30

AIDAWATI ETAL.

J Mikrobiol lndones

keriting, daun menjadi kecil, tepi daun melengkung ke atas, penebalan anak tulang daun, daun menguning atau menunjukkan pola mosaik dikumpulkan dari pertanaman tomat di beberava tempat di Daerah Istimewa Yogyakarta @IY), Jawa Tengah, dan Jawa Barat. Deteksi Geminivirus dengan Teknik PCR. Ekshaksi DNA total tanaman dari sampel dilakukan berdasarkan pada metode Dellaporta et al. (1983). DNA ini diamplifkasi dengan teknik PCR mengikuti Rojas et al. (1993) menggunakan primer universal geminivirus PALlv 1978 dan PARlc 715, yang dirancang berdasarkan pada pembandingan sekuen DNA beberapa geminivirus pada daerah genom yang menyandikan protein untuk replikasi dan protein selubung. Fragmen DNA hasil amplifkasi PCR dielektroforesis pada gel agarosa I% dalam bufer Tris-borate EDTA (TBE) 0.5X dengan tegangan 75 volt (Maniatis et al. 1989) diberi pewama etidium bromida dan diamati dengan transiluminator ultra violet. Analisis Pola Pemotongan DNA oleh Enzim Restriksi (RFLP-PCR). Fragmen DNA amplifiasi PCR dipotong dengan menggunakan empat enzim restriksi (BamHI, EcoRI, HindIII, dan Pstl). Pemotongan DNA dengan enzim restriksi dilakukan menurut metode Maniatis et al. (1989). Setelah inkubasi pada 37 C selama 1-2 jam, hasil pemotongan DNA divisualisasi secara elektroforesis pada gel agarosa 1.5% dengan menggunakan bufer TBE 1X. Hubungan Kekerabatan Antarisolat Geminivirus. Hubungan kekerabatan antarisolat geminivirus yang menyerang tanaman tomat yang telah ditemukan dalam penelitian ini akan dibandingkan dengan isolat geminivirus tomat hasil penelitian Sudiono et al. (2001). Analisis dilakukan berdasarkan pola enzim restriksi menggunakan program komputerNTSYSTversi2.1 melalui analisis UnweightedPair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA).

Tabel 1. Gejala pada daun tanaman tomat yang diduga terinfeksi geminivirus Lokasi Provinsi lawa Barat Jawa Tengah KecamatanIDesa Gejala

Barusireum Vt, Cp, B Boyolali Vt, Cp, YI Vt, Cp, YI, Dk, Ms Sawangan 1.1 Sawangan 1.2 Vt, Cp, Dk Vt, Cp, YI, Dk, Kr Sawangan 2 Kopeng I Vt, Cp, YI Vt, Cp, Dk, Ms Kopeng 2 Vt, Cp, YI, Dk Kopeng 3 Kaliurang Vf, Cp, YI Daerah lstimewa Yogyakaria Kulonprogo Vt, Dk, Ms, Kr Vt, Cp, Dk Bantul 1 Bantul 2 Vt, Dk, YI, Md Vt: Penebalan tulang d m anak tulang daun, Cp: cupping, B: Lamina d a m berkerut, YI: Lamina daun kuning, Dk: Daun menjadi kecil, Ms: Mosaik, Kr: Daun keriting, Md: Tcpi daun melengkung ke atas atau ke bawah

Gejala Infeksi Geminivirus pada Tanaman Tomat. Pengumpulan tanaman tomat yang diduga terinfeksi geminivirus dilakukan melalui survei ke beberapa pertanaman tomat di Jawa Barat (Barusireurn), Jawa Tengah (Boyolali, Sawangan, dan Kopeng), dan DIY (Kaliurang, Kulonprogo, dan Bantul). Tanaman tomat yang diduga terinfeksi geminivirus menunjukkan gejala yang berbeda-beda (Tabel 1). Gejala yang umum terlibat berupa penebalan tulang dan anak tulang daun, penguuingan lamina dam, cupping, dan tanaman menjadi kerdil. Deteksi dan Identifikasi Geminivirus. TeknikPCR berhasil mengamplifikasi DNA geminivirus yang menginfeksi tanaman tomat dari Jawa Barat (Barusireum), Jawa Tengah (Boyolali, Sawangan 1.1, Sawangan 1.2, dan Sawangan 2) dan DIY (Kaliurang dan Kulonprogo) (Gambar I ) sedangkan tanaman tomat asal Kopeng (Jawa Tengab) dan Bantul (DIY) tidak berhasil diamplifikasi fragmen DNAnya. Fragmen DNA geminivirus yang berhasil diamplifikasi menggunakan sepasang primer universal geminivirus, PAL 1v 1978 dan PAR lc715. berukuran 1.6 kb.

Analisis Pola Enzim Restriksi. Hasil amplifikasi PCR menggunakan enzim BamHI, EcoRI, HindIII, dan PstI menurjukkan perbedaan pola pita pemotongan fragmen DNA. Adanya perbedaan pola pita hasil pemotongan tersebut menunjukkan adanya perbedaan strain (galur) geminivirus, yaitu isolat geminivirus dari Sawangan 1.1, Sawangan 1.2, dan Sawangan 2 sama galumya dengan isolat Kaliurang (DIY) (Gambai-2). Keempat isolat tersehut berbeda galurnya dengan isolat geminivirus dari Kulonprogo (DIY), Boyolali (Jawa Tengah), dan Barusireum (Jawa Barat) sedangkan isolat geminivirus Kulonprogo (Gambar 3), Boyolali (Gambai-4), dan Barusireum (Gambar 5) masing-masing mempunyai pola pita yang berbeda dan menunjukkan galur yang berbeda. Kekerabatan Beberapa G a l u r Geminivirus yang Menginfeksi Tomat. Analisis pengelompokan berdasarkan pada hasil pemotongan fragmen DNA dengan enzim BamHI, EcoRI, HindIII, dan PstI menunjukkan bahwa pada nilai koefisien jarak 7.20 geminivirus yang menginfeksi tanaman tomat terbagi menjadi dua kelompok (Gambar 6). Kelompok pertama adalab geminivirus yang ditemukan menginfeksi tanaman tomat yang ada di daerah Jawa Tengah (Sawangan 1.1, Sawangan 1.2, Sawangan 2, dan Boyolali), Jawa Barat (Barusireum), dan DIY (Kaliurang dan Kulonprogo) sedangkan kelompok kedua menunjukkan geminivirus yang menginfeksi tanaman tomat di daerah Jawa Barat (Bandung, Cisaat, Cibeunying, Ciloto) (Sudiono et al. 2001). Hasil pengelompokan tersebut menunjukkan adanya keragaman geminivirus yang menginfeksi tanaman tomat dan membuktikan babwa teknik PCR-RFLP dapat digunakan untuk menentukan tingkat keragaman geminivirus yang menginfeksi tanaman.

Keragaman gejala infeksi geminivirus pada tanaman tomat yang ditemukan di lapangan menunjukkan adanya perbedaan jenis tanaman tomat, umur tanaman yang terinfeksi, galur virus, dan faktor lingkungan. Sugiarman dan Hidayat (2000) melaporkan waktu munculnya gejala pada enam kultivar tomat

32

AIDAWATI ET AL Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB. 1983. A plant DNA minipreparation: Version 11. Plant Mol Biol Rep 1:19-21. Gilbertson RL, Hidayat SH, Martinez RT. 1991. Differentiation of bean-infecting geminiviruses by nucleic acid hybridization probes and aspects of bean golden mosaic in Brazil. Plml Dis 75:336-342. Hidayat SH el ol. 1993. Complete nucleotide sequences of the infectious cloned DNAs of bean dwarf mosaic geminivirus. Phylopolholog;, 83:181-187. Hidayat SH, Rusli ES, Aidawati N. 1999. Penggunaan primer universal dalam polymerase chain reaction untuk mendeteksi virus gemini pada cabe. Di dalam: Prosiding Seminar llmiah don Kongres Nasionol XV Perhimpunon Fitopolologi Indonesia. Purwokerto, 16-18 Sep 1999. hlm 355-359. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J . 1989. Molecular cloning: a laboratorium manual. New York: Spring Harbor Laboratory Pr. Matthews REF. 1992. Foundamental of Plant Virology. California: Academic PI. Mehta PJ, Wayman JA, Nakhla MK, Maxwell DP. 1994. Polymerase chain reaction of viruliferous Bemisia lobaei (Homoptera: Alevrodidae) with two tomato-infectinf: . .geminiviruses. J Econ ~n;omol 8711285-1290. Momol MT el a1 1999. First report of tomato yellow leaf curl virus in tomato in south Georgia. Plant Dis 83:487. Navot N, Ber R, Czosnek H. 1989. Rapid detection of tomato yellow leaf curl virus in squashes o f plants and insect vectors. Phytopathology 79:562-568. Polston JE, Al-Musa A, Perring TM, Dodds JA. 1990. Association of nucleic acid of squash leaf curl geminivirus with the whitefly Bemisia toboci. Phytopafhology 80:850-856. Polston JE, Anderson PK. 1997. The emergence of whitefly-transmitted geminiviruses in tomato in Western Hemisphere. Plant Dis 81:1358-1369. Polston JE, Dodds JA, Perring TM. 1989. Nucleic acid probes for detection and strain discrimination of cucurbit geminiviruses. Phyropofhology 79:1123-1127. Roberts IM, Robinson DJ, Harrison BD. 1984. Serological relationship hnd genome homologies among geminiviruses. Ann Appl Biol 105:483-493. Rojas MR, Gilbertson RL, Russell DR. Maxwell DP. 1993. Use Of degenerate primers in the Polymerase Chain Reaction to detect whitefly-transmitted geminiviruses. Planf Dis 77340.347. Roye ME, Mclaughlin WA, Nakhla MK, Maxwell DP. 1997. Genetic diversity among geminiviruses associated with the weed species Sida spp., Macroptilium lathyroides, and Wissadula ompltssima from Jamaica. Plan1 Dis 81:1251-1258. Sudiono, Hidayat SH, Suseno R, Sosromarsono S . 2001. Deteksi molekuler dan uji kisaran inang virus gemini asal tomat. Di dalam: Prosiding Seminar llnrioh dan Kongres Nasionol XYI Perhimpunan Fitopotologi Indonesia. Bogor, 22-24 Agu 2001. hlm 208-217. Sugiorman, Hidayat SH. 2000. Evaluasi ketahanan beberapa kultivar tomat (Lycopersicon esculentum Mill.) terhadap infeksi virus gemini. Hayofi 7:113-I 16. Sulandari S. 2004. Karaltterisasi biologi, serologi dan analisis sidik jari DNA virus penyebab penyakit daun keriting kuning cabai [Disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, lnstitut Pertanian Bogor. Wyatt SD, Brown JK. 1996. Detection of subgroup I11 geminiviruses isolates in leaf extracts by degenerate primer and polymerase chain reaction. Phytopalhology 86:1288-1293.

Selatan dan Florida Utara setelah dipotong dengan enzim EcoRl dan Cia1 polanya sama dengan tanaman tomat yang terinfeksi TYLCV, tetapi berbeda dengan tomato mottle virus (ToMoV) (Momol et al. 1999). Hidayat el ul. (1999) melaporkan bahwa pola empat enzim restriksi (BamHI, EcoRI, HindIII, dan Pstl) virus cabai-Cugenang berbeda dengan virus cabaiSegunung, tetapi sama dengan virus cabai-Baranangsiang. Dengan metode yang sama, Sudiono et al. (2001) berhasil menganalisis pola enzim restriksi dari fi'agmen DNA hasil amplifikasi dengan PCR dan menunjukkan adanya galur geminivirus yang berbeda pada tanaman tomat. Galur geminivirus dari Bandung, Cisaat, dan Cibeunying berbeda dari gemhivirus dari Ciloto. Sulandari(2004) melaporkan galur geminivirus yang sama dari cabai Yogyakarta, Lembang, dan Cugenang, tetapi ketiga galur tersebut berbeda dari cabai Segunung. Galw geminivirus cabai Segunung tersebut berbeda dengan galur gemhivirus cabai Segunung yangtelah dilaporkan oleh Hidayat et al. (1999). Hal tersebut membuktikan bahwa di daerah yang sama terdapat galur geminivirus yang berbeda. Mengingat tingginya keragaman geminivirus yang menginfeksi tanaman tomat yang ada di Indonesia maka analisis sekuen DNA sangat perlu dilakukan untuk mengetahui kekerabatan galur geminivirus tomat Indonesia khususnya. Dengan diketahuinyahubungan kekerabatan galur geminivirus tersebut maka strategi pengendalian penyakit dapat disusun dengan tepat.
UCAPAN TERIMA KASM

Pentllis mengucapkan terima kasih kepada Sri Sulandari dalam survei pengumpulan isolat geminivirus di Daerah IstimewaYogyakarta dan Jawa Tengah. D m A R PUSTAKA
Aidawati N, Hidayat SH, Suseno R, Sosromarsono S. 2002. Transmission of an Indonesian isolat of Tobacco leaf curl virus (Geminivirus) by Bemisia tobaei Genn. (Hemiptera:Aleyrodidae). Plonl Pofhol J 18:231-236. Agrios GN. 1997. Plont Pathology. Ed ke-4. California: Academic Pr. Behjatnia SAA el 01. 1996. New potato spindle tuber viroid and tomato leaf curl geminivirus strains from a wild Solanam sp. Phytopathology 86:880-886. Bendahmane M, Schalk HJ, Gronenborn B. 1995. Identification and characterization of wheat dwarf virus from France using a rapid method for geminivirus DNA preparation. Plgvroporhology 85:1449-1455. Bock KR. 1982. Geminivirus diseases. Plan1 Dis 66:266-270. Chiemsombat P, Kositratana W, Attathom S, Sutabutra T, Sae-aung N. 1990. DNA probe and nucleic acid hybridization for plant virus detection. Koselsorf J (Not Sci Strppo 24:12-16.