloni

4.1
Pilihlah cawan yang ditumbuhi oleh koloni yang jumlahnya antara 25 - 250.
Bila cawan dari tingkat pengenceran berbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran
tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang lebih banyak.
4.2
Gunakanlah tally counter untuk menghitung koloni, dan berilah tanda koloni
yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan ulang.
4.3
Bila ada koloni yang menyebar, maka dihitung sebagai satu koloni. Akan
tetapi bila lebih dari 25% koloni yang tumbuh pada suatu cawan adalah koloni yang
menyebar, maka cawan tersebut tidak perlu dihitung.

Interpretasi Hasil/Perhitungan

Jumlah koloni per ml susu dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni dari
pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran
Contoh:
Misalnya, jika setelah diinkubasi diperoleh 60 dan 64 koloni pada masing-masing
cawan duplo yang mengandung pengenceran 10-4, maka jumlah koloni dapat
dihitung sebagai berikut (1 ml larutan pengencer dianggap mempunyai berat 1 gram):
Faktor pengenceran

Pengenceran x Jumlah yang ditumbuhkan

10-4 x 1,0

10-4
40 dari 82

Jumlah koloni =

Jumlah koloni x 1/faktor pengenceran per cawan

(60 + 64)/2 x 1/10-4

6.2 x 105

Pelaporan

6.1
Untuk melaporkan hasil analisa mikrobiologi digunakan suatu standar yang
disebut Standard Plate Count (SPC) dengan satuan colony-forming units (CFU)
per mililiter atau per gram, dan hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka,
yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua di belakang koma. Jika angka
yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, maka dilakukan pembulatan satu
angka lebih tinggi dari angka kedua.
6.2
Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan angka
kurang dari 25 koloni, maka hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah yang
dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 25 dikalikan dengan besarnya
pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.

Jumlah koloni
pengenceran

per

SPC

10-2

10-3

10-4

16

Keterangan

< 2,5 x 103

Hitung pengenceran

(1,6 x 103

10-2

6.3
Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan lebih
dari 250 koloni, maka hanya jumlah koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung,
misalnya dengan cara menghitung jumlahnya pada 1/4 bagian cawan petri, kemudian
hasilnya dikalikan empat. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 250 dikalikan
dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan
dalam tanda kurung.

41 dari 82

Jumlah koloni
pengenceran

per

SPC

10-2

10-3

10-4

TBUD*)

TBUD

355

TBUD

325

Keterangan

20

< 2,5 x 106

Hitung pengenceran

(1,6 x 106

10-4

< 2,5 x 105

Hitung pengenceran

(1,6 x 105

10-3

*) TBUD = Terlalu banyak untuk dihitung

6.4
Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, maka data yang
diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh hanya dari salah satunya,
meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut.

Hasil Uji

Jumlah koloni yang diperoleh dinyatakan dengan Colony Forming Units (CFU) per
ml.

02- Penghitungan Coliform dan Escherichia coli

Prinsip

Kristal violet dan garam empedu yang ada di media akan menghambat bakteri Gram
positif lainnya sehingga hanya organisme coliform yang tumbuh. Selama
pertumbuhannya, coliform akan mengubah laktosa menjadi asam dan perubahan ini
akan dideteksi oleh indikator neutral red yang akan berubah warnanya menjadi
merah. Selain itu keadaan asam akan menyebabkan presipitasi asam empedu.

42 dari 82

Media, pereaksi dan kuman uji

a)

Peptone Water (PW) 0,1%

b)

Violet Red Bile Agar (VRBA)

c)

Violet Red Bile Dextrose Agar (VRBDA)

d)

Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB)

e)

Lauryl tryptose (LST) broth

f)

EC broth

g)

Levine's eosin-methylene blue (L-EMB) agar

h)

Tryptone (tryptophane) broth

i)

MR-VP broth

j)

Koser's citrate broth

k)

Plate count agar (PCA) (standard method)

l)

Reagen Kovac

m)

Reagent Voges-Proskaeur (VP)

Peralatan

a)

Tabung reaksi berkapasitas 20 ml dilengkapi tabung Durham

Prosedur

4.1.

Penghitungan Jumlah Presumtif Coliform Dengan Metoda Hitungan Cawan

4.1.1 Lakukan pengenceran contoh secara desimal seperti metoda hitungan

cawan. Untuk pengenceran pertama dianjurkan mengambil 25 ml contoh yang
dimasukkan ke dalam 225 ml larutan PW 0,1% steril.
4.1.2 Masukkan 0,1 ml atau 1,0 ml contoh ke dalam cawan petri steril. Pengujian
sebaiknya dilakukan secara duplo. Kemudian tuangkan 10 - 15 ml media VRBA
(suhu antara 45 - 480C). Supaya larutan contoh dan media agar dapat tercampur
43 dari 82

dengan baik, maka putarlah cawan dengan gerakan searah gerakan jarum jam yang
dilanjutkan dengan gerakan berlawanan dengan arah jarum jam, atau dengan gerakan
seperti angka delapan, masing-masing sebanyak 5 kali. Selama pencampuran, jaga
jangan sampai tutup cawan terkena campuran larutan contoh dan media tersebut.
4.1.3 Setelah memadat tuangkan kembali 3-4 ml VRBA cair (overlay) di atas
permukaan agar.
4.1.4 Segera setelah media mengeras, cawan-cawan petri tersebut dibalik hingga
posisi tutupnya berada di bawah, dan masukkan ke dalam inkubator 350C selama
18-24 jam.
4.1.5 Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu
penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur
bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.
4.1.6 Hitung semua koloni berwarna merah keunguan yang dikelilingi zona merah
(diameter koloni pada umumnya 0,5 mm atau lebih). Pilihlah cawan yang ditumbuhi
oleh koloni yang jumlahnya antara 25 - 250. Bila cawan dari tingkat pengenceran
berbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan
dengan koloni yang lebih banyak. Gunakanlah tally counter untuk menghitung
koloni, dan berilah tanda koloni yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan
ulang.
4.1.7 Hasil yang diperoleh adalah jumlah presumtif coliform per ml/gram contoh.
Untuk mendapatkan jumlah coliform sebenarnya perlu dilanjutkan ke uji konfirmasi
coliform.

4.2

Konfirmasi Coliform

4.2.1 Pilihlah koloni-koloni yang mewakili semua jenis koloni yang tumbuh.
Ambillah 10 koloni dengan ose steril, dan pindahkan masing-masing ke dalam 10 ml
BGLBB steril dalam tabung-tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung
durham.
4.2.2 Inkubasikan tabung-tabung reaksi tersebut pada suhu 350C selama 24-48
jam, amati terbentuknya gas dalam tabung durham sebagai reaksi positif.
4.2.3 Hitunglah tabung yang berisi gas. Untuk meyakinkan pertumbuhan coliform,
buatlah preparat ulas dari tabung positif yang diwarnai pewarnaan Gram.

44 dari 82

4.3

Interpretasi Hasil

Tabung positif (%) =

Jumlah tabung positif

x 100 %

10

Jumlah coliform per ml/gram = % tabung positif x jumlah (seluruh) koloni dalam
cawan petri x faktor pengenceran cawan petri tersebut.

4.4
Uji konfirmasi Escherichia coli dengan metoda the Most Probable
Number (MPN)
4.4.1 Siapkan beberapa seri (seri 3 atau 5) tabung yang berisi EC broth yang
dilengkapi dengan tabung Durham.
4.4.2 Pilihlah tabung BGLB positif sedikitnya dari tiga pengenceran yang
berurutan. Goyangkan secara hati-hati tabung positif tersebut dan dengan ose steril
pindahkan suspensi ke masing-masing seri tabung reaksi berisi EC broth, disesuaikan
dengan pengencerannya.
4.4.3 Inkubasikan tabung rekasi tersebut pada suhu 45,50C selama 48 jam. Amati
terbentuknya gas sebagai reaksi positif setelah diinkubasikan selama 24 jam. Bila
belum terbentuk gas, inkubasi dilanjutkan dan amati reaksi positif pada 48 jam.
4.4.4 Jumlah tabung yang positif dari masing-masing seri dicocokkan dengan tabel
statistik untuk mengetahui jumlah fecal coliform, dan dinyatakan dengan MPN per
unit sampel.
4.4.5 Dengan ose steril pindahkan suspensi dari masing-masing tabung positif ke
Levine's eosin-methylen blue (L-EMB) agar dan goreskan ke permukaan agar
beberapa kali agar dapat diperoleh koloni tunggal. Inkubasikan cawan pada suhu
350C selama 18-24 jam dan amati adanya koloni berwarna gelap dan datar dengan
atau tanpa warna metal.
4.4.6 Pindahkan 2 koloni yang dicurigai dari tiap cawan L-EMB ke agar miring
PCA untuk pengujian morfologi dan biokimia, kemudian inkubasikanh pada suhu
350C selama 18-24 jam.

45 dari 82

4.4.7 Lakukan pewarnaan Gram, amati adanya bakteri coccus atau cocoid, Gram
negatif. Uji konfirmasi E. coli dilanjutkan ke uji biokimia IMViC (Indol-Voges
Proskauer-Methyl red-Citrat) sebagai berikut:
a)

Produksi Indole.

Inokulasi tabung berisi tryptone broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 24
jam. Tambahkan 0,2 - 0,3 reagent Kovacs untuk menguji adanya pembentukan
indole yang ditunjukkan dengan adanya warna merah yang jelas di bagian atas.
b)

Voges-Proskauer.

Inokulasi tabung berisi MRVP broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 48
jam. Pindahkan 1 ml suspensi ke dalam tabung berukuran 13 x 100 mm. Tambahkan
0,6 larutan alpha-naphthol dan 0,2 ml KOH 40%, kemudian kocok. Setelah itu
tambahkan beberapa kristal kreatin, kocok lagi dan diamkan selama 2 jam. Uji
positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna pink eosin.
c)

Methyl red.

Setelah test VP, inkubasikan lagi tabung MRVP pada suhu 350C selama 48 jam.
Tambahkan 5 tetes larutan methyl red ke masing-masing tabung. Positif test
ditunjukkan dengan adanya warna merah yang jelas. Sedangkan reaksi negatif
ditunjukkan dengan adanya warna kuning.
d)

Citrate.

Inokulasi secara ringan tabung yang berisi Koser citrate broth; hindari adanya
kekeruhan yang dapat terdeteksi dengan jelas. Inkubasikan pada suhu 350C selama
9 jam. Adanya kekeruhan yang jelas menunjukkan reaksi positif.
e)

Pembentukan gas dari fermentasi laktosa.

Inokulasi tabung berisi LST broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 48 jam.
Reaksi positif ditunjukkan dengan berpindahnya media dari tabung bagian dalam atau
timbulnya busa setelah dilakukan agitasi secara halus.
f)

Interpretasi.

Semua kultur yang 1) memfermentasikan laktosa dengan produksi gas pada suhu
350C dalam 48 jam, 2) muncul sebagai bakteri coccus, Gram negatif, dan 3)
mempunyai pola ++-- (biotipe 1) atau -+-- (biotipe 2) pada uji IMViC dinyatakan
sebagai E. coli. Hitung MPN E. coli berdasarkan tabung-tabung EC yang
mengandung E. coli yang berasal dari 3 konsentrasi yang berurutan.

46 dari 82

03.

Penghitungan Staphylococcus aureus dengan metoda hitungan cawan

Metoda ini digunakan untuk menghitung jumlah S. aureus lebih besar dari 100 sel S.
aureus per ml/gram contoh. Metoda yang biasa digunakan adalah metoda
sebar/permukaan.

Prinsip

Manitol akan diubah oleh Staphylococcus yang tumbuh menjadi asam dan susuana
asam ini akan mengubah indikator phenol red menjadi kuning. Tellurite yang ada
akan menjadi tellurite yang berwarna hitam.

Media, pereaksi

a)
Baird Parker Agar (BPA) (tambahkan 5 ml egg yolk tellurite ke dalam
95 ml agar cair
b)

Trypticase Soy Agar (TSA)

c)

Brain Heart Infusion (BHI) broth

d)

Coagulase plasma kelinci mengandung EDTA 0,1%

e)

Buffered Peptone Water (BPW) 0,1%

Prosedur

3.1

Isolasi dan enumerasi S. aureus

a)

Buat pengenceran desimal terhadap contoh seperti metoda hitungan cawan.

b)
Pindahkan 0,1 ml suspensi contoh dari masing-masing pengenceran ke dalam
cawan petri berisi BPA.
c)
Dengan spreader sebarkan suspensi contoh di atas permukan agar secara
merata dan biarkan suspensi contoh terserap ke dalam media agar dengan
mendiamkan cawan-cawan tersebut sekitar 10 menit.

47 dari 82

3.2

Inkubasi

3.2.1 Inkubasikan cawan-cawan tersebut dengan posisi tutup berada di bawah

pada suhu 35-370C selama 45-48 jam.
3.2.2 Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu
penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur
bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.

3.3

Penghitungan jumlah presumtif S. aureus

3.3.1 Pilihlah cawan yang ditumbuhi oleh koloni tipikal S. aureus yang jumlahnya
antara 20 - 200 koloni. Bila cawan dari tingkat pengenceran berbeda memiliki
jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang
lebih banyak. Koloni khas S. aureus adalah bulat, licin halus, cembung, basah dan
berdiameter 2-3 mm jika koloni tidak padat, berwarna abu-abu sampai hitam pekat,
dikelilingi zona opak, dengan atau tanpa zona luar yang jelas.
3.3.2 Gunakanlah tally counter untuk menghitung tipikal koloni, dan berilah tanda
koloni yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan ulang. Bila ditemukan
adanya beberapa jenis koloni, hitung dan catat jenis koloni. Uji konfirmasi dapat
dilakukan dengan uji koagulase, clumping faktor dan pewarnaan Gram.

3.4

Uji konfirmasi S. aureus dengan uji koagulase

3.4.1 Pindahkan koloni yang diduga S. aureus ke dalam tabung berisi 0,2-0,3 ml
BHI broth dan larutkan dengan seksama.
3.4.2 Tambahkan 0,5 ml coagulase plasma yang mengandung 0,1 5 EDTA ke
dalam kultur BHI dan campur dengan seksama. Kemudian inkubasikan pada suhu
350C dan periksa secara periodik adanya penggumpalan setiap 6 jam sekali. Reaksi
positif S. aureus ditunjukkan bila terjadi gumpalan yang kokoh dan lengkap dan
apabila tabung dijentikkan atau dibalik, gumpalan tadi akan tetap berada ditempat
semula. Penggumpalan parsial, dinyatakan dengan reaksi koagulase 2+ dan 3+,
harus dilanjutkan dengan uji lebih lanjut.
3.4.3 Bila reaksi koagulase dari kultur yang diduga tidak dapat dipastikan berasal
dari S. aureus, maka inokulasikan kultur tersebut pada kultur yang sudah diketahui
positif dilanjutkan pada kultur yang sudah diketahui negatif S. aureus.
3.4.4 Lakukan pewarnaan Gram terhadap semua kultur yang diduga S. aureus
dan periksa di bawah mikroskop.
48 dari 82

Interpretasi Hasil/Perhitungan

Jumlah S. aureus per ml susu dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni
dari pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran

04

Pengujian Salmonellae

Prinsip

Dalam metoda ini dilakukan penggunaan gabungan larutan untuk pemulihan/resusitasi

(liquid resuscitation), larutan pre-enrichment dan media solid selektif untuk
mengisolasi presumtif salmonellae, sedangkan konfirmasi salmonellae harus
dilanjutkan dengan uji konfirmasi secara biologi dan serologi.

Media, pereaksi, antiserum dan uji

2.1

Media dan pereaksi

2.1.1

Buffered Peptone Water (BPW) (0,1%)

2.1.2

Mannitol selenite cystine broth (MSCB)

2.1.3

Rappaport-Vassiliadis (RV) media

2.1.4

Xylose Lysine desoxycholate (XLD) agar

2.1.5

Bismuth sulfite (BS) agar

2.1.6

Lysine decarboxylase broth

2.1.7

ONPG broth

2.2

Kuman uji

2.2.1

Kultur dari Salmonella hadar

2.2.2

Kultur dari Citrobacter freundii

49 dari 82

Prosedur

3.1

Resusitasi (Pre-enrichment)

3.1.1 Masukkan 25 ml contoh susu ke dalam 225 ml BPW dan campur hingga
benar-benar merata, kemudian inkubasikan pada suhu 370 C selama 24 jam.
3.1.2 Sebagai kontrol, inokulasi BPW dalam 2 tabung reaksi dengan masingmasing kuman uji dan inkubasikan pada suhu 370 C selama 24 jam.
3.2

Enrichment pada media selektif

3.2.1 Inokulasikan 1 ml suspensi dari masing-masing larutan resusitasi ke 10 ml

MSCB dan inkubasikan pada suhu 370 C selama 18-24 jam., serta 0,1 ml lainnya ke
10 ml RV media dan kemudian diinkubasikan pada suhu 420C selama 18-24 jam.

3.3

Isolasi presumtif Salmonellae pada media agar selektif

3.3.1 Dengan menggunakan ose steril inokulasikan suspensi dari masing-masing

media enrichment ke cawan yang berisi XLD agar dan BS agar dengan cara goresan
kuadran, kemudian inkubasikan pada suhu 370 C selama 18-24 jam untuk cawan
XLD serta 24-48 jam untuk cawan BS. Amati terbentuknya koloni-koloni yang
diduga sebagai Salmonellae.
3.3.2 Pada XLD agar, koloni Salmonellae berbentuk bulat dan berwarna hitam
mengkilat, sedangkan pada media BS koloni Salmonellae berwarna hitam.
3.3.3 Pilihlah tiga koloni tipikal Salmonellae dari tiap cawan dan inokulasikan
masing-masing koloni ke tabung reaksi berisi 2,5 ml larutan pepton 1% kemudian
inkubasikan pada suhu 370 C selama 4 jam atau hingga terjadi adanya kekeruhan.
3.4

Konfirmasi biokimia

3.4.1 Dengan ose steril inokulasikan suspensi dari masing-masing tabung reaksi
berisi larutan pepton ke Lysine-Decarboxylase broth (sebagai kontrol), ONPG
broth dan media agar CLED.
3.4.2 Interpretasi hasil. Suspensi dipastikan mengandung Salmonellae apabila
pada media Lysine-Decarboxylase terjadi reaksi positif dengan adanya perubahan

50 dari 82

warna menjadi kuning, pada media ONPG terjadi reaksi negatif ditunjukkan dengan
tidak adanya perubahan warna.

51 dari 82

Penghitungan jumlah sel radang

Metoda langsung
1

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metoda langsung penghitungan jumlah sel radang dalam susu
segar dengan menggunakan metoda Breed.

Prinsip

Untuk menetapkan jumlah sel radang dalam susu, maka dihitung jumlah sel radang
dalam 0,01 ml susu yang disebarkan di atas gelas objek hingga mencapai luas 1 cm2
dan kemudian diwarnai.

Pereaksi

a)

Larutan alkohol ether (ana)

b)

Larutan alkohol 96%

c)

Larutan methylen blue Loeffler

Peralatan

a)

Gelas objek bersih yang bebas dari lemak

b)

Pipet Breed steril

c)

Bunsen

d)

Mikroskop

e)

Ose siku

Prosedur

52 dari 82

5.1
Siapkan sebuah gelas objek yang telah dibersihkan dan bebas dari lemak,
kemudian diberi tanda yang menunjukkan asal contoh susu.
5.2

Letakkan gelas objek tersebut di atas kertas yang sudah berisi gambar kotak
seluas 1 cm2.
5.3
Pipet sejumlah 0,01 ml contoh susu dengan pipet Breed ke daerah yang
dibatasi kotak, dan dengan bantuan ose siku contoh susu tadi disebarkan sehingga
menutupi seluruh gambar kotak (luas 1 cm2).
5.4
Keringkan di udara sampai kering (sekitar 5 - 10 menit), kemudian difiksasi
di atas nyala api.
5.5

Lakukan pewarnaan dengan cara:

a)

Celupkan preparat tadi ke dalam larutan alkohol-ether (ana) selama 2 menit,

b)
Masukkan preparat tadi ke dalam larutan methylen blue Lffler selama 1
menit,
c)

Bilas secara hati-hati dengan air,

d)
Celupkan ke dalam alkohol 96% (untuk membersihkan bahan pulasan yang
tidak terikat),
e)

Preparat dikeringkan di udara atau dengan kertas pengisap.

5.6
Penetapan jumlah sel radang dilakukan dengan bantuan mikroskop
(pembesaran 100x) dengan menggunakan lensa minyak imersa.
5.7
Hitung jumlah sel radang dalam 20 lapangan pandang, kemudian dirataratakan.
6

Cara Perhitungan

Tentukan luas lapang penglihatan dengan cara menghitung diameter lapangan

penglihatan dari mikroskop yang digunakan dengan rumus: r2.
Diketahui pada bidang 1 cm2 disebarkan 0,01 ml susu, maka jumlah sel radang pada
luas lapang penglihatan adalah:
r2

X 0,01 ml

100

53 dari 82

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dengan jumlah sel per ml.

54 dari 82

Pengujian residu antibiotik

Skrining residu antibiotika

Pendahuluan
Pada dasarnya cara pengujian residu antibiotika dibedakan antara uji skrining dan uji
konfirmasi. Tujuan dilakukannya skrining residu antibiotika pada susu segar adalah
untuk mengetahui kemungkinan adanya residu antibiotika dalam susu secara kualitatif
atau semi kuantitatif. Dengan demikian dengan cara ini hanya dapat diketahui
ada/tidak adanya suatu residu antibiotika serta golongan dari antibiotika yang
ditemukan dari contoh susu yang diperiksa, sedangkan untuk mengetahui jenis dan
konsentrasi residu antibiotika secara pasti harus dilanjutkan dengan uji konfirmasi.

Metoda -1

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metode untuk skrining residu antibiotika pada air susu
dengan batas kepekaan adalah antara konsentrasi 0.04 g/ml sampai 1 g/ml
tergantung dari jenis antibiotika, sedangkan angka perolehan kembali antara 75% 95%.

Prinsip

Sampel susu dihomogenisasi. Tetesi kertas cakram dengan sampel susu, lalu
letakkan kertas cakram tersebut di atas permukaan media agar yang telah dicampur
dengan biakan bakteri uji dan diinkubasikan pada suhu 370 C selama 16-18 jam.
Contoh susu dinyatakan positif mengandung residu antibiotika bila terbentuk zone
hambatan di sekitar kertas cakram.

Bahan

a)

Media Agar NV- 4, NV-8, MX.

55 dari 82

b)

Larutan dapar fosfat pH 7,0 0,1 dan pH 8,0 0,1.

c)

Kuman uji :

1)

Micrococcus luteus ATCC 9341 - untuk golongan Makrolida.

2)

Bacilus subtilis ATCC 6633 - untuk golongan Amino-glikosida.

3)

Bacillus cereus ATCC 11778 - untuk golongan Tetrasiklin.

4)

Bacillus calidolactis - untuk golongan Penisilin.

d)
Larutan stok baku pembanding untuk antibiotika penisilin (PC), kanamisin
(KM), tilosin (TS) dan oksitetrasiklin (OTC).
e)

Larutan baku kerja.

f)
Kultur media (inokulasikan sebanyak 1% kuman uji pada media agar:
Bacillus subtilis pada media NV-4, Micrococcus luteus pada media NV-8 dan
Bacillus cereus pada media MX).
g)

Kurva baku

Peralatan

a)

Cawan petri steril 100 x 12 mm

b)

Inkubator 370 C dan 300 C

c)

Tabung sentrifus 50 ml, tabung reaksi 50 ml.

d)

Kertas cakram steril berdiameter 8-10 mm, silinder cakram 0,3 ml.

e)

Ultra turax.

f)

Sentrifus.

g)

Mikro pipet.

Prosedur

5.1

Persiapan media agar

5.1.1 Media NV-4 : Larutkan 5 gr pepton, 3 gr beef extract dan 16 gr agar

dalam 1.000 ml air suling, lalu ukur pH 8,5 0.1, dan kemudian didihkan. Media
56 dari 82

disterilisasi dengan memasukkannya ke dalam otoklaf pada suhu 1210C, 15 psi

selama 15 menit.
5.1.2 Medium NV-8: Larutkan 6 gr pepton, 1,5 gr beef extract, 3 gr yeast
extract, 1 gr D(+) Glucose dan 16 gr agar dalam 1.000 ml air suling, ukur pH 8.5
0.1, didihkan, kemudian sterilisasi dengan otoklaf pada suhu 1210C, 15 psi selama
15 menit.
5.1.3 Medium MX: Larutkan 6 gr pepton, 1,5 gr beef extract, 3 gr Yeast
extract, 1,35 gr kalium dihidrogen fosfat dan 15 gr agar dalam 1.000 ml air suling
dengan pH 5,7 0.1, didihkan dan dilakukan sterilisasi dengan otoklaf pada suhu
1210 C, 15 psi selama 15 menit

5.2.

Persiapan larutan dapar fosfat

5.2.1

Dapar fosfat pH 7.0 0.1: Campuran 6,4 gr kalium dihidrogen fosfat, 18,9
gr dinatrium hidrogen fosfat dalam 1.000 ml air suling, otoklaf pada suhu 1210C, 15
psi selama 15 menit
5.2.2

Dapar fosfat pH 8.00.1: Campuran 13,3 gr kalium dihidrogen fosfat dan

6,2 gr kalium hidroksida dalam 1.000 ml air suling, otoklaf pada suhu 1210C, 15 psi
selama 15 menit.

5.3
Larutan stok baku pembanding : Timbang 20 mg masing-masing baku
pembanding penisilin (PC), kanamisin (KM), tilosin (TS) dan oksitetrasiklin (OTC),
kemudian larutkan masing-masing dengan larutan dapar fosfat pH 7.0.

5.4
Larutan baku kerja : Untuk masing-masing antibiotika buat 6 serial
pengenceran larutan stok baku kerja dengan air atau larutan dapar fosfat hingga
konsentrasi 0,05 IU/ml atau 1 g/ml.

5.5

Kultur media :

5.5.1 Cairkan media agar (NV-4, NV-8, MX) dengan pemanasan pada suhu
1000 C, kemudian dinginkan dan simpan dalam penangas air bersuhu 560 C.

57 dari 82

5.5.2 Inokulasikan 1% kuman uji Bacillus subtilis pada media agar NV-4,
Micrococcus luteus pada media NV-8 dan Bacillus cereus pada media MX dan
campur secara seksama sehingga kuman uji dan media dapat tercampur rata.
Tuangkan sebanyak 7 ml masing-masing kultur media tersebut ke dalam cawan petri
steril dan biarkan menjadi beku.
5.6

Kurva baku

5.6.1

Siapkan tabung reaksi berisi 9 ml susu

5.6.2 Tambahkan masing-masing larutan baku kerja dari tiap konsentrasi ke dalam
susu (hitung konsentrasi akhir dalam susu).
5.6.3 Siapkan media agar NV-4, NV-8 dan MX masing-masing sebanyak 5
cawan petri untuk setiap konsentrasi pengenceran.
5.6.4 Ambil kertas cakram steril dengan pinset steril dan letakkan masing-masing 4
buah kertas cakram di atas permukaan media agar.
5.6.5 Teteskan 30 l setiap pengenceran ke kertas cakram. Inkubasikan 35-370
C selama 16-18 jam. Ukur diameter zona hambatan.
5.6.6 Buat kurva semilogaritmik dari rata-rata diameter zona hambatan yang
terbentuk dengan konsentrasi antibiotika. Respon point (RP) diambil darimasingmasing antibiotika dengan zona hambatan berdiameter antara 1,2 -1,5 mm.

5.7

Pengujian contoh susu

5.7.1 Siapkan kultur media untuk masing-masing kelompok antibiotika. Pengujian

contoh susu dilakukan secara triplet.
5.7.2 Letakkan kertas cakram steril di atas permukaan kultur media. Tiap cawan
petri kultur media berisi 4 buah kertas cakram. Dengan menggunakan pipet steril,
tetesi kertas cakram steril dengan contoh susu.
5.7.3 Inkubasikan pada suhu 37o C selama 16-18 jam. Ukur diameter zona
hambatan dengan kaliper atau jangka sorong.
5.7.4

Sesuaikan dengan kurva baku

Cara menyatakan hasil

58 dari 82

Sampel susu dinyatakan positif mengandung residu apabila terbentuk zona hambatan
di sekitar kertas cakram, minimal 1 mm lebih besar dari diameter kertas cakram.

Metode -2

Ruang lingkup

Standar ini menetapkan metoda skrining residu antibiotika dari susu segar, terutama
residu antibiotika golongan penisilin dan golongan tetrasiklin. Batas kepekaan antara
0,1 g/ml sampai 20 g/ml tergantung jenis antibiotika.

Prinsip

Kultur Bacillus stearothermophillus var calidolactis diinokulasi pada media agar.

Teteskan contoh susu pada kertas cakram, letakkan pada media agar, kemudian
diinkubasikan pada 550 C selama 2 jam 30 menit. Untuk memastikan adanya residu
golongan penisilin, maka penisilinase ditambahkan pada contoh susu sebelum
diteteskan pada kertas cakram. Tidak terbentuknya zona hambatan menunjukkan
indikasi adanya penisilin karena antibiotika tersebut telah diinaktifkan oleh
penisilinase.

Bahan Media

a)
Skim Milk: Larutkan 100 gr skim milk dalam 1.000 ml air dengan suhu
0
45-50 C, bagikan ke dalam tabung-tabung reaksi 50 ml, tutup dan otoklaf selama
20 menit pada suhu 1150 C, simpan dalam lemari pendingin hingga saat akan
digunakan.
b)
Nutrient broth: Larutkan 20 gr tryptone, 10 gr yeast extract, 0,5 gr
dextrose dalam air 1.000 ml dengan suhu 45-500 C, masukan ke dalam tabung
masing-masing 15 ml, tutup dan otoklaf dengan suhu 1210 C selama 15 menit.
c)
Stok kultur media : Larutkan masing-masing 5 gr pepton, 2 gr yeast extract
dehydrated, 1 gr beef extract, 5 gr natrium klorid dan 12,18 gr agar dalam 1.000
ml air, ukur agar pH 7,4 kemudian didihkan. Masukkan sejumlah 10 ml kultur media
ke dalam tabung, tutup dan otoklaf dengan suhu 1210 C selama 15 menit.
59 dari 82

d)
Media agar difusi : Larutkan masing-masing 5 gr tryptone, 2,5 gr yeast
extract dehydrated, 1 gr dextrose dan 12,18 gr agar dalam 1.000 ml air, ukur agar
pH 7,0. Otoklaf dengan suhu 1210 C selama 15 menit.

e)

Larutan stok baku pembanding :

1)
Larutan baku penisilin : Larutkan 100 mg benzil-penisilin dengan 100 ml
dapar fosfat pH 6 + 0,1. Simpan dalam lemari pendingin (Tahan 2 minggu)
2)
Larutan baku penisilin dalam air susu: Encerkan stok baku penisilin dengan
air susu sampai konsentrasi 0.006 g/ml, setara dengan 0,01 IU/ml.

Peralatan

a)

Cawan petri 100 mm x 12 mm

b)

Labu erlenmeyer 125 ml

c)

Glass beads 5 mm

d)

Inkubator 37-65 oC

e)

Labu ukur 125 ml dengan tutup

f)

Gelas piala 100 ml dan 1000 ml

g)

Otoklaf

h)

Kertas cakram 8-10 mm

i)

Wire-loop

j)

Tabung pembiak 5 ml, 10 ml, 20 ml

k)

Tangas air 45-100 oC

l)

Vortex - mixer

Prosedur

5.1

Persiapan biakan Bacillus stearothermophillus var calidolactis C 953

60 dari 82

5.1.1

Aktivasi ulang biakan (Reactivation culture).

Dengan menggunakan wire loop, tambahkan biakan dalam bentuk freeze dried ke
dalam 3 tabung nutrient broth yang masing-masing berisi 10 ml, inkubasikan pada
suhu 550 C selama 16 jam.

5.1.2

Stok biakan.

Inokulasikan biakan yang telah diaktivasi ulang tadi ke atas permukaan media,
inkubasikan pada suhu 550 C selama 48 jam. Simpan di lemari pendingin (0 - 50 C).
5.1.3

Biakan uji.

Inokulasikan stok biakan menggunakan wire loop ke dalam 10 ml nutrient broth,

inkubasikan pada suhu 550 C selama 6-16 jam .

5.2

Persiapan kultur media agar

5.2.1 Inokulasikan biakan uji ke dalam 5 bagian media agar pada suhu 550 C.
Pindahkan 6 ml media agar ke dalam cawan petri, dinginkan.
5.2.2

Persiapan kultur media agar dilakukan pada hari akan dilakukan uji.

5.3

Persiapan cuplikan

5.3.1 Pindahkan 2 ml contoh susu ke dalam tabung 10 ml, masukkan ke dalam

penangas air yang bersuhu 800 C selama 10 menit, kemudian dinginkan sampai 400
C.
5.3.2 Celupkan kertas cakram ke dalam contoh susu, letakkan di atas permukaan
media agar. Inkubasikan pada suhu 550 C selama 2 jam 30 menit, amati zona
hambatan yang terbentuk.
5.3.3 Proses yang sama lakukan terhadap kontrol negatif dan kontrol posistif (Air
susu standar tidak dipanaskan ).

5.4

Penetapan

Diameter zona hambatan yang terbentuk tidak boleh kurang dari 12 mm untuk
konsentrasi 0.01 IU/ml.

61 dari 82

Cara menyatakan hasil

Contoh susu dinyatakan positif mengandung residu, bila rata-rata diameter zona
hambatan tidak kurang dari 12 mm.

Metoda -3

Ruang lingkup

Metode ini digunakan untuk skrining residu kloramphenikol, nitrofuran dan

sulfonamida dengan batas kepekaan berturut-turut 10, 5 dan 100 g/kg.

Prinsip

Cuplikan dihomogenisasi dengan etil asetat, supernatan dimurnikan pada kolom

silika. Ekstrak ditotolkan pada lempeng kromatografi lapis tipis kinerja tinggi
(KLKT), dan setelah dikembangkan maka adanya golongan nitrofuran dapat
diketahui dengan pewarna pyridin di bawah UV 366 nm, sedangkan adanya
golongan sulfonamida dan khloramfenikol dapat diketahui dengan pewarna stannum
klorida dan fluoresamina.

Pereaksi

a)

Asam asetat, asam borat.

b)

Asetonitril, dimetilformamid, dioksana, etil asetat, heksana, metanol.

c)

Fenolftalein.

d)

Piridin, fluoresamina.

e)

Kalium klorida, natrium klorida, stannum klorida, natrium sulfat anhidrat.

f)
Larutan pereduksi khloramfenikol : Larutkan 0,4 gr stannum klorida dengan
10 ml asam asetat (5%, v/v), tambahkan 1 ml larutan 5% fenolftalein dalam
dioksan. Larutan ini tidak stabil sehingga harus dibuat segar setiap kali hendak
dipergunakan.

62 dari 82

g)
Larutan dapar pH 8,3 : Larutkan 19 gr asam borat dan 19,75 gr kalium
klorida dalam 800 ml air. Tepatkan pH dengan larutan natrium hidroksida pekat dan
himpitkan hingga volume 1.000 ml.
h)
Larutan pewarna (pendeteksi): Larutkan 50 mg fluoresamina dalam 500 ml
aseton. Larutan akan dapat stabil selama 12 bulan apabila disimpan pada suhu 180C.
i)

Gas nitrogen.

j)

Larutan baku pembanding :

1)
Larutan stok baku kloramfenikol (CP) : Larutkan 10 mg khloramfenikol
baku dalam 10 ml metanol, simpan dalam lemari pendingin.
2)
Larutan baku kerja khloramfenikol : Buat seri pengenceran dengan metanol
dari larutan stok baku hingga konsentrasi 10 ng/ml.
3)
Larutan stok baku nitrofuran (furazolidon, furaltaldon, nitrofurazon atau
nitrofurantoin): larutkan 10 mg baku nitrofuran dalam 10 ml dimetilformamida,
kemudian himpit hingga volume menjadi 100 ml dengan penambahan metanol.
Simpan pada suhu -180 C.
4)
Larutan baku kerja nitrofuran : Buat seri pengenceran dengan metanol dari
larutan stok baku hingga konsentrasi 0,5 ug/ml.
Catatan: Golongan nitrofuran sangat sensitif terhadap sinar, sehingga harus dihindari
kontak langsung dengan sinar. Oleh karena itu semua larutan baku harus
dipersiapkan dalam botol berwarna coklat. Seandainya dipergunakan botol
berwarna putih, maka botol itu harus dibungkus dengan alumunium foil.
5)
Larutan stok baku sulfonamida (sulfametasin, sulfadimetoksin,
sulfamonometoksin, sulfonamida atau sulfadiasin): Larutkan 10 mg baku sulfonamida
dalam 100 ml metanol. Simpan pada suhu -180 C.
6)
Larutan baku kerja sulfonamida : Buat seri pengenceran dengan metanol
dari larutan stok baku hingga konsentrasi 1 g/ml.
k)
Kontrol positif: Tambahkan masing-masing 1 ml larutan baku kerja kedalam
1 gram bahan asal hewan.
l)

Cartridge Silika Sep Pak Vac 1 ml.

m)

Larutan pengembang : campuran etil asetat dan heksana (2:1)

63 dari 82

Peralatan

a)

Pipet otomatis (Finpipette).

b)

Bejana kromatograf dan alat penyemprot.

c)
Lempeng Si-60 kromatograf lapis tipis kinerja tinggi (KLTKT), tanpa
fluorescen 10 x 10 cm atau 20 x 10 cm (Merck).
d)

Kotak lampu UV.

e)

Catridge Seppak Sil(Waters).

f)

Syringe 50 mikroliter untuk KLT (Hamilton) atau pipa kapiler.

g)

Sentrifus berpendingin.

h).

Tabung sentrifus 20 ml.

i)

Oven.

j)

Vortex-mixer.

Prosedur

5.1

Persiapan cuplikan

5.1.1

Masukkan 1 ml susu kedalam tabung sentrifuse 10 ml.

5.1.2 Tambah 0,25 ml etil asetat, campur selama 1 menit diatas vortex / mixer.
Tambah secara perlahan-lahan 1,75 ml etil asetat, sonikasi selama 10 menit.
5.1.3 Sentrifus 3500 rpm selama 10 menit, buang sedimen dan tambahkan 15 ml
heksana pada fase etil asetat. Sentrifuse 3500 rpm selama 10 menit. pindahkan fase
etil asetat ke dalam tabung 5 ml dan buang sedimen.
5.1.4 Alirkan fasa etil asetat-heksana kedalam Catridge Seppak Sil. Cuci
cartridge dengan 2 ml campuran etil asetat dan heksana (3:1). Cuci kembali dengan
2 ml campuran 95 bagian asetonitril dan 5 bagian metanol.
5.1.5 Elusi cartridge dengan 2 ml campuran aseton dan heksana (2:1). Tampung
eluat pada labu pemekat (labu evaporator)
5.1.6

Keringkan eluat dan larutkan residu dengan 50 l metanol.

5.2

Penetapan

64 dari 82

Totolkan 10 l ekstraks dengan syringe pada KLT. Teteskan juga setiap larutan
baku kerja pada lempeng yang sama. Keringkan pada suhu kamar. Masukkan ke
dalam larutan pengembang dalam bejana kromatograf yang telah dipersiapkan
sebelumnya. Biarkan larutan pengembang naik hingga sekitar 2 cm dari sisi atas
lempeng. Keringkan lempeng pada suhu kamar.
6

Cara menyatakan hasil

6.1

Untuk mengetahui adanya nitrofuran

Semprot lempeng dengan piridin, amati di bawah lampu UV 366 nm. Adanya
nitrofuran akan terlihat sebagai bercak atau noda berwarna kuning dengan latar
belakang warna ungu. Pada konsentrasi rendah, noda akan terlihat berwarna biru.
Bandingkan dengan noda dari larutan baku kerja. Waktu tambat (retention
time/RF) dari golongan nitrofuran sekitar 0,2.
6.2

Untuk mengetahui adanya sulfonamida atau khloramphenikol

6.2.1 Masukkan lempeng tersebut di atas ke dalam oven selama 10 menit untuk
menghilangkan piridin, lalu dinginkan.
6.2.2 Setelah itu semprot dengan larutan stannum klorida hingga lempeng berwarna
abu-abu. Biarkan 15 menit dalam ruang gelap, kemudian masukkan ke dalam oven
selama 15 menit pada suhu 1100C, dinginkan.
6.2.3 Secara hati-hati semprot dengan larutan natrium hidroksida hingga lempeng
berwarna sedikit merah muda.
6.2.4 Semprot dengan larutan dapar borat hingga lempeng sedikit keabu-abuan.
Keringkan dalam oven, dinginkan.
6.2.5

Semprot dengan larutan fluoresamina.

6.2.6 Adanya khloramfenikol atau sulfonamida akan terlihat sebagai noda

berwarna kuning dengan latar belakang ungu di bawah UV 366 nm. Bandingklan
dengan noda dari larutan baku kerja. Waktu tambat khloramfenikol adalah sekitar
0,4 sedangkan sulfonamida adalah sekitar 0,7.

II

Identifikasi dan Kuantifikasi Residu Antibiotika

Pendahuluan

65 dari 82

Identifikasi dan kuantifikasi residu antibiotika dilakukan untuk mengetahui adanya

residu secara kualitatif maupun kuantitatif. Secara kualitatif dapat mengetahui jenis
residu antibiotika dan secara kuantitatif dapat diketahui tingkat kandungan
(konsentrasi) residu antibiotika dengan menggunakan standar pembanding.

Residu Khloramfenikol

Ruang lingkup

Metode ini digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi residu kloramfenikol dalam
air susu dengan batas kepekaan 0,01 mg/kg.

Prinsip

Cuplikan diekstraksi, dihilangkan kandungan lemak, protein dan airnya. Dimurnikan

melalui kolom silika dan dianalisa mempergunakan Kromatograf Kinerja Tinggi
(KCKT) dengan UV detektor pada panjang gelombang 270 nm.

Pereaksi

a)

Asam asetat 0,2 M: larutkan 11,5 ml asam asetat glasial dalam 1 liter air.

b)

Asetonitril, etil asetat, heksana, kloroform dan metanol.

c)

Larutan dapar asetat pH 4,6: atur pH dengan penambahan natrium asetat.

d)

Natrium sulfat anhidrat.

e).

Eluen untuk kolom silika : campuran khloroform dan metanol (9:1).

f)
Larutan stok baku: larutkan 10 mg khloramfenikol baku pembanding dengan
10 ml air.
g)
Larutan baku kerja: buat seri pengenceran larutan stok baku sampai
konsentrasi 1 g/ml.
h)

Fase gerak untuk KCKT: campuran asetonitril dan air (3:7).

66 dari 82

Peralatan

a)

Silika kolom: Catridge Seppak Sil (Waters)

b).

Wol kaca

c)

Homogeniser

d)
Kromatograf Cair kinerja Tinggi (KCKT) dengan detektor UV-Vis, kolom
fase terbalik C-18.
e)

Kertas saring Whatman no.4 dan kertas saring 0,45 Fm.

f)

Rotavapor dan labu rotavapor 50 ml.

g)

Labu pisah.

h)

Sentrifus dan tabung sentrifus 100 ml.

i)

Tangas ultra sonnnik.

Prosedur

5.1

Persiapan cuplikan

5.1.1 Timbang 10 gram cuplikan, masukan ke dalam tabung sentrifus 100 ml,
tambah 100 ml etil asetat dan homogenisasi. Sentrifus 300 rpm selama 10 menit.
5.1.2

Ambil 50 ml supernatan dan keringkan melalui natrium sulfat anhidrat

5.1.3 Keringkan dan larutkan ekstraks dengan 50 ml larutan asam asetat 0,2 M
Pindahkan ke dalam labu pisah 300 ml. Ekstraksi dengan 100 ml n-heksana. Buang
lapisan n-heksana.
5.1.4 Ekstraksi fase dengan 2 x 40 ml etil asetat, kocok, biarkan terpisah.
Tampung lapisan etil asetat dan evaporasi sampai kering. Larutkan residu dengan
10 ml kloroform. Alirkan ke silika kolom. Cuci cartridge dengan 10 ml kloroform.
Elusi dengan eluen dan tampung eluat pada labu rotavapor.
5.1.5 Keringkan dengan rotavapor di atas penangas air, larutkan ekstraks dalam
0,5 ml fase gerak dan saring.
5.2

Penetapan

67 dari 82

5.2.1 Suntikkan 50 l ke dalam KCKT yang dilengkapi dengan kolom analitik C18, menggunakan fase gerak campuran asetonitril dan air (3:7), laju aliran 1
ml/menit, detektor UV 270 nm.
5.2.2 Amati waktu tambat dan puncak atau area kromatogram cuplikan dan
larutan baku.

Cara menyatakan hasil

6.1
Secara kualitatif: adanya puncak dalam kromatogram yang mempunyai
waktu tambat (waktu retensi/retention time) yang sama dengan baku (standar)
antibiotika menunjukkan adanya residu.

6.2

Secara kuantitatif:

6.2.1 Dengan membandingkan tinggi puncak atau luas area di bawah puncak dari
larutan ekstrak cuplikan dengan larutan baku standar.
6.2.2

Menggunakan kurva kalibrasi larutan baku kerja:

a)

Buat minimal 6 konsentrasi larutan baku kerja.

b)
Buat kurva kalibrasi atau persamaan linear dari tinggi puncak atau luas area
di bawah puncak terhadap konsentrasi pada kertas semilogaritma.
c)
Hitung konsentrasi cuplikan dari tinggi puncak cuplikan atau luas area di
bawah puncak ke dalam kurva kalibrasi atau persamaan yang diperoleh.
Catatan :
Tinggi puncak atau luas area di bawah puncak dalam kromatogram dapat diukur
secara otomatis dengan mempergunakan integrator/komputer atau secara manual.

B Residu tetrasiklin (TC)

Ruang lingkup

68 dari 82

Standar ini menetapkan metoda untuk identifikasi dan kuantifikasi residu tetrasiklin
dalam susu dengan batas kepekaan 0,01 - 0,05 mg/kg.

Prinsip

Cuplikan diekstraksi, dipisahkan dari lemak, protein dan air. Ekstrak yang diperoleh
dianalisa menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan UV
detektor pada panjang gelombang 350 nm.

Pereaksi

a)

Etylen diamine tetraacetic acid (EDTA).

b)

Asetonitril

c)

Hexana

d)

Etylacetat

e)

Natrium sulfat (Na2SO4) anhidrat

f)

Natrium dihidrogen fosfat

g)
Larutan stok baku: larutkan 20 mg dari masing-masing baku oksitetrasiklin,
klortetrasiklin dan doksisiklin dalam 20 ml metanol
h)
Larutan baku kerja: buat seri pengenceran larutan stok baku hingga
konsentrasi 10 g/ml
i)
Fase gerak untuk KCKT yaitu campuran metanol, asetonitril dan asam
oksalat 0,02 M (1:1:8)

Peralatan

a)

Labu erlenmeyer 250 ml

b)

Corong pisah 250 ml

c)

Rotavapor dan labu rotavapor 100 ml

69 dari 82

d)
Kromatograf Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan kolom U Bondapak,
detektor UV
e)

Corong

f)

Kertas saring Whatman no. 41

g)

Sentrifuse

Prosedur

5.1

Persiapan cuplikan

5.1.1

Masukkan 20 ml contoh susu ke dalam erlenmeyer 250 ml

5.1.2

Tambahkan 2 gr EDTA, kocok

5.1.3

Saring dengan kertas saring hingga diperoleh 10 ml filtrat

5.1.4 Masukkan filtrat ke dalam labu erlenmeyer 250 ml, tambahkan 15 ml hexana
dan kocok. Buanglah lapisan hexana dan ambillah lapisan air. Lakukan penambahan
hexana sebanyak 2 kali.
5.1.5 Tambahkan 20 ml etilasetat pada lapisan air lalu kocok. Buang lapisan air
dan kumpulkan lapisan etilasetat. Lakukan penambahan etilasetat sebanyak 2 kali.
5.1.6 Tambahkan natrium sulfat anhydrat pada lapisan etilasetat, kemudian saring
dengan kertas saring.
5.1.7 Uapkan filtrat dengan rotavapor hingga kering, kemudian tambahkan 1 ml
fase gerak pada sisa penguapan, lalu kocok.
5.1.8 Sentrifus pada kecepatan tinggi (10.000 rpm). Pisahkan larutan yang jernih
dari kotoran.
5.1.9

Larutan siap dianalisa pada KCKT.

5.2

Penetapan

5.2.1 Suntikkan 50 I larutan ke dalam KCKT dengan mempergunakan kolom

fase terbalik C-18. Fase gerak campuran metanol, asetonitril dan asam oksalat 0,02
M (1:1:8), kecepatan aliran 1 ml/menit. Dengan UV detektor pada panjang
gelombang 350 nm.

70 dari 82

5.2.2 Amati waktu tambat dan puncak atau area kromatogram cuplikan dan
larutan baku.

Cara menyatakan hasil

Lihat cara menyatakan hasil dalam residu khloramfenikol.

Residu penisilin (PC)

Ruang lingkup

Standar ini menetapkan metoda untuk identifikasi dan kuantifikasi residu penisilin
dalam susu dengan batas kepekaan 0,01 - 0,05 mg/kg.

Prinsip

Cuplikan diekstraksi, dipisahkan dari lemak, protein dan air. Ekstrak yang diperoleh
dianalisa menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan UV
detektor pada panjang gelombang 350 nm.

Pereaksi

a)

Asam fosfat (H3PO4) pekat

b)

Acetonitril

c)

NaCl

d)

Dichlorometana (CH2Cl2)

71 dari 82

e)

Fase gerak untuk KCKT yaitu: KH2PO4 0.01M : Metanol : CH3CN

(50:20:30)

Peralatan

a)

Labu erlenmeyer 250 ml

b)

Corong pisah 250 ml

c)

Labu florentine 100 ml

d)

Corong

e)

Glasswool

f).

Kertas saring Whatman no. 41

g)

Rotavapor

h).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan kolom U Bondapak,
Detektor UV

Prosedur

5.1

Masukkan 20 ml contoh susu ke dalam labu erlenmeyer 250 ml.

5.2

Tambahkan 7 tetes asam fosfat (H3PO4) pekat, lalu kocok.

5.3

Tambahkan 40 ml acetonitril dan kocok selama 30 menit.

5.4

Saring dengan glasswool dan ambil 30 ml filtrat.

5.5

Masukkan filtrat ke dalam labu kocok 250 ml.

5.6
Tambahkan 3 gram NaCl dan ekstrak 2 kali dengan dichlorometan
(CH2Cl2) kemudian kocok.
5.7

Kumpulkan fase CH2Cl2 ke dalam labu florentine, kemudian uapkan dengan

rotavapor hingga hampir kering.

5.8

Tambahkan 1 ml fase gerak pada sisa penguapan.

5.9

Larutan siap diinjeksikan pada KCKT.

72 dari 82

73 dari 82

Uji kebersihan

Ruang lingkup

Standar ini menetapkan metode pengujian kebersihan penanganan susu di

perusahaan atau di tempat produksinya apakah telah dilakukan dengan cara yang
baik dan benar.

Prinsip

Kotoran dan benda asing yang terdapat di dalam susu akan tertinggal di kertas saring
atau saringan yang akan tampak dengan mata telanjang.

Perekasi

Tidak diperlukan.

Peralatan

a)
Botol susu khusus (tidak memiliki dasar) berkapasitas 500 ml yang
dilengkapi dengan alat penjepit penyaring pada bagian leher botol.
b)

Labu erlenmeyer.

c)

Corong berdiameter 15 cm.

d)

Kapas penyaring khusus.

Prosedur

Catatan: untuk pengujian ini diperlukan minimal 500 ml susu dan jumlah ini harus
seragam dalam satu seri pemeriksaaan.
5.1
Atur posisi botol susu dengan bagian leher yang dilengkapi kapas
penyaring berada di bawah. Letakkan corong pada dasar botol susu.

74 dari 82

5.2
Tuangkan contoh susu ke dalam botol susu secara perlahan-lahan melalui
dinding dengan bantuan corong dan hasil penyaringan tersebut ditampung dalam labu
erlenmeyer.
5.3
Setelah semua susu melalui saringan, saringan diambil dan dikeringkan di
udara atau diinkubasikan kemudian dibandingkan dengan kapas penyaring khusus
yang belum dipakai.

Hasil uji

Hasil positif ditunjukkan dengan adanya kotoran yang tersangkut dalam saringan,
dan dapat berupa bulu sapi, rumput, sisa makanan, tinja dan lain-lain.

75 dari 82

Uji pemalsuan

Uji terhadap penambahan susu masak

1.1

Ruang Lingkup

Standar ini menetapkan metode pengujian kemungkinan adanya pemalsuan pada

susu segar berupa penambahan susu yang telah mengalami pemanasan dengan uji
Storch.

1.2

Prinsip

Di dalam susu segar terdapatenzim peroksidase yang akan terurai/musnah oleh

pemanasan di atas 750C. Enzim ini akan membebaskan oksigen dari larutan
peroksida yang ditambahkan ke dalam susu. Oksigen akan bersenyawa dengan zat
pemulas sehingga warnanya berubah.

1.3

Pereaksi

a)

Larutan paraphenildiamin 2% dalam air

b)

Larutan hidrogen peroksida (H2O2) 0,2 - 1 %

1.4

Peralatan

Tabung reaksi

1.5

Prosedur

1.5.1 Masukkan 5 ml contoh susu ke dalam tabung reaksi, kemudian tambahkan 2

tetes larutan paraphenildiamin 2%.
1.5.2 Tambahkan 1-4 tetes larutan
perubahan warna.

H2O2 (0,2 - 1 %) dan amati terjadinya

76 dari 82

1.6

Hasil uji

Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna biru.

Uji terhadap penambahan gula

2.1

Ruang lingkup

Standar ini menetapkan metoda pengujian kemungkinan adanya pemalsuan susu

dengan penambahan gula yang bisa berasal dari gula pasir, sakarin, air kelapa atau
susu kental manis dengan cara uji Conradi.

2.2

Prinsip

Uji ini digunakan untuk membuktikan adanya sakarosa. Gula akan terhidrolisa oleh
HCl pekat menjadi 4-hidroksi metil furfural. Furfural dan turunannya akan bereaksi
dengan resorsin membentuk warna merah jambu.

2.3

Pereaksi

a).

Resorsin

b)

Asam khlorida (HCl) pekat (min. 37%).

2.4

Peralatan

a)

Cawan porselin

b)

Pengaduk kaca

c).

Bunsen dan kawat asbes

d).

Gelas ukur10 ml.

77 dari 82

2.5

Prosedur

2.5.1

Masukkan 100 mg resorsin ke dalam cawan porselin.

2.5.2 Tambahkan 25 ml contoh susu, kemudian dengan menggunakan gelas ukur

tambahkan 2,5 ml HCl pekat.
2.5.3 Panaskan campuran tersebut sampai mendidih di atas bunsen dengan dialasi
asbes sambil terus diaduk dengan pengaduk gelas.
2.5.4

Angkat cawan porselin dari pemanas dan tunggu selama 5 menit.

2.5.5

Amati terbentuknya warna merah jambu.

2.6

Hasil uji

Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna merah jambu.

Uji terhadap penambahan pati

3.1

Ruang lingkup

Standar ini menetapkan metoda pengujian kemungkinan adanya pemalsuan susu

dengan penambahan pati yang bisa berasal dari penambahan tepung kanji, air
pencuci beras dan larutan tepung beras.

Metoda 01: Pemeriksaan secara kimiawi

3.2

Prinsip

Dengan penambahan larutan lugol, adanya pati/amilum di dalam contoh susu akan
dibuktikan dengan terbentuknya warna biru.

3.3

Pereaksi

a)

Larutan asam asetat

78 dari 82

b)

Larutan lugol.

3.4

Peralatan

a)

Tabung reaksi

b)

Corong

c)

Kertas saring

d)

Pipet 1 ml, 10 ml

e)

Bunsen.

3.5

Prosedur

a)

Masukkan 10 ml contoh susu ke dalam tabung reaksi.

b)

Tambahkan 0,5 ml asam asetat.

c)

Panaskan tabung kemudian contoh susu disaring.

d)
Teteskan 4 tetes lugol ke filtrat yang diperoleh dan amati terjadinya
perubahan warna.

3.6

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna biru.

Uji terhadap penambahan bahan pengawet

4.1

Formaldehida (formalin)

4.1.1

Pereaksi

Larutan asam klorida (HCl) mengandung besi

79 dari 82

Cara membuat: campurkan 100 ml HCl (BJ = 1.124 - 1.126 g/ml pada suhu 200C)
dengan 0,2 ml larutan FeCl3 10%.

4.1.2

Peralatan

a)

Tabung reaksi

b)

Penangas air

c)

Pipet.

4.1.3

Prosedur

a)

Masukkan 2 ml contoh susu ke dalam tabung reaksi.

b)
Tambahkan 10 ml larutan asam klorida mengandung besi, kemudian
panaskan.
c)

Biarkan mendidih selama 1 menit dan amati perubahan warna yang terjadi.

4.1.4

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna ungu.

4.2

Hidrogen peroksida

Metoda 01

4.2.1

Pereaksi

Larutan titanil sulfat

Cara membuat : larutkan 2 gram titandioksida dalam 100 ml asam sulfat yang
diperoleh dari pengenceran asam sulfat pekat dengan aquades (1:3).
80 dari 82

4.2.2

Peralatan

a).

Pipet tetes

b)

Tabung reaksi.

4.2.3

Prosedur

a)

Ke dalam 10 ml susu ditambahkan 10 tetes larutan titanilsulfat.

b)

Amati perubahan warna yang terjadi.

4.2.4

Hasil Uji

Hasil uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning hingga merah jingga.

Metoda 02

4.2.1

Pereaksi

a)

Asam sulfat pekat (d=1.19)

b)

Kertas Jodkalium (KI)

c)

Larutan formalin.

4.2.2

Peralatan

a)

Pipet tetes

b)

Tabung reaksi.

c)

Penangas air.

4.2.3

Prosedur

a)
Masukkan contoh susu dan asam sulfat pekat dengan perbandingan yang
sama ke dalam tabung reaksi.
81 dari 82

b)

Tambahkan 1 tetes larutan formalin encer, kocok dan hangatkan pada suhu

600C.
c)
Celupkan kertas Jodkalium dan amati terbentuknya warna yang terjadi
pada kertas Jodkalium.
4.2.4

Hasil Uji

Hasil uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru keunguan atau biru
pada kertas Jodkalium.

4.3

Sublimat

4.3.1

Pereaksi

Amoniak

4.3.2

Peralatan

Labu erlenmeyer

4.3.3

Prosedur

a)
Msukkan 100 ml contoh susu ke dalam labu erlenmeyer, kemudian
tambahkan 100 ml amoniak.
b)

Amati perubahan warna yang terjadi.

4,3.4

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dalam hasil positif atau negatif. Hasil uji positif ditunjukkan
dengan terbentuknya warna abu-abu.

82 dari 82

Uji residu desinfektan dalam susu

5.1

Uji Quartenarium Amonium Sulfat (QAS)

5.1.1

Ruang lingkup

Standar ini menetapkan metoda pengujian dengan cara biologis adanya residu
quartenarium amonium sulfat (QAS) pada susu segar dengan metoda Kluyver.

5.1.2

Prinsip

Mikroorganisme Saccharomyces cerevisiae akan memfermentasi glukosa dan

membentuk gas. Adanya desinfektan akan menghambat proses fermentasi dan
proses pembentukan gas.

5.1.3

Bahan

a)

Glukosa

b)

Biakan Saccharomyces cerevisiae atau ragi roti.

5.1.4

Peralatan

a)

Tabung reaksi

b)

Inkubator

5.1.3

Prosedur

83 dari 82

a)

Tambahkan 2-2,5% glukosa ke dalam contoh susu.

84 dari 82

Uji peroksidase dengan metoda Storch

Ruang lingkup

Standar ini menetapkan metoda pengujian enzim peroksidase yang terdapat dalam
susu segar untuk mengetahui adanya indikasi susu telah mengalami pemanasan atau
terjadi penambahan susu yang telah dipanaskan di atas 800C.

Prinsip

Enzim peroksidase yang terdapat dalam susu segar/mentah akan terurai dan menjadi
tidak aktif apabila susu tersebut dipanaskan pada suhu 70 - 800C. Enzim akan
membebaskan oksigen dari larutan H2O2 yang akan dibubuhkan ke dalam susu.
Oksigen akan bereaksi dengan zat pemulas dan menyebabkan perubahan warna.

Pereaksi

a)

Larutan H2O2 0,2 - 1%.

b)

Larutan paraphenildiamide 2%.

Peralatan

Tabung reaksi.

Prosedur

5.1

Masukkan 5 ml contoh susu ke dalam tabung reaksi.

5.2

Tambahkan 2 tetes larutan paraphenildiamide 2%.

5.3

Tambahkan 1 - 4 tetes larutan H2O2 0,2 - 1%.

5.4

Amati perubahan warna yang terjadi.

85 dari 82

Hasil Uji

Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna biru. Sedangkan hasil negatif apabila susu tetap berwarna putih,
menunjukkan adanya indikasi susu telah mengalami pemanasan atau dicampur
dengan susu yang telah dipanaskan di atas suhu 800C.

86 dari 82

Daftar isi

Halaman

Pendahuluan
Daftar isi

Judul

Uji penetapan berat jenis

Pengukuran kadar lemak dengan metoda Gerber

Perhitungan kadar bahankering tanpa lemak (BKTL)

Metoda : 01 Dengan menggunakan rumus Fleischmann

Metoda : 02 Dengan menggunakan metoda pengeringan

10

Uji protein menurut Kjeldahl

13

Uji warna, bau, rasa dan kekentalan

16

Uji titrasi keasaman Soxhlet Henkel

19

Uji alkohol

21

Uji katalase

23

Penentuan titik beku

25

Pengukuran angka refraksi metoda Ackermann

27

Uji reduktase

30

Metoda : 01 Uji reduksi biru metilin (Methylen blue reduction tes)

30

Metoda : 02 Uji resazurin

33

Uji sedimen

35

Pengujian cemaran mikroba

36
i

01 - Penentuan angka lempeng total pada 350 C

37

02 - Perhitungan Coliform dan Escherichia coli

41

03 - Perhitungan Staphylococcus aureus dengan metoda hitungan cawan

46

04 - Pengujian Salmonellae

48

Perhitungan jumlah sel radang

51

Metoda langsung

51

Pengujian residu antibiotik

53

Skrining residu antibiotika

53

Metoda - 1

53

Metoda - 2

57

Metoda - 3

60

II Identifikasi dan kuantifikasi residu antibiotika

63

A Residu Khloramfenikol

64

B Residu tetrasiklin (TC)

66

C Residu Peniciline

69

Uji kebersihan

71

Uji pemalsuan

73

Uji terhadap penambahan susu masak

73

Uji terhadap penambahan gula

74

Uji terhadap penambahan pati

75

Uji terhadap penambahan bahan pengawet

76

Uji residu desinfektan dalam susu

80

Uji peroksidase dengan metoda Storch

81

ii