KROMATOGRAFI

Di susun oleh:
Rifal Iriansyah
Sintia Martina Lubis
Konsep Dasar Pemisahan dengan Kromatografi

o Metode pemisahan kromatografi didasarkan pada perbedaan distribusi

molekul-molekul komponen di antara dua fase (fase gerak dan fase diam)
yang kepolarannya berbeda.
o Apabila molekul-molekul komponen berinteraksi secara lemah dengan
fase diam maka komponen tersebut akan bergerak lebih cepat
meninggalkan fase diam.
o Keberhasilan pemisahan kromatografi bergantung pada daya interaksi
komponen-komponen campuran dengan fase diam dan fase gerak.
o Apabila dua atau lebih komponen memiliki daya interaksi dengan fase
diam atau fase gerak yang hampir sama maka komponen-komponen
tersebut sulit dipisahkan.
o Persyaratan utama kromatografi adalah :
• Ada fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam tidak boleh bereaksi
dengan fasa gerak.
• Komponen sampel (contoh) harus larut dalam fasa gerak dan
berinteraksi dengan fasa tetap (diam).
• Fasa gerak harus bisa mengalir melewati fasa diam, sedangkan fasa
diam harus terikat kuat di posisinya
o Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun
suatu sampel.
o Pemisahan pada kromatografi terjadi karena molekul sampel tertahan oleh
fase diam atau dibawa oleh fase gerak, tergantung dari afinitas senyawa
tersebut terhadap kedua fase ini.
o Distribusi dari molekul-molekul sampel diantara dua fase ditentukan oleh
tetapan kesetimbangan yang dikenal dengan koefisien distribusi (K) atau
koefisien partisi.
 𝑪𝒔
K=
𝑪𝒎
K = koefisien distribusi
Cs = konsentrasi sampel didalam fase diam (stationery phase)
Cm = konsentrasi sampel didalam fase gerak (mobile phase)

o Bila harga K besar berarti populasi molekul dalam fase diam lebih besar
dari pada fase gerak dan berarti rata-rata lebih lama tertahan dalam fase
diam.
o prinsip dari kromatografi adalah "LIKE DISSOLVED LIKE" dimana fasa
polar akan mengikat kuat senyawa polar dan fasa nonpolar akan mengikat
kuat senyawa nonpolar.
Istilah Dalam Kromatografi
 Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam
proses pemisahan dengan kromatografi. Karena dengan adanya interaksi dengan fase
diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa
analit. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) berbentuk molekul
kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.

 Fase bergerak (moving phase, mobile phase), merupakan pembawa analit, dapat bersifat
inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak tidak hanya berupa
cairan, tapi juga dapat berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier
gas senyawa mudah menguap (volatil).
Istilah Dalam Kromatografi
 Penyangga atau matrik (support), yaitu bahan padat yang digunakan pada
kromatografi untuk menahan fase diam yang berupa cairan atau gas supaya tidak
bergerak.
 Penyerap (sorbent), yaitu bahan padatan yang berfungsi sebagai penyangga sekaligus
sebagai fase diam.
 Solut (solute), adalah komponen-komponen yang terdapat dalam bentuk campuran
dalam pelarut yang akan dipisahkan melalui sistem kromatografi.
 Pengembang (developer) atau eluen (eluent), adalah pelarut/larutan yang digunakan
untuk mengelusi campuran komponen yang sudah ada di dalam sistem kromatografi
supaya dapat bergerak sepanjang pelat-pelat teoritis (kolom).
Istilah Dalam Kromatografi
 Eluat, yaitu pengembang atau eluen yang keluar dan sistem kromatografi yang secara
periodik mengandung komponen-komponen yang sudah terpisahkan.
 Elusi ialah pekerjaan atau usaha untuk menjalankan komponenkomponen dalam
pelarut untuk bergerak sepanjang kolom dalam sistem kromatografi dengan cara
mengalirkan eluen.
 Pemuatan (loading) sampel, yaitu pekerjaan menempatkan sejumlah larutan sampel
yang mengandung komponen-komponen yang akan dipisahkan ke dalam ruang
sampel yang ada pada peralatan kromatografi.
 Volume retensi (retention volume, void volume, hold-up volume), ialah jumlah larutan
pengelusi (fase bergerak) yang memenuhi rongga-rongga dan pori-pori dalam kolom
(matrik).
Istilah Dalam Kromatografi
 Volume bed (bed volume) adalah jumlah larutan pengelusi ditambah dengan volume
kolom.
 Volume pengelusi (elution volume) ialah jumlah larutan pengeluasi yang harus
ditambahkan ke dalam sistem kromatografi untuk menghasilkan (mengeluarkan dari
kolom) sebuah puncak kromatogram.
 Kolom adalah sejumlah matnik yang dimasukkan ke dalam tabung untuk
kromatografi.
 Kromatogram adalah respon detektor dalam bentuk grafik di antara sumbu respon
versus waktu retensi atau dalam bentuk noda-noda di atas bahan penyerap atau fase
diam.
 Sistem dalam Kromatografi
1. Sistem partisi
Ialah pemisahan komponen yang didasarkan atas perbedaan polaritas pada
matrik (fase diam). Sistem ini terjadi pada kromatografi yang menggunakan fase
diam dan fase bergeraknya berupa cairan, fase diam dan fase bergeraknya berupa
gas, fase diam berupa cairan sedangkan fase bergerak berupa gas, atau fase diam
berupa gas sedangkan fase geraknya berupa cairan.
2. Sistem adsorpsi
Ialah pemisahan komponen yang didasarkan pada kecenderungan
komponen-komponen mengadakan adsorpsi pada matrik (fase diam). Sistem ini
terjadi pada kromatografi yang menggunakan fase diam berupa padatan
sedangkan fase bergeraknya berupa cairan atau gas.
Sistem dalam Kromatografi
3. Sistem normal (normal phase)
Ialah kromatografi yang menggunakan fase diam bersifat polar dan
fase bergeraknya bersifat non-polar.
4. Sistem sungsang atau sistem terbalik (reversed phase)
Ialah dalam kromatografi digunakan fase diam bersifat non-polar
sedangkan fase bergeraknya bersifat polar.
5. Sistem penukar ion (ion exchange)
Ialah sistem kromatografi yang menggunakan dasar perbedaan
muatan antara komponen yang dipisahkan dengan muatan matriknya.
Sistem dalam Kromatografi
6. Sistem afinitas
Ialah pemisahan komponen dengan kromatografi yang mendasarkan
pada perbedaan afinitas (kemampuan bergabung) untuk mengadakan
ikatan dengan fase diam.
7. Sistem penyaring molekuler (molecular sieve) atau sistem ekslusi bentuk
(size exclussion)
jika pemisahan komponen didasarkan pada perbedaan ukuran
(bentuk) atau berat molekulnya. Pada sistem ini molekul-molekul yang
besar (berat molekul tinggi) akan keluar terlebih dahulu karena molekul-
molekul yang kecil mengadakan retensi sementara waktu di dalam pori-
pori matrik.
Sistem dalam Kromatografi
8. Sistem pasangan ion (ion pairing)
jika ke dalam sistem kromatografi ditambahkan bahan atau
komponen yang dapat merubah tegangan ionik pada matrik atau eluen
atau keduanya. Kromatografi ini sering digabungkan dengan kromatografi
fase normal atau kromatografi fase sungsang.
 Faktor Retardasi (Rf)

Jika Vs dan Vm masing-masing adalah banyaknya (volume) fase diam

dan fase bergerak, maka
pada fase bergerak:

J𝑢𝑚𝑙𝑎h 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑒𝑟𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡 𝑑𝑖 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 f𝑎𝑠𝑒 𝑏𝑒𝑟𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘

Rf =
J𝑢𝑚𝑙𝑎h 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙
 Dan pada fase diam,

(𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑒𝑟𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡 𝑑𝑖 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑑𝑖𝑎𝑚 )

Rf =
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙

c = faktor kapasitas (besarnya setara dengan rasio jumlah solut

yang berada di dalam fase diam dan yang berada di dalam
fake bergerak)
Di dalam praktek Rf digunakan untuk menentukan lokasi solut dalam sistem
kromatografi:

Vh = volume eluen yang diperlukan untuk mengisi kolom (hold-up volume)

Vr = volume eluen yang diperlukan untuk kromatogram (volume retensi).
mengelusi keluarnya

o Pada kromatografi kertas dan lapis tipis lainnya besarnya Rf:

Am = Lm x W = luas fase gerak

As = Ls x W= luas fase diam pada pada kertas
atau lapis tipis
Lm = jarak yang ditempuh oleh fase bergerak
Ls = jarak yang ditempuh oleh fase diam
W = lebar kertas atau lapis tipis
o Pada kromatografi kolom besarnya Rf:

Rf dapat diekspresikan sebagai rasio jarak tempuh solut (Am) dan

jarak tempuh fase bergerak/larutan pengelusi (Am+KAs)

o Pada kromatografi kertas atau lapis tipis, yaitu:

J𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢h 𝑠𝑜l𝑢𝑡 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑘𝑒𝑟𝑡𝑎𝑠 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑙𝑎𝑝𝑖𝑠 𝑡𝑖𝑝𝑖𝑠
Rf=
J𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢h 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑙𝑢𝑠𝑖 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑘𝑒𝑟𝑡𝑎𝑠 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑙𝑎𝑝𝑖𝑠 𝑡𝑖𝑝𝑖𝑠
 Waktu Retensi

Waktu retensi (tr) = lamanya solut tinggal di dalam sistem kromatografi

L = panjang kolom,
F = kecepatan solut bergerak melalui kolom
(mengekspresikan kecepatan aliran fase bergerak),
tm = waktu yang diperlukan solut untuk
menempuh jarak di dalam kolom sampai keluar
dan kolom.

Jika kecepatan mengalir fase bergerak konstan, maka:

sehingga Rf dalam sistem kolom dapat ditentukan berdasarkan:

 Teori Lapisan (Pelat)
Jumlah pelat teoritis (n) dapat dihitung (lihat Gambar):

Ekivalensi pelat teoritis (EPT),

high equivalent to a theoritical plate
(HETP) = rasio antara panjang kolom
dengan jumlah pelat teoritisnya,

Jika nilai ekivalensi pelat teoritis kecil maka menguntungkan karena akan
menghasilkan kromatogram yang ideal.
 Menurut Van Deemter dan Gidding:

A = konstanta “Eddy diffusion”,

B = konstanta difusi longitudonal
C = konstanta keseimbangan dinamis
F = kecepatan aliran linear fase
bergerak.
 Efisiensi Kromatografi

Menurut Van Deemter dan Gidding:

 Resolusi

R = resolusi
Atr = jarak antara dua puncak yang memisah
WA = lebar garis dasar puncak A
WB = lebar garis dasar puncak B
Pengaruh berbagai faktor terhadap resolusi kromatogram.
(a) Pemisahan pada kolom pendek dengan sedikit lapisan teoritis.
(b) Kondisi (a) tetapi suhu dinaikkan, resolusi bertambah baik.
(c) Pemisahan pada kolom panjang dengan lapisan teoritis banyak.
(d) Kondisi (c) tetapi suhu dinaikkan, resolusi bertambah baik.
Pengelompokan Kromatografi
 Kromatografi dapat digolongkan berdasarkan pada jenis fase-fase yang
digunakan.
 Dalam kromatografi fase bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan fase diam
dapat berupa zat padat atau zat cair, maka berdasarkan fase bergerak-fase diam
terdapat empat macam sistem kromatografi, yaitu: kromatografi gas-cair,
kromatografi gas-padat, kromatografi cair-padat dan kromatografi cair-cair.
 Kromatografi juga dapat didasarkan atas prinsipnya, misalnya kromatografi
partisi (Partition chromatography) dan kromatografi serapan (Adsorption
chromatography).
 Sedangkan menurut teknik kerja yang digunakan, misalnya kromatografi kolom,
kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kertas dan kromatografi gas.
KROMATOGRAFI KOLOM PARTISI
 Peralatan
• Kromatografi kolom partisi menggunakan suatu tabung yang
terbuat dari kaca, nilon, fiberglass, atau logam tahan karat.
• Pada bagian bawah (dasar)tabung diberi penahan (glasswool dan
atau pasir) untuk menahan bahan penyangga supaya tidak keluar
dan tabung.
• Di bagian bawah tabung terdapat pipa bergaris tengah kecil, dapat
dilengkapi dengan keran yang dapat dibuka atau ditutup untuk
mengalirkan atau menghentikan aliran pelarut dan dalam tabung.
• Tabung kemudian diisi dengan kolom yang sudah disiapkan
terlebih dahulu.
• Tinggi kolom paling sedikit 20 kali diameternya.
• Pada bagian atas tabung ditempatkan reservoir eluen.
• Cara mengoperasikan peralatan adalah dengan mengelusi sampel
yang diletakkan di atas kolom. Elusi dihentikan jika diperkirakan
semua komponen telah terpisahkan.
 Bahan Penyangga (Matrik = Kolom)

Bahan penyangga dan sifatnya yang banyak digunakan pada kromatografi

kolom partisi antara lain seperti pada Tabel 1.
 Preparasi Bahan Penyangga
• Untuk bahan penyangga berupa tanah diatome atau
gel silika, maka bahan penyangga ini harus dicampur
dengan fase diam yang akan digunakan dengan
perbandingan 0,5-1,0 bagian fase diam dengan 1,0
bagian bahan penyangga.
• Pencampuran harus baik, misalnya dengan
menggunakan mortar atau blender sehmgga akan
dihasilkan semacam pasta atau bubur yang tidak
terlalu basah tetapi juga tidak kering.
• Fase diam yang akan digunakan kemudian
ditambahkan berlebihan pada pasta tersebut sehingga
terjadi sluri.
• Setelah itu sluri dimasukkan tabung, sluri diaduk dengan
pengaduk berbentuk cakram yang diameternya lebih kecil
sedikit daripada diameter tabung.
• Pada pusat cakram diberi tangkai panjang.
• Jika cakram dimasukkan ke dalam tabung dan digerakkan
berkali-kali sepanjang tabung ke atas dan ke bawah, maka
cakram akan dapat bergerak leluasa, dan sluri akan dapat
bergerak melalui sela-sela cakram dengan dinding tabung.
• Gerakan cakram harus perlahan-lahan, dilakukan beberapa kali.
Sesudah itu cakram diambil dan kelebihan fase diam
dikeluarkan melalui mulut tabung yang terletak di bagian dasar
tabung.
• Untuk kolom selulosa, maka bubuk selulosa direndam ke dalam
aseton.
• Campuran kemudian dituangkan ke dalam tabung. Kelebihan
aseton dikeluarkan melalui mulut tabung yang terletak di
bagian dasar tabung.
• Kolom kemudian dicuci dengan fase bergerak sampai teijadi
keseimbangan. Kadang-kadang sebelum dicuci dengan fase
bergerak, dicuci terlebih dahulu dengan air berlebihan.
 Penggunaan

Kromatografi kolom partisi banyak digunakan untuk memisahkan

berbagai komponen yang terdapat dalam bahan pangan dan pakan
termasuk juga bahan hasil pertanian pada umumnya, antara lain:
• 1. Asam-asam lemak C2-C8, dengan fase diam campuran air
dan asam sulfat dengan perbandingan tertentu, dan fase
bergerak campuran kloroform dan n-butanol.
• 2. Senyawa-senyawa golongan lipida, dengan fase diam
campuran trikiorometan dan alkana dan fase bergerak 2-
propana.
• 3. Karbohidrat dan glukosida dengan fase diam 1,2-etanadiol
monometileter dan fase bergerak 2-propana.
• 4. Golongan fenol dengan fase diam berupa air dan fase
bergerak campuran metanol, n-butanol, dan kloroform.
• 5. Untuk memisahkan aidrin-dieldrin (keduanya adalah
insektisida) dengan fase diam nitrometan dan fase bergerak n-
heksana.
 KROMATOGRAFI KOLOM ADSORPSI
• Dalam kromatografi adsorpsi yang menjadi fase diam adalah berupa padatan

yang sekaligus juga berperan sebagai penyangga.

• Permukaan partikel-partikel penyangga mempunyai sifat aktiv yang dapat

mengikat komponen-komponen atau molekul-molekul tertentu.

• Pengikatan komponen-komponen tersebut dapat disebabkan karena interaksi

ionik (elektrostatik), gaya Van der Wals, atau tenaga-tenaga lainnya mau pun

kombinasinya.

• Selama kromatografi berlangsung akan terjadi penyerapan molekul-molekul

yang dipisahkan (solut) yang terdapat dalam larutan pada permukaan

penyangga.
• Kekuatan penyerapan dipengaruhi oleh sifat penyangga dan solut.
• Pada umumnya penyangga merupakan komponen yang mempunyai polaritas
tinggi, sehingga penyerapan solut pada permukaan penyangga sangat
tergantung pada polaritas solut.
• Komponen-komponen yang mempunyai polaritas tinggi akan terikat kuat
pada permukaan penyangga, sedangkan yang polaritasnya rendah kurang kuat
atau tidak terikat pada permukaan penyangga.
• Sebagai bahan penyangga harus dipilih sesuai dengan komponen-komponen
yang akan dipisahkan. Dalam praktek pada umumnya sering digunakan
alumina yang dapat digunakan untuk memisahkan hanipir semua komponen
organik.
• Sifat eluen atau pelarut juga berpengaruh pada kromatografi adsorpsi. Umumnya
digunakan pelarut yang polaritasnya rendah.
• Kekuatan pelarut mengelusi komponen-komponen yang terikat pada penyangga
meningkat dengan meningkatnya polaritas.
 Peralatan
• Pada kromatografi kolom adsorpsi juga digunakan tabung seperti
halnya pada kromatografi kolom partisi dan cara penyiapannya juga
tidak berbeda dengan penyiapan kolom partisi.
• Partikel-partikel penyangga dibuat dengan menggunakan pelarut
yang akan digunakan sebagai fase bergerak, kemudian dimasukkan ke
dalam tabung dan dibiarkan beberapa waktu lamanya supaya
partikel-partikel penyangga mengendap.
• Cara memuatkan sampel, teknik mengelusi, dan pengumpulan
fraksifraksi, serta cara-cara analisisnya sama dengan yang telah
diterangkan pada kromatografi kolom partisi.
• Komponen yang keluar kolom terlebih dahulu tergantung pada
sistem kromatografi yang digunakan. Pada kromatografi adsorpsi
dengan sistem fase normal, maka yang keluar kolom lebih awal
adalah komponen yang mempunyai sifat lebih nonpolar daripada
komponen-komponen yang membentuk puncak kromatogram lebih
akhir. Sebaliknya pada kromatografi adsorpsi dengan sistem fase
sungsang, maka yang membentuk puncak kromatogram lebih awal
adalah komponen yang bersifat lebih polar dan pada yang kemudian.
KROMATOGRAFI GEL
Pada kromatografi gel, partikel-partikel yang dipisahkan berupa
molekulmolekul berdasarkan pada ukurannya.

Oleh karenanya kromatografi gel sering kali disebut dengan kromatograli

penyaring molekuler.

Yang bertindak sebagai penyaring adalah suatu kolom gel yang dipersiapkan
dan bahan-bahan tertentu, misalnya dekstran.

Perbedaannya dengan penyaringan biasa adalah bahwa dalam kromatografi gel

molekul-molekul yang berukuran besar akan lobs lebih dahulu, sedangkan
molekul-molekul yang kecil ukurannya akan muncul lebih akhir.
 Bahan Penyangga (Kolom)

Suatu gel adalah jaringan tiga demensi yang biasanya mempunyai struktur
acak dan suatu komponen bahan. Persyaratan utama gel yang dapat
digunakan pada kromatografi gel adalah yang inert, artinya tidak bereaksi
dengan atau mempengaruhi sifat-sifat molekul-molekul yang dipisahkan atau
dengan komponen-komponen pelarut atau larutan penyangga yang
digunakan. Di samping itu gel juga harus tidak bermuatan (positif atau
negatif) . Tiga macam gel yang banyak digunakan pada kromatografi gel
adalah dekstran, agarosa, dan poliakrilamida.
KROMATOGRAFI GAS
 Ada dua macam kromatografi gas, yaitu kromatografi gas
cairan (gas liquid chromatography, GLC) dan kromatografi
gas padatan (gas solid chromatography, GSC). Fase diam
pada kromatografi gas cairan adalah cairan yang
mempunyai titik didih tinggi yang ditahan/diikatkan pada
penyangga. Pemisahan komponen pada kromatografi gas
cairan asarkan pada proses sorpsi partisi. Pada
kromatografi gas padatan diam yang digunakan adalah
padatan yang sekaligus berfungsi sebagai bahan penyerap.
 Peralatan
 Fase Diam

Persyaratan untuk fase diam harus innert terhadap sampel, bahan penyangga,
dan bahan tabung, dan tidak mudah menguap (nonvolatile), stabil pada suhu
operasi kromatografi, mempunyai kemurnian tinggi, tidak tercampur oleh
bahan lain. Fase diam ada yang bersifat polar misalnya poliester yang berat
molekulnya tinggi, golongan ester, carbowax, amin, dan yang berisfat non-polar
misalnya hidrokarbon, minyak (lemak), silikon. Pada penggunaannya sebaiknya
digunakan fase diam yang mempunyai sifat kimiawi mirip dengan komponen-
komponen yang dipisahkan. Perbedaan polaritas akan menyebabkan tailing atau
fronting.
Tabel 2.
Berbagai jenis fase diam untuk kromatografi gas
 Fase Bergerak
Merupakan gas pembawa yang ditempatkan dalam tabung bertekanan tinggi
(rata-rata 40 psi) untuk menghasilkan kecepatan aliran gas 10-100cm3/menit.
Gas pembawa harus murni
 Bahan Penyangga
Fungsi bahan penyangga untuk kromatografi gas cairan adalah sebagai bahan
yang mengikat/menahan fase diam berbetuk cairan atau gas, sedangkan pada
kromatografi gas padatan berfungsi sebagai fase diam. Persyaratan untuk bahan
penyangga adalah innert, murni . Sebelum digunakan bahan penyangga harus
dicuci dengan larutan asam atau basa untuk menghilangkan cemaran logam,
dilakukan silanasi untuk mengubah gugus Si-OH menjadi Si-O-Si(CH3)3.
silanasi dapat dilakukan dengan mencuci bahan penyangga dengan dimetil
dikiorosilan atau dengan heksametildisilazan.
 Kolom

Kolom yang dapat digunakan pada kromatografi gas ada dua macam, yaitu

kolom tertutup (packed column) dan kolom terbuka(open-tubular column

atau capillary column).

 Injection Port

Tempat untuk memasukkan sampel (cair) dinamakan injection port. Cara

memasukkan sampel dapat secara on-column injection atau secara flash

evaporation (biasanya hanya digunakan untuk sampel yang mempunyai titik

didih sangat tinggi). Hexaport adalah ijection port untuk sampel berbentuk gas,

sedangkan injection splitter adalah injection port untuk kolom kapiler. Jumlah

sampel tergantung pada kemampuan/kapasitas kolom dan kepekaan detektor.

 Detektor
Fungsi detektor adalah mendeteksi komponen-komponen yang
dipisahkan setelah melalui kolom.
Berbagai macam detektor dapat digunakan, antara lain:
1) Thermal conductivity detector (TCD) .- Disebut pula
katharometer.
2) Flame ionization detector (FID)
3) Electron capture detector (ECD)
4) Hidrogen flame detector (HFD)
5) 5. Gas density detector (GDD)
KROMATOGRAFI KOLOM TEKANAN
TINGGX (HIGH PERFORMANCE LIQUID
KROMATOGRAPHY, HPLC)
HPLC sangat fleksibel penggunaannya, dapat digunakan untuk memisahkan dan
menganalisis hampir semua komponen atau senyawa dalam bahan. Berdasarkan
tekanan yang tinggi yang dipergunakan pada HPLC, maka seringkali HPLC
diartikan sebagai kepanjangan dan high pressure chromatography. Tekanan yang
digunakan pada HPLC dapat mencapai 5.000psi, bahkan beberapa alat
dirancang menggunakan sampai 10.000psi. Oleh karena HPLC merupakan
pengembangan dan kromatografI kolom, maka tergantung pada kolom
digunakan HPLC dapat merupakan kromatografi kolom partisi, tografi kolom
adsorpsi, kromatografi gel, kromatografi penukar ion
 Peralatan HPLC
Peralatan HPLC dapat digambarkan secara skematik sebagai berikut.
Satu unit peralatan HPLC terdiri atas beberapa komponen, yaitu tangki
penyedia pelarut fase bergerak freservoir), pompa tekanan tinggi, monitor
tekanan, injector, kolom, detektor, dan kolektor. HPLC dioperasikan pada
tekanan tinggi, rata-rata 8.000psi, tetapi beberapa peralatan HPLC dioperasikan
pada tekanan yang lebih besar lagi. .
Tekanan yang dihasilkan oleh pompa harus dapat diamati, dan ini dilakukan
dengan peralatan yang dapat memngendalikan (memonitor) secara langsung
besarnya tekanan.
Dengan adanya monitor tekanan, maka besarnya tekanan dapat dikendalikan.
Berbeda dengan tempat pemuatan sampel yang digunakan pada kromatografI
gas, pada HPLC tempat pemuatan sampelnya hams dapat tekanan yang tinggi
sehingga semua sampel yang dapat masuk ke dalam kolom.
Alat yang digunakan untuk memasukkan sampel pada HPLC dilengkapi
dengan katup injeksi. Alat demikian mempunyai dead volume nol dan dapat
menahan tekanan sampai 5.000psi.
Kolom untuk HPLC dikemas dalam tabung baja tahan karat atau bahan lain
yang inert, dan tahan tekanan tinggi. Kolom ditempatkan di dalam ruang yang
bersuhu tetap (konstan). Jenis kolom yang digunakan tergantung komponen-
komponen yang dipisahkan, sistem kromatografi (pasangan ion, normal,
sungsang), jenis kromatografi (partisi, adsorpsi, size exlusion, afinitas, penukar
ion, dll.). Refraktometer merupakan detektor yang digunakan untuk menera
pemisalan karbohidrat, sedangkan spektrofotometer (uv, uv-vis) merupakan
detektor yang paling banyak digunakan untuk menera protein dan
turunannya.
Untuk keperluan ini panjang gelombang yang digunakan pada umumnya adalah
220nm, 254nm, atau 280nm. Detektor fluorometer digunakan untuk
mendeteksi steroida, vitamin, nukleotida, amin.
Kolektor atau penampung eluat digunakan untuk menampung eluat yang sudah
melalui detektor. Beberapa peralatan lainya dapat digabungkan, misalnya alat
pencatat data (recorder), pengontrol pompa dan pemrogram operasi.
KROMATOGRAFI KERTAS DAN LAPIS TIPIS
 Peralatan
Teknik kromatografi dapat dilakukan pada pelat yang dilapisi dengan bahan
penyangga. Sebagai pelat dapat digunakan kertas, kaca, lembaran aluminium,
atau fiberglass. Khusus jika kertas yang digunakan, maka kertas berfungsi ganda,
yaitu sebagai pelat sekaligus sebagai bahan penyangga. Kertas merupakan
selulosa yang dapat menyerap eluen sehingga sistem yang terjadi adalah partisi.
Meski pun demikian peristiwa adsorpsi juga terjadi pada kromatografi kertas.
Jenis kertas yang digunakan pada umumnya adalah kertas Whatman No. 4, 54,
540, 31, dan No. 17, atau jenis kertas lainnya yang semacam.
Perlu diketahui bahwa kerapatan dan ketebalan kertas akan berpengaruh pada
kecepatan aliran eluen, sehingga juga akan berpengaruh pada kesempurnaan
pemisahan komponen-komponen. Ukuran kertas yang umum digunakan adalah
20 x 20 cm atau 10 x 20 cm. Pada kromatografi lapis tipis, bahan penyangga
dilapiskan pada pelat kaca, logam, atau fiberglass. Bahan penyangga dapat
berupa oksida, oksida hidrat atau bentuk garam. Sebagai bahan penyangga yang
populer digunakan pada kromatografi lapis tipis adalah golongan aluminium
oksida, gel silika, kieselguhr, dan selulosa. Cara preparasinya adalah mula-mula
dengan membuat sluri yaitu mencampur bahan penyangga dengan aquades.
Setelah itu dengan alat khusus sluri dilapiskan pada permukaan pelat sehingga
mempunyai ketebalan yang sama. Sebelum digunakan lapis tipis harus
dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 120C selama 60 menit untuk aktivasi.
Contoh beberapa pelarut yang sering digunakan pada kromatografi kertas dan
lapis tipis adalah:

1. Untuk pemisahan asam amino digunakan pelarut campuran fenol dan air
(larutan jenuh), campuran n-butanol, asam cuka dan air (4: 1 :5 atau
12:3:5), campuran n-butanol, piridin dan air (1:1:1).

2. Untuk pemisahan golongan karbohidrat digunakan pelarut campuran dan

etilasetat, piridin, dan air (2 : 1 :2), campuran etilasetat, propanol dan air (6:
1:3), campuran etilasetat, asam cuka dan air (3:1:3).

3. Untuk pemisahan asam lemak digunakan campuran n-butanol dan larutan

1 ,5M ammonia (larutan jenuh).
 Pemuatan Sampel

Sampel sebelum diaplikasikan pada kertas atau lapis tipis harus dibuat larutan
dahulu. Larutan sampel kemudian diteteskan pada kertas atau lapis tipis pada
salah satu tepinya dengan jarak kurang lebih 2, 5 cm dan tepi. Tetesan sampel
diusahakan ekecil mungkin, maka sebaiknya menggunakan pipa kapiler, pipet
mikro, atau siring (spet, jarum suntik berukuran mikro). Sebelum dielusi
tetesan sampel dikering anginkan, jika perlu dapat dikerjakan dengan
menghembuskan udara dengan kipas angin atau alat pengering rambut (hair
drier).Yang perlu dijaga adalah selama pengeringan tidak terjadi perubahan sifat
sampel, oleh karena itu sebaiknya pengeringan dilakukan pada suhu kamar.
 Teknik Elusi (Pengembangan)

Ada tiga macam teknik elusi, yaitu pengembangan secara ascending,

descending, dan radial atau horizontal.

Teknik ascending merupakan cara yang paling sederhana. Kertas atau lapis tipis
sesudah diberi sampel, tepinya setinggi kurang lebih 2,5cm dicelupkan pada
eluen yang ditempatkan di dalam bejana. Eluen akan meresap pada kertas atau
bahan penyangga dan bergerak naik secara kapileri sampai pada ketinggian yang
dikehendaki. Teknik descending merupakan kebalikan dari teknik ascending.
Eluen dialirkan dari tepi kertas bagian atas dimana sampel diaplikasikan. Eluen
akan bergerak mengalir (meresap) ke bawah melalui kertas atau bahan
penyangga secara perlahan-lahan sampai batas yang dikehendaki.
Ada satu hal yang perlu mendapat perhatian pada teknik descending, yaitu cara
mengalirkan eluen dan atas ke bawah. ini dapat ditempuh dengan
menghubungkan kertas atau lapis tipis dengan kertas saring yang dicelupkan
pada tangki atau bejana penyedia eluen. Pada teknik radial atau horizontal,
sampel diteteskan di sekitar pusat kertas atau lapis tipis. Eluen dialirkan tepat
melalui tengah-tengah kertas sehingga peresapan atau gerakan eluen akan
menyebar ke arah radial.
Ada pun metoda pengembangannya ada dua cara, yaitu metode satu arah (one
way direction) dan metoda dua arah (two ways direction). Pada metoda satu
arah, kertas atau lapis tipis dikembangkan melalui satu sisinya di mana sampel
dimuatkan. Sedangkan pada metoda dua arah, kertas atau lapis tipis yang telah
dikembangkan, dilakukan pengembangan sekali lagi melalui tepi siku-siku kertas
atau lapis tipis (lihat gambar).
 Visualisasi Hasil

Setelah perrnukaan eluen mencapai batas yang ditentukan, kertas atau lapis tipis
diambil (diangkat) dan dikeluarkan dari dalam tangki, kemudian dikeringkan pada suhu
kamar sampai semua eluen menguap. Tempat komponen yang memisah dapat diketahui
dengan visualisasi. Ada beberapa teknik visualisasi yang dapat dikerjakan tergantung
pada jenis dan sifat komponen yang dipisahkan.Visualisasi secara fisik dapat dilakukan
dengan sinar ultra violet atau dengan pengeringan pada suhu tinggi.Visualisasi dengan
penyinaran atau dengan pengeringan menyebabkan timbulnya warna pada komponen.
Visualisasi dapat pula secara kimiawi yang dapat dilakukan dengan nyemprotkan suatu
larutan atau senyawa yang dapat mengadakan reaksi dengan komponen sehingga timbul
wama.
 Interpretasi
Secara kualitataif dapat dilakukan dengan menghitung faktor retardasinya. Rf
diekspresikan sebagai rasio jarak tempuh solut dan jarak tempuh larutan
pengelusi pada kertas atau lapis tipis, yaitu:
J𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢h 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑘𝑒𝑟𝑡𝑎𝑠 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑙𝑎𝑝𝑖𝑠 𝑡𝑖𝑝𝑖𝑠
Rf = 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑘𝑒𝑟𝑡𝑎𝑠 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑙𝑎𝑝𝑖𝑠 𝑡𝑖𝑝𝑖𝑠

Untuk mengetahui jenis komponen yang memisah, Rf sampel dicocokan

dengan Rf standar yang dielusi dengan cara yang sama.
Interpretasi secara kuantitatif dilakukan untuk mengetahui jumlah masing-
masing komponen yang memisah. Hal ini dapat dilakukan dengan mengukur
atau menghitung luas noda yang terbentuk, menimbang potongan masing-
masing noda, menganalisis potongan noda secara kimiawi.
CONTOH PEMISAHAN DENGAN KROMATOGRAFI
 Alat
KCKT dengan Hitachi RI detector L-2490, pompa Hitachi RI Pump L-2130, injektor
Rheodyne 7725I 20 μL, kolom NH2 Inertsil 5 μm, 250 x 4.6 mm i.d., timbangan
analitik, mikropipet, kertas saring Whatman No.1, membran filter 0,2 μm,
termometer. kompor listrik, sonikator, dan alat-alat gelas yang biasa digunakan di
laboratorium.
 Bahan
Laktosa monohidrat dibeli dari Brataco (DMV Fonterra pharma grade),
akuabidestilata steril, air deionisasi, asetonitril LC Grade (JT Baker), etanol 95% (pa),
oksalat dihidrat (pa), larutan Carrez I (3,6 g K4[FeCN)6].3H2O/ 100 mL H2O, pa),
larutan Carrez II (7,20 g ZnSO4.7H2O/100 mL H2O, pa), sampel SFB (usia 0-6
bulan).
 Penyiapan Fasa Gerak
Dilakukan pemilihan fase gerak dengan komposisi perbandingan ACN-H2O adalah
85:15 (1:0,18), 80:20 (1:0,25), 75:25 (1:0,33), 70:30 (1:0,43), dan 65:35 (1:0,54).
 Penyiapan Larutan Baku Induk
Ditimbang seksama 1000 mg laktosa monohidrat, dimasukkan ke dalam labu
volumetri 100 mL, dan ditambahkan aquabidest sampai tanda batas sehingga
diperoleh larutan baku induk dengan konsentrasi 10 mg/mL.
 Penyiapan Seri Larutan Baku Kerja untuk Kurva Kalibrasi
Seri larutan baku disiapkan dengan cara melakukan pengenceran larutan baku
induk sehingga diperoleh 8 konsentrasi yang berbeda, yaitu: 0,5; 1; 2,5; 4; 5,5; 7;
8,5; dan 10 mg/mL laktosa monohidrat.
 Uji Kesesuaian Sistem
Uji kesesuaian sistem dilakukan dengan penyuntikan berulang (enam kali
pengulangan) larutan baku kerja konsentrasi 7 mg/mL ke dalam sistem KCKT,
selanjutnya ditentukan nilai waktu retensi, AUC, dan tinggi kromatogram.
Kemudian dihitung nilai simpangan baku relatif (SBR) atau koefisien Variansi
(KV). Uji kesesuaian sistem diukur berdasarkan parameter keberulangan
penyuntikan, faktor selektivitas, faktor ikutan, dan resolusi.
 Uji Linieritas dan Pembuatan KurvaKalibrasi
Linieritas metode dievaluasi dengan cara membuat kurva kalibrasi dengan
menggunakan delapan konsentrasi larutan baku pada rentang konsentrasi 0,5- 10
mg/mL, dimana masing-masing konsentrasi diukur dengan tiga kali replikasi. Kurva
kalibrasi didapat dari plot antara konsentrasi laktosa terhadap luas area di bawah
puncak kromatogram laktosa. Pengujian linieritas dilakukan dengan cara
menentukan koefisien korelasi (r) serta koefisien fungsi regresi (VX0) dari kurva
kalibrasi.

 Penentuan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Parameter kepekaan diperoleh melalui penentuan batas deteksi dan batas
kuantitasi yang dihitung dari kurva kalibrasi

 Penentuan Presisi
Penentuan presisi larutan baku laktosa dilakukan dengan melakukan penyuntikan
larutan laktosa secara berulang pada tiga hari yang berbeda. Penentuan presisi
tiga prosedur preparasi ditentukan dengan cara penentuan konsentrasi laktosa
pada sampel SFB dengan enam kali replikasi untuk setiap prosedur. Presisi
ditentukan dari nilai % KV. Penentuan presisi larutan sampel SFB dilakukan
dengan melakukan penyuntikan larutan sampel SFB secara berulang pada tiga hari
yang berbeda