Rencana Perkuliahan
Restriksi Endonuklease
Ligasi & Ligasi DNA
Vektor
Kloning & Rekombinan DNA
Isolasi DNA & RNA
Goal..
DNA Rekombinan
Nucleases
Phospodiester
Nukleotida
IK. Hidrogen
Exonuclease VS Endonuclease
Nuclease dapat memotong/degradasi
molekul DNA dengan membelah IK.
Phosfodiester yang menghubungkan
nukleotida
Exonuclease menghilangkan nukleotida
pada posisi ujung molekul DNA
Endonuclease memotong ikatan dalam
phosfodiester molekul DNA
Enzim Restriksi
Ligasi
Ligase : Enzim yang mensintesis
pembentukan ikatan phosfodiester yang
menghubungkan nukleotida satu dengan
yang lainnya
Ligasi
Restriksi
& Ligasi
DNA VEKTOR
Vektor kloning berfungsi untuk
memperbanyak fragmen DNA yang
disisipkan, sehingga fragmen DNA hanya
di replikasi, tidak di transkripsi.
Vektor ekspresi digunakan untuk produksi
protein.
Vektor (Biotranspor)
Plasmid
Virus lambda bacteriophaga
Cosmid
Plasmid
Tahapan kloning
Isolasi/preparasi DNA sisipan dan DNA
Vektor
Pemotongan molekul DNA
Penggabungan fragmen DNA sisipan ke
DNA vektor
Transformasi
Identifikasi
Isolasi DNA rekombinan
Transfromasi
Sel kompeten : sel mampu menerima
DNA asing.
Sel diberi lar. CaCl2 agar sel menjadi
permeabel dan bermuatan + (DNA-).
Cara Heat Shock dan Kejutan listrik.
Kemungkinan dalam
transformasi?
Sel kompeten tidak kemasukan DNA
apapun
Sel kompeten kemasukan DNA vektor
tetapi tidak membawa gen X
Sel kompeten kemasukan DNA vektor dan
membawa gen X (DNA rekombinan)
Next...
Konfirmasi DNA rekombinan
PCR