TEORI PEMISAHAN DAN TEORI KOLOM

(Disusun Untuk Memenuhi Salah Satu Tugas Praktikum Fitokimia)

Disusun oleh :
DESTIANA PURNAMA
260110140097

DEPARTEMEN BIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2016

Daya pisah
Tujuan kromatografi ialah memisahkan komponen cuplikan dalam waktu
yang masuk akal, menjadi pita atau puncak, ketika cuplikan itu bergerak melalui
kolom. Daya pisah R, antara dua puncak dapat diukur secara kuantitatif seperti
ditunjukkan dalam persamaan 2.1

R=

t R 2tR 1
w 2w 1
2

2t
w 2+w 1

(2.1)

Harga tR2 dan tR1 adalah waktu tambat komponen, dukur pada titik
maksimum puncak dan t dalah selisih antara tR2 dan tR1. Harga w2 dan w1 ialah
lebar alas puncak, dinayatakan dalam satuan waktu seperti tampak pada gambar 2.2.
jika puncak terelusi dengna waktu tambat yang serupa, biasanya lebar alas puncak
hampir sama. Dalam hal seperti ini kita dapat menghitung r dengan persaman 2.2.

Gambar 2.2 Definisi daya pisah

Persamaan berlaku jika satuan untuk waktu dan lebar alas sama, misalnya
menit, cm, dll. Gambar 2.3 menunjukkan bahwa harga daya pisah bergantung pada
factor: lebar puncak dan jarak antara maksimum puncak.

Gambar 2.3 Daya pisah dan keefisienan lawan daya pilih

Jika daya pisah 0,4 atau lebih kecil, puncak tidak menunjukkan secara jelas
adanya dua komponen atau lebih. Akan tetapi, jika daya pisah 0,5 atau lebih,
kromatografiawan dapat mengidentifikasi jumlah komponen yang ada denga jelas.
Dengan cara itu, kita dapat menghitung dengan cepat panjang kolom yang diperlukan
untuk mencapai daya pisah yang diperlukan untuk pekerjan kualitatif atau kuantitatif.
Dalam hal ini, diperlukan daya pisah sekitar 1,0 untuk melihat bukti yang
jelas mengenai adanya dua komponen.
Koefisien kolom
Jika koefisien rendah, kita dapat memperbaiki daya pisah dengan
memperbaiki koefisien itu, yang dapat diukur secara kuantitatif seperti pada
persamaan berikut

N=

tR 2
tR 2
tR
=16
=5,5

w
w 1 /2

( ) ( )

(Johnson, 1991).

Persamaan ini membandingkan lebar puncak dengan lamanya komponen

berada dalam kolom (waktu huni). Harga N yang dihitung dengan persamaan

tersebut, disebut jumlat pelat teori.

Nilai N dapat dihitung dengan membagi waktu

tambat dengan simpangan baku puncak, atau dengan lebar puncak pada setengah
tinggi, W1/2 atau dengan lebar puncak yang ditentukan dengan memperpanjang garis
singgung puncak sampai memotong garis alas, w (Johnson, 1991).

Semua faktor yang terdapat di depan hasil bagi diturunkan dari faktor statistik
yang mengaitkan ukuran puncak ini dengan bentuk puncak Gauss. Jumlah pelat teori
berbanding lurus dengan panjang kolom. Umumnya kolom yang lebih panjang
mempunyai jumlah pelat yang lebih banyak, tetapi penurunan tekanannya pun lebih
besar. Tinggi atau jarak yang setara dengan pelat teori, H atau HETP, merupakan
ukuran koefisienan kolom yang lebih disukai karena memungkinkan perbandingan
antara kolom yang panjangnya berlainan
H = HETP =

L
N

L adalah panjang kolom dan N adalah jumlah pelat teori. Kolom untuk kromatografi
cair berkecepatan tinggi biasanya mempunyai tinggi pelat dalam rentang 0,01 sampai
10 mm. Kolom yang baik memiliki nilai H yang lebih kecil (Johnson, 1991).
Pelebaran pita atau daerah bersumber pada tiga hal utama : (1) neka-alur
linarut melalui kemasan kolom; (2) difusi molekul; (3) pengaruh alih massa antara
fase diam dan fase gerak.

Neka-alur
Kecepatan zat cair yang bergerak melalui penampang garis tengah kolom
dapat berbeda secara berarti, bergantung pada struktur penyangga padat dalam kolom
(Johnson, 1991).

Gambar 2.7 Keragaman kecepatan aliran zone

Kecepatan rata-rata linarut menentukan waktu tambatnya. Pelebaran pita
disebabkan oleh kecepatan aliran yang berbeda ketika melalui kolom. Peranan nekaalur ini ditunjukkan pada persamaan 2.5.
H p=2 d p
Hp

= tinggi pelat yang setara dengan pelat teori yang disebabkan oleh keragaman
dalam laju aliran melalui kolom

dp

(2.5)

= garis tengah partikel

= tetapan yang harganya mendekati 1.

Harga dapat diperkecil dengan menggunakan partikel yang sebaran ukurannya

sempit dan dengan cara mengemas kolom secara baik. Dengan tingkat teknologi
masa ini, harga

Hp

adalah 10%-50% dari harga total H.

Difusi Larut
Difusi merupakan cara molekul cara molekul yang kita kenal untuk terdispersi
atau bercampur, seperti ditunjukan gambar 2.8.

Gambar 2.8 Pelebaran zona karena difusi memanjang

Dalam hal ini, molekul yang semula membentuk pita yang sempit berdifusi ke
dalam pelarut di sekelilingnya dan melebarkan profil pita. Pada prinsipnya, difusimemanjang (sepanjang sumbu kolom yang panjang) dapat terjadi, baik dalam fase
diam maupun dalam fase gerak, tetapi karena lajunya dalam fase diam begitu kecil,
faktor ini dapat diabaikan. Pelebaran pita yang disebabkan oleh difusi-memanjang
cuplikan di dalam fase gerak dinyatakn dalam persamaan 2.6.
Hd=

Dm
V

2 Dm
v

= koefisien difusi linarut di dalam fase gerak

= kecepatan aliran dalam cm per detik

(2.6).

Hd

menyatakan besarnya sumbangan kepada HETP yang disebabkan oleh

difusi-memanjang molekul linarut. Faktor kelikuan dinyatakan dengan

, dan ini

berkaitan dengan derajat kemasan kolom dalam membatasi difusi. Harganya biasanya
kurang dari 1.
Persamaan untuk pelebaran pita dalam KG sama dengan persamaan dalam KC,
tetapi besarnya difusi molekul di dalam zat cair sekitar
dalam fase gas. Oleh karena itu,

Hd

105

besarnya difusi di

jarang menjadi faktor yang berarti dalam

pemisahan secara kromatografi cair berkecepatan tinggi. Akan tetapi, beberapa hal
dapat dilakukan untuk meminimumkan

Hd

. Misalnya, pemakaian partikel kecil

yang seragam untuk kemasan kolom akan memperkecil faktor kekuatan

, karena

difusi dihambat. Laju aliran yang tinggi akan memperkecil waktu huni di dalam
kolom dan ini pun memperkecil

Hd

. Akan tetapi, pada laju aliran yang tinggi ini

terjadi pelebaran pita yang disebabkan oleh alih massa. Pelebaran pita yang
disebabkan oleh difusi molekul jarang menjadi faktor penting dalam menurunkan
koefisien kolom KC.
Kinetika Alih Massa Antara Fase Diam dan Fase Gerak
Laju pergerakan molekul cuplikan dalam fase diam dan fase gerak, biasanya
disebut kinetika alih massa, dapat menjadi penyebab pelebaran pita yang dominan
dan karena itu menentukan koefisien kolom. Seperti yang ditunjukan dalam gambar
2.9.

Gambar 2.9
Ketika berada dalam fase diam, molekul itu ditahan dan tertinggal di belakang
pusat pita ketika pusat pita itu bergerak terus ke ujung kolom. Ketika berada dalam
fase gerak, molekul bergerak bersama-sama dengan fase gerak. Kecepatannya lebih
besar daripada pusat pita karena kecepatan aliran selalu lebih besar daripada
kecepatan pita. Peralihan acak keluar-masuk fase diam dan fase gerak ini
menyebabkan dispersi dalam puncak kromatografi karena sejumlah molekul secara
kebetulan bergerak di depan molekul rata-rata dan molekul lainnya bergerak lebih
lambat dari molekul rata-rata. Dispersi atau pengenceran puncak kromatografi
diminimumkan

dengan

cara

memilih

kondisi

sedemikian

rupa

sehingga

ketidaksetimbangan diperkecil dan laju pertukaran dimaksimumkan.

Fase diam dan fase gerak keduanya berperan dalam menentukan laju alih
massa. Sesuai dengan itu, ada dua suku yan menjadi penyebab dispersi daerah; satu
suku untuk fase diam dan sukku yang lain untuk fase gerak. Pelebaran pita yang
disebabkan oleh fase diam,

Hs

dinyatakan dengan persamaan 2.7.

H s=

QR d 2 v
Ds
(2.7).

= faktor konfigurasi yang bergantung pada bentuk genangan fase diam dan
faktor lain

= tetapan yang bergantung pada laju perpindahan nisbi linarut dalam fase gerak

= tebal lapisan fase diam

Ds

= koefisien difusi linarut dalam fase diam

= kecepatan aliran zat cair melalui kolom

Gambar 2.10 Perbandingan kolom kemas

Tetapan lain dalam persamaan 2.7, Q dan R, pada hakikatnya ditentukan oleh
sifat kemasan kolom. Tidak banyak yang dapat dilakukan mengenai hal itu. Dengan
berkembangnya kemasan kolom lapis tipis, atau kemasan pelikel pengaruh nisbi H s
menurun, yaitu dari suku yang menentkuan keefisienan menjadi suku yang kecil
artinya.
Fase gerak memainkan peranan penting pula dalam menentukan pelebaran
pita sebuah puncak, seperti yang ditunjukkan dalam persamaan 2.8.
Hm = dp2 v/Dm
(2.8).
dp

= garis tengah partikel

Dm

= koefisien difusi linarut dalam fase gerak

= kecepatan aliran
Persamaan ini menunjukkan bahwa pelebaran pita yang disebabkan oleh fase

gerak merupakan fungsi dari , yaitu koefisien kolom yang ditentukan oleh struktur
kemasan (garis tengah kolom dan bentuk kolom). Koefisien kolom, , menurun jika
kemasan kolom disusun secara teratur dan ketat. Koefisien ini serupa dengan pada
persamaan 2.5.
Jika molekul berada dalam rongga besar fase gerak, diperlukan waktu lama
sebelum molekul tersebut berdifusi ke sisi rongga untuk bersentuhan dengan fase
diam. Akan tetapi, jika ukuran rongga itu diperkecil, jangka waktu antara dua
sentuhan dengan fase diam berkuran secara berarti. Ini ditunjukkan dalam persamaan
2.8.
Pelebaran Pita Total untuk Kolom Kromatografi Cair
Masing-masing suku yang dibahas di atas digabung untuk memperoleh tinggi
pelat kolom total H, seperti yang tampak pada persamaan 2.97.
H = Hp + Hd + Hs + Hm
(2.9).
Bentuk yang diperluas ditunjukkan pada persamaan 2.10
H = 2 dp + 2 Dm/v +qrd2 v/Ds + dp2 v/Dm
(2.10).
Suku pertama dan suku terakhir sangat penting dan menentukan kemasan
kolom modern. Keduanya mengandung garis tengah partikel, dp, sebagai factor. Ini
dapat menjelaskan mengapa begitu banyak penekanan pada pembuatan kolom dengan
ukuran partikel 5-10. Perbaikan keefisienan kolom dengan menurunnya garis tengah

partikel ditunjukkan pad agambar 2.12. Walaupun ada teori kromatografi yang
memprakirakan adanya peningkatan keefisienan dengan bertambahnya kecilnya
ukuran partikel, di masa lalu kolom jarang dikemas dengan kemasan yang bergaris
tengah lebih kecil dari 40 . Kemudian ditunjukkan bahwa hal ini disebabkan oleh
belum ditemukannya cara yang tepat untuk mengemas kolom dengan partikel
berukuran lebih kecil. Pengembangan cara kemas-lumpuran kerapatan-imbang oleh
Majors9 menghasilkan secara taat asas kolom mikropartikel yang jauh lebih efisien
daripada yang dihasilkan oleh kolom sebelumnya. Ini ditunjukkan berupa garis lurus
pada gambar 2.12.
Persamaan 2.9 dan 2.10 memperlakukan penyebab pelebaran pita yang
terpisah itu seakan-akan masing-masing berdiri sendiri-sendiri. Dalam praktek,
terdapat penggandengan antarsuku, yang bertindak memperkecil ketergantungan
persamaan ini pada aliran. Karena alasan tersebut, biasanya terdapat penurunan
kinerja kolom yang lebih kecil pada laju aliran yang tinggi daripada yang
diprakirakan oleh teori yang disederhanakan.

Gambar 2.11(13) Perbandingan antara silica 10 dan silica 5 .

Tinggi daripada yang diprakirakan oleh teori yang disederhanakan. Hal ini
ditunjukkan dalam gambar 2.13 yang menunjukkan bahwa tinggi pelat untuk
kecepatan fase gerak yang lebih tinggi lebih cenderung tetap. Ini berarti kita sering
dapat menghemat waktu analisis dengan meningkatkan laju aliran tanpa kehilangan
daya pisah terlalu besar, seperti yang digambarkan dalam gambar 2.14. Penurunan
daya pisah yang kecil, yang disebabkan oleh pelaksanaan kromatografi pada laju
aliran yang tinggi, dapat diatasi dengan memanjangkan kolom sedikit. Dalam gambar
2.14, laju aliran telah diperbesar lima kali untuk menghemat waktu. Penurunan daya
pisah yang disebabkan oleh penurunan keefisienan kolom hanya sedikit saja.

Kondisi (gambar 2.14)

Kolom

: 3 berurutan, masing-masing 10 m x 2,4 mm; CPG-75, CPG-240;

CPG-700

Pengelusi

: diklorometana pada laju aliran dan tekanan yang ditunjukkan

Detektor

: varian 254 nm

Cuplikan

: polistirena baku :

1. BM 1.800.000
2. BM 92.000
3. BM 4.000

Pelebaran pita total dalam kromatografi cair

Pelebaran pita dapat pula terjadi di dalam injector, detector dan pipa penyambung,
keseluruhannya diberikan dalam persamaan 2.11. Pelebaran pita adalah pangkat dua
dari jumlah pelebaran pita masing-masing komponen pangkat dua.
WT2 = Wi2 + Wf2 + We2 + Wd2 + Wc2
(2.11).
Wi2

= pelebaran pita dalam suntik

Wf2

= pelebaran pita tampuk (fitting) yang terletak dalam saluran setelah injector
dan sebelum detector

We2

= pelebaran pita saluran penyambung

Wd2

= pelebaran pita karena system detector

Wc2

= pelebaran pita yang disebabkan oleh kolom

Pada kromatograf yang dirancang dengan baik, pengaruh bagian nonkolom dari
instrument, atau pengaruh luar kolom, diusahakan seminimum mungkin.
Daya Pilih Kolom
Cara lain memperbaiki daya pisah dalam pemisahan secara KCKT ialah
mengubah daya pilih kolom. Ini dapat dilakukan dengan mengubah fase diam
dan/atau fase gerak. Daya pilih kolom terhadap cuplikan merupakan fungsi
termodinamika proses pertukaran. Sudah tentu keefisienan merupakan fungsi dari
kinetika pertukaran tersebut.
Daya pilih kolom, , diukur dengan memisahkan puncak nisbi,
dan dinyatakan dengan:

tR 2tm t ' R 2 K 2
=
=
tR 1tm t ' R 1 K 1
(2.12).

tR1

= waktu tambat komponen 1

tR2

= waktu tambat komponen 2

tm

= waktu tambat komponen yang tidak ditahan (garis depan

pelarut)

tR1

= waktu tambat yang diseduaikan untuk komponen 1

tR2

= waktu tambat yang diseduaikan untuk komponen 2

K1

= koefisien distribusi komponen 1

K2

= koefisien distribusi komponen 2

Daya pilih kolom dihitung dengan mengukur waktu tambat puncak

yang ditahan, dikurangi dengan waktu tambat puncak yang tidak
ditahan, seperti ditunjukkan gambar 2.15.

Volume atau waktu yang sesuai dengan volume mati sistem. V m,

dapat ditentukan dengan beberapa cara:
Cara 1 Vm adalah sekitar 50% volume kolom, dihitung dari Vm

8 103 (garis tengah kolom dalam mm)(panjang kolom dalam

mm)
Cara 2 Vm dapat diukur dengan menyuntikkan senyawa yang tidak
ditahan oleh kolom, pada kondisi yang dipakai untuk pemisahan.
Misalnya, karena deuterium oksida tidak ditahan oleh kolom dalam

KC fase-balik, senyawa itu dapat dipakai sebagai senyawa uji untuk

mengukur Vm debgan detektor indeks bias. Dengan demikian juga,
sikloheksana dapat dideteksi dengan detektor indeks bias dalam
kromatografi penjerapan ragam normal, terutama jika pelarutnya
hidrokarbon alifatik C6 dan lebih tinggi.
Koefisien distribusi sama dengan konsentrasi linarut di dalam fase
diam dibagi dengan konsentrasi linarut di dalam fase gerak.
Koefisien distribusi sering disebut:
Koefisien partisi pada kromatografi cair partisi;
Koefisien permeasi pada kromatografi ekslusi;
Koefisien penjerapan pada kromatografi cair penjerapan;
Koefisien distribusi pada kromatografi pertukaran ion.
Volume elusi pita, VR (VR =tR x laju aliran)dalam kromatografi cair
dinyatakan dengan
VR = Vm + KVs
Vm

= volum ruang-antara fase gerak dan volume mati instrumen

= tm x laju aliran

KVs

(2.13).

= volum fase diam (partisi),

volum pori (eksklusi),
luas permukaan (penjerapan), atau
kemampuan pertukaran ion (pertukaran ion)

Persamaan 2.13 menunjukkan bahwa volum lambat linarut

sama dengan volume tambat komponen yang tidak ditahan V m
ditambah volum vase gerak tambahan yang diperlukan untuk
mengelusi komponen (KVs). Harga K besar berarti akvitas linarut
besar terhadap fase diam dan menyebabkan waktu tambat linarut
lebih panjang. Koefisien distribusiatau tetapan kesetimabangan
cukup peka terhadap suhu.
Daya pilih kolom diperbaiki dengan cara mengubah koefisien
distribusi K dan/atau volum vase diam V s. koefisien distribusi diubah
sebagai berikut:
1. Mengubah fase gerak. Misalnya, meningkatkan kepolaran, pH,
dan/atau kekuatan ion. Ini prinsip yang dipakai dalam elusi
landaian.
2. Mengubah fase diam. Misalnya mengubah ukuran pori gel,
mengubah permukaan penjerap, mengubah zat cair yang
dipakai sebagai fase diam.
3. Mengubah suhu. Kadang-kadang kita dapat mengubah daya
pilih kolom dengan mengubah suhu. Prngsruh terbesar
ternyata pada kromatografi pertukaran ion dan kromatografi
eksklusi, walaupun pengaruh suhu, yang lebih kecil, penting
pula dalam KCP dan KCC. Lebih sering, semua molekul
menunjukkan penurunan waktu tambat atau volume elusi
yang sama pada peningkatan suhu, sehingga kuranglah
menarik memperbaiki pemisahan dengan pemrograman suhu.
Pengendalian suhu penting dalam memperbaiki keterulangan
pemisahan.
4. Mengubah sifat linarut. Misalnya, menghilangkan muatan
asam

amino

dengan

mengubah

pH

fase

gerak

untuk

mengurangi afinitas terhadap damar penukar ion atau dengan

membentuk pasangan ion.
Umumnya,

perubahan

laju

aliran

atau

tekanan

kolom

tidak

berpengaruh pada daya pilh kolom.

Faktor Kapasitas Kolom, K
Daya pisah merupakan fungsi dari nisbah volum fasa gerak
dan volum fasa diam didalam kolom. Nisbah ini, disebut faktor
kapasitas, dinyatakan dengan persamaan:
KV s V RV m TRTm
k V m = Vm = Tm
(2.14).
Harga k yang kecil menunjukkan bahwa komponen ditahan sedikit
oleh kolom dan terelusi dekat dengan puncak yang idak ditahan. Ini
menghasilkan pemisahan yang jelek, seperti ditunjukkan dalam
gambar 2.16 dan 2.17, karena fase diam tidak terpakai sepenuhnya
pada konsentrasi metanol yang lebih tinggi.
Harga

yang

besar

memperbaiki

pemisahan

tetapi

menyebabkan waktu analisi panjang dan puncak lebar sulit

dideteksi. Faktor ini penting pada KCKT karena beberapa penelitian
menunjukkan bahwa kolom KC paling efisien untuk senyawa dengan
harga k antar 2 dan 611. Akan tetapi, berdasarkan kepraktisan,
dipakai harga k mulai dari 1 sampai 15.

Mencapai Daya Pisah: Keefisienan, Daya Pilih, dan Faktor

Kapasitas
Persamaan 2.1, 2.3, 2.11, dan 2.13 dapat digabung menghasilkan
persamaan yang mengaitkan daya pisah dengan keefisienan , daya
pilih, dan faktor kapasitas;
'

( )( k k+1 )

1
1
R 4 N

'

(2.15).
a

= suku keefisienan kolom

= suku daya pllih kolom

= suku faktor kapasitas

Misalnya, andaikan daya pisah yang diinginkan 1,25 dan daya pisan yang diperoleh
0,6.
Panjang kolom yang diperlukan

pisah yang diinginkan

( Daya
Daya pisan yang diperoleh )

( 1,25
0,6 )

=4
Artinya, panjang kolom harus diperbesar 4 kali untuk mencapai daya pisah
yang diinginkan.
Persamaan 2.15 dapat juga disusun kembali untuk menghitung jumlah pelat
yang diperlukan (Nper) untuk mencapai daya pisah yang diinginkan, R, dengan
kolom dan cuplikan yang didefinisikan oleh k dan .

Nper = 16R

k ' +1
k'

(
( ) 1 )
(2.17)

Dengan menggunakan hara Nper dan harga kira-kira H yang diharapkan, kita
dapat menghitung panjang kolom yang diperlukan untuk mencapai pemisahan.
L = (HETP)(Nper)
Ini dapat membantu kromatografiwan memilih panjang baku kolom yang optimum
untuk memnuhi keperluannya.
Penuntun praktis memilih parameter kolom
Ada tiga kualitas pemisahan secara kromatografi, yaitu daya pisah, kecepatan
dan kapasitas. Kapasitas kolom penting jika kita ingin mengumpulkan senyawa yang
terpisah untuk percobaan selanjutnya atau untuk diidentifikasi. Batas deteksi
beberapa detektor yang rendah merupakan kendala pula pada penentuan ukuran
minimum cuplikan.
Panjang kolom
Panjang kolom merupakan parameter rancang yang penting. Menduakalikan
panjang kolom mengakibatkan waktu tambat dan daerah pemisahan menjadi dua kali
semua. Akan tetapi, dara pisan hanya berbanding lurus dengan akar panjang kolom
karena pelebaran pita meningkat pula. Ini dapat ditunjukkan dengan mengacu pada
persamaan 2.19.
Tabel 2.2 Rancangan dan kerja kolom pada kromatografi cair analitik
Parameter rancangan
Panjang,cm

KCKT analitik
25-100

Preparatif (Kapasitas
cuplikan tinggi)
25-200

Garis tengah dalam, mm

2-4

~8 mm

Bentuk

Lurus

Lurus

Garis tengah, mikrometer

5-40

10-20

Luas permukaan

menengah sampai tinggi

tinggi

Penyangga

Atsiri
Fase gerak

Tidak kental

Mutu spektroskopi

Mutu spektroskopi
Fase diam

Fasa terikat bahan tinggi

Partisi

Film tipis

Luas permukaan besar

Penjerapan

Aktivitas seragam

Kapasitas tinggi,

Pertukaran ion

Film tipis

sambungan silang rendah

Gel berpori

Eksklusi
Parameter kerja
Landaian

Gel kaku
Cuplikan rumit saja

Cuplikan rumit saja

Laju aliran, ml/jam

30-120

200-400

Tekanan, psig

500-5000

500-5000 psi

Suhu

Optimumkan untuk

Naikkan untuk kelarutan

kerulangan dan daya pisah

0,050 sampai 500 seringkali
Ukuran cuplikan, g

lebih tinggi daripada

Sampai 500 mg per

optimum

penyuntikan

N = 16

( tRw )

L
H

(2.19)

Karena t dan At berbanding lurus dengan L, dan t/w berbanding lurus dengan
L, maka ini berarti w berbanding lurus dengan L. Karena itu, daya pisah
dinyatakan dengan

R=

t
w

L
L L (2.20)

Panjang kolom KCKT biasanya berkirsar antara 25 sampai 100 cm,

ditentukan oleh daya pisah yang diperlukan, tekanan dan/atau kendala waktu, dan
oleh persyaratan ukuran cuplikan. Misalnya, kolom berkapasitas rendah sering
dibebani secara berlebih karena batas deteksi minimum detektor jelek.
Garis

Tengah

Kolom

Garis tengah kolom untuk KCKT berkisar antara 2 sampai 4 mm (garis tengah dalam)
untuk pemisahan analitik, dan 8 sampai 10 mm untuk pekerjaan preparatif dengan
ukuran cuplikan mulai 10 sampai 1000 mg.
Kapasitas cuplikan kolom berbanding lurus dengan garis tengah pangkat dua,
tetapi ketidaksamaan aliran dan kesukaran pengemasan dapat menghambat
peningkatan yang tak berhingga. Batas atas praktis untuk kolom yang dipakai pada
kromatograf

analitik

adalah

sekitar

12

mm

garis

tengah

dalam.

Bentuk Kolom
Kolom bergaris tengah kecil yang dipakai dalam KCKT daoat dibengkoklingkarkan asal saja perbandingan jari-jari lingkar terhadap jari-jari kolom lebih besar
dari 130 (untuk meminimumkan 'pengaruh jalur balap'). Kolom bergaris tengah besar
yang

dipakai

Penyangga

untuk

pemisahan

preparatif

tidak

boleh

dibengkokkan.

Padat
Garis tengah partikel bergantung pada jenis penyangga yang dipakai.

Pendekatan pertama yang menggunakan partikel berpori kecil, dengan garis tengah
10m. Pendekatan kedua menggunakan partikel penyangga tak berpori yang dilapisi
lapisan tipis berpori yang mengandung fase diam, atau damar penukar ion. Kita dapat

memakai kolom yang lebih panjang karena penurunan tekanan lebih kecil. Penurunan
tekanan yang kecil ini disebabkan oleh ukuran partikel lapisan berpori ini lebih besar.
Daya pisah dan kapasitas diperbaiki dengan memakai partikel penyangga yang lebih
kecil yang sesuai dengan cara pengemasan. Penyangga yang luas permukaannya
besar dan dilapisi film tipis menghasilkan daya pisah terbaik, sementara kecepatan
diperbaiki dengan dengan memakai penyangga yang luas permukaannya kecil dan
dilapisi film tipis. Kapasitas diperbesar dengan memperbesar luas permukaan.
Fase Gerak
Fase gerak harus selektif terhadap komponen, dan tidak kental agar dapat
memperkecil penurunan tekanan dan meningkatkan laju alih massa. Pada
kromatografi preparatif sering dipilih fase gerak yang atsiri untuk mempermudah
penghilangannya dari cuplikan. Kelarutan linarut merupakan pertimbangan yang lain,
terutama pada kromatografi preparatif.
Fase Diam
Sebelum ada kemasan kolom dengan dengan fase diam terikat, fase diam
disaputkan pada penyangga. Walaupun kemasan kolom yang disaputi ini sekarang
jarang dipakai, harus diingat bahwa fase diam tidak boleh larut dalam fase gerak.
Penjerap dalam kromatografi cair/padat harus menunjukan juga aktivitas permukaan
yang seragam untuk dapat mencegah pembentukan ekor dan penjerapan yang tak
terbalikan. Damar kolom penukar ion harus mempunyai sambung-silang yang
memadai untuk mencegah pemampatan pada tekanan tinggi. Gel kaku atau manik
dipakai pada kromatografi eksklusi agar tahan terhadap tekanan tinggi. Persyaratan
untuk daya pisah tinggi dan kecepatan serupa dengan persyaratan untuk KCKT.
Kapasitas yang tinggi dapat dicapai dengan memperbesar beban fase diam dan luas
permukaan. Gel berpori sering dipakai pada dipakai pada kromatografi preparatif
karena kapasitasnya tinggi, tetapi tekanannya harus dibatasi karena gel dapat
dimampatkan.

Elusi Landaian atau Pemrograman Pelarut

Landaian pelarut dipakai untuk memperpendek waktu analisis dan
mengoptimumkan pemisahan. Pemrogaman pelarut dianjurkan untuk cuplikan rumit
yang rentang koefisien distribusinya lebar. Untuk campuran sederhana, kecepatan dan
daya pusah terbaik diperoleh tanpa pemrogaman pelarut; pemrogaman ini dapat
menambah kerumitan dan biasanya dihindari pada kromatografi cair preparatif.
Anjuran terbaik ialah 'usahakan sesederhana mungkin'.
Pemrograman Aliran dan Laju Aliran
Pada umumnya, daya pisah dapat sedikit diperbaiki dengan menurunkan laju
aliran, sementara kecepatan yang tinggi diperoleh dengan menaikkan laju aliran.
Karena penyuntikan dapat dilakukan lebih banyak per satuan waktu, kita memperoleh
masukan/keluaran yang lebih tinggi jika kita bekerja pada laju aliran yang lebih
tinggi. Kromatigram yang diperoleh jika laju aliran dinaikkan dari 1 ml/menit
menjadi 5 ml/menit, yang dapat memendekan waktu pemisahan sampai 80% dengan
tidak banyak menurunkan daya pisah.

Garis tengah dalam kolom

2 mm
3 mm
4 mm
8 mm
10 mm

Laju aliran (ml/menit)

0,5 sampai 2
2
2 sampai 3
4 sampai 10
10 sampai 20

Tekanan Kolom
Penurunan tekanan P dinyatakan dengan

P=

Lv
2
d
p

= viskositas zat cair

L = panjang kolom
v = kecepatan aliran
dp= garis tengah partikel
= tetapan struktur nif-dimensi, besarnya sekitar 600 untuk kolom yang dikemas
dalam KC
Untuk jumlah pelat dan waktu pemisahan tertentu, tekanan yang diperlukan
sebenarnya menurun dengan menurunnya

garis tengah partikel kemasan kolom

sampai ke batas sekitar 1 jam.

Suhu kolom
Dalam beberapa hal, pengubahan suhu dapat pula mengubah daya pisah.
Dalam hal lain, suhu dapat pula dinaikkan untuk memperbesar kelarutan cuplikan. Ini
paling sering merupakan maslah pada kromatografi eksklusi polimer besar.
Menaikkan suhu dapat dapat meningkatkan koefisienan kolom dan
memperkecil penurunan tekanan, seperti ditunjukkan dalam gambar 2.20.
Ketidak-setangkupan puncak kromatografi
Teori kromatografi menganggap bahwa puncak terbentuk dengan ciri profil
konsentrasi seperti kurva Gauss. Dalam praktek, anggapan ini jarang terpenuhi,
terutama untuk puncak yang terbentuk oleh kolom yang dikemas dengan partikel
sekitar 10 m atau lebih kecil. Puncak tersebut sering muncul dengan ekor panjang,
dan juga, sangat sering, dengan bahu , seperti

Gambar 2.18 Tekanan kerja maksimum pompa kromatografi cair menurut tahun
pembuatan
Tampak dalam gambar 2.21. ketidak-setangkupan puncak, As, dapat dihitung dengan
persamaan 2.23
A 2s =

(ba)

(2.23).
b = jarak dari pusat puncak sampai ke tanggapan detector setelah puncak
a = jarak dari pusat puncak sampai ke tanggapan detector sebelum puncak, diukur
pada titik 10 % dari tinggi puncak
Sering kita menentukan a dan b secara teliti pada puncak yang berekor karena ekor
itu dapat mendekati garis alas secara asimtot. Oleh karena itu, a dan b sering diukur
pada titik 10 % dari tinggi puncak, seperti pada gambar 2.21. Kolom KC yang baik
biasanya menunjukakan ketidak-setangkupan, As, lebih kecil dari 2,5. Kolom dengan
harga As lebih besar dari 3 barangkali tak dapat dipakai untuk pekerjaan kuantitatif
karena kita sukar menentukan titik tempat tanggapan detector kembali ke alas. Jika
kromatografiwan mengemas sendiri kolomnya, ia harus mengukur

Gambar 2.19 faktor kapasitas sebagai fungsi dari suhu kolom untuk MicroPak-CH
ketidak-setangkupan masing-masing kolom stelah
membantunya untuk mengetahui apakah kolomnya baik.

pengemasan.

Ini

Gambar 2.20 Keefisienan dan penurunan tekanan sebagai fungsi dari suhu

akan

Ganbar 2.21 Definisi pengukuran ketidaksetangkupan (asimetri)