Yana Wahyuni Saher (066110703)

Pemindahan informasi genetik dari satu organisme ke organisme lain.

pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.

Tahapan Kloning DNA

Isolasi DNA Pemotongan Ligasi Transformasi Seleksi Deteksi

1. Penghancuran dinding sel : Mekanik enzimatis 2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat- Triton X 100 3. Membersihkan debris sel sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven organik Contoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi atau proteinase-K 4. Presipitasi + alkohol sentrifugasi gradien CsCl ; elektro + alcohol + NH4 asetat

 Restriction Enzymes = enzim restriksi Diperoleh dari bakteri sebagai mekanisme pertahanan terhadap infeksi virus DNA
Endonucleases = memotong (cleave) di dalam utasan DNA Telah diketahui ada 3,139 enzyme

Enzyme Site Recognition = situs pengenalan enzim restriksi

Setiap enzim mendigesti (memotong) DNA pada sekuens spesifik = situs restriksi (restriction site) Enzim mengenali 4- atau 6- pasangan basa , dengan Sekuens palindromik (eg GAATTC)

 DIGUNAKAN PADA DNA REKOMBINAN MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE MENGENALI URUTAN PALINDROM {5 GAATTC 3 } & {3 CTTAAG 5 } Sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut: 1. mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA 2. memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya 3. menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.

Ligasi Molekul molekul DNA

PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR menjadi VEKTOR REKOMBINAN. 1. Ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri (untuk ujung2 yang lengket) 2. Ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 (enzim T4 ligase) untuk ujung lengket maupun pada ujung tumpul. 3. Pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3 , diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.

Transformasi Sel Inang

info genetik ditransfer ke sel inang denganmetode transformasi. Sel inang dibuat kompeten (siap menerima DNA asing ) modifikasi struktur dinding sel. Metode transformasi : heat shock/elektroporasi

SELEKSI BIRU PUTIH

Mengetahui apakah dna sisipan sudah ada Pada mcs terdapat gen lacZ (Mengkode galaktosidase) X-GAL BIRU DNA sisipan akan merusak gen lacZ Galaktosidase tidak diproduksi X-GAL tidak diuraikan PUTIH

Seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung plasmid rekombinan

Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan

Pelacak DNA / RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. Tahap berikutnya adalah memasukkan plasmid ke dalam sel bakteri dengan cara mencampurkan campuran plasmid tersebut dengan bakteri inangnya

 Untuk terapi anemia. Anemia ginjal. Ginjal sehat hormon Erythropoietin (EPO) stimulasi sumsum tulang untuk memproduksi sel-sel darah merah (oksigen ke organ2 vital)

 Paul Carnot, professor kedokteran di Paris & asistennya Deflandre (1906); proses eritropoiesis diregulasi oleh hormon peningkatan sel darah merah pada kelinci dipicu oleh adanya faktor hemotopic yang disebut hemopoetin. Eva Bonsdorff dan Eeva Jalavisto; faktor hemopoetic itu adalah Eritropoietin. Reissman & Erslev; senyawa kimia khusus yang disirkulasi dalam darah dan dapat menstimulasi produksi sel darah merah serta meningkatkan hematokrit

Ahli hematologi Dr. John Adamson dan Dr. Joseph W.Eshbach peranan EPO dalam pembentukan sel-sel darah merah. Ginjal hormon Errythropoietin (EPO). Erythropoietin protein yang mengontrol proses eritropoiesis dan dapat menstimulasi pembentukan sel-sel darah merah oleh sumsum tulang (bone marrow). Lin et al (1985) telah mengisolasi gen human Erytropoietin gen EPO mengkode produksi pada sel-sel mamalia yang juga mempunyai aktivitas biologi baik in vivo maupun in vitro terapi anemia

EPO sbg agen terapi anemia yang disebabkan oleh kanker, gagal ginjal atau untuk terapi AIDS. Meningkatkan jumlah sel darah merah (anemia & pasca operasi) mengurangi resiko akibat transfusi darah.