HPLC & GC

High performance liquid chromatography

(HPLC)
Gas Chromatography (GC)

Chromatography
 Chromatography
Kromatografi merupakan salah satu metode
pemisahan fisikokimia pada suatu campuran
kompleks. Ditemukan oleh seorang botanist, M.S
Tswet.

Chromatography as a physicochemical method for

separation of complex mixtures was discovered at the very
beginning of the twentieth century by Russian–Italian
botanist M. S. Tswet.
Basic Principle of Chromatography
Berdasarkan kesetimbangan konsentrasi
komponen/solut diantara dua fasa yang tidak
bercampur, yaitu fasa diam dan fasa gerak

Based on the concentration equilibrium of the components of

interest,between two immiscible phases : stationary phase and
mobile phase
Ciri Khas Pemisahan

 Perbedaan migrasi berbagai komponen dalam

campuran
tergantung dari kecepatan gerak komponen di sepanjang
kolom bergerak cepat ---- cepat keluar

 penyebaran komponen campuran di sepanjang kolom

Kd >>>  komp. di fase diam > di fase gerak
 lama keluar
Basic separation
Adsorption Ion exchange
Partition Size exclusion
Basic separation
 Kromatografi adsorpsi
Pemisahan kromatografi adsorpsi terjadi karena perbedaan interaksi solut
dengan fase diam. Molekul pelarut cenderung bersaing dengan molekul solut
untuk mendapat tempat pada permukaan penjerap dan menggerakkan linarut
dengan mendorongnya keluar dari tempatnya.
 Kromatografi partisi
Pada kromatografi ini, pemisahan komponen solut ditentukan oleh distribusi
relatif masing-masing komponen di antara fase diam dan fase gerak.
 Kromatografi penukar ion
Kromatografi penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation
atau anion dengan suatu fase gerak.
 Kromatografi ekslusi ukuran
Molekul solut yang memiliki BM yang jauh lebih besar akan terelusi terlebih
dahulu, kemudian molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul
yang jauh lebih kecil karena solut dengan BM yang besar tidak melewati porus,
namun lewat di antara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan
dengan eklusi ukuran tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam
seperti tipe kromatografi yang lain
 Classification of
chromatographic
techniques
FASE GERAK FASE DIAM MEKANISME TEKNIK NAMA
Cair Partisi Kolom KGC
Gas
Padat Adsorpsi Kolom KGP

Kolom KCC Klasik

Cair Partisi
Datar KLT

Kolom KCKT/ HPLC

“Bonded Liquid” Modifikasi Partisi HPTLC
Datar
KKt

Cair KCP Klasik

Kolom
KCKT
Adsorpsi
KLT
Datar
HPTLC
Padat
Pertukaran ion Kolom KPI, HPLC
Kr.Permeasi Gel,
Eklusi Kolom
HPLC
Afinitas Kolom Kr. Afinitas/Ligan,
 General Theory of Column
Chromatography
Chromatographic Resolution (R)
Capacity Factor (k)
Column Selectivity ()
Column Efficiency
 The Chromatogram
retention time (tr)
retention volume (vt)
baseline width (w)
void time (tm)

Kromatogram/ Chromatogram
Suatu penggambaran signal detektor sebagai fungsi waktu atau
volume elusi

A plot of the detector’s signal as function of elution time or volume.

Resolution (R)
Pemisahan antara dua pita
kromatografi
The separation between two
chromatographic bands (R)
Capacity Factor (k)
Mengukur seberapa kuat solut tertahan oleh fase
diam (k)

A measure of how strongly a solute is retained by the stationary phase

(k)

tr  tm tr '
k 
tm tm

tr’ :The difference between a solute’s

mM : the mass in the mobile phase retention time and column’s void
mS : the mass in the stationary phase time (adjusted retention time)
K : distribution ratio
Column Selectivity ()
Selektivitas relatif kolom terhadap dua solut
didefinisikan sebagai faktor selektifitas kolom ().

The relative selectivity of a chromatographic column for a pair of solutes is

given by the selectivity factor ()

K B k B tr B  tm
  
K A k A tr A  tm
Column efficiency
Theoretical efficiency (number of theoretical
plates  N, H)
Effective plates number (real efficiency)
Height equivalent to a theoretical plate (HETP)
Theoretical plate

Plat teoritis digunakan untuk mengevaluasi efisiensi

kolom dimana kolom dianggap terdiri dari suatu seri
zona/plat-plat kecil dimana terjadi partisi antara fase
diam dan fase gerak

A quantitative means of evaluating column efficiency that

treats the column as though it consists of a series of small
zones, or plates, in which partitioning between the mobile
and stationary phases occurs.
 Theoretical efficiency
(number of theoretical plates  N, H)

N : Jumlah plat teoritis

L : panjang kolom
H : Jarak setara Plat teoritis (HETP)
By consequence of the properties of the Gaussian curve (w = 4σ and w 1/2 =2.35σ)
Effective plates number Height equivalent to a
(real efficiency) theoretical plate
(HETP)
Pelebaran Pita
Sumber utama :
 Neka alur (multipath)
 Difusi molekul
 Efek alih massa antara fase-fase
 Neka Alur

Hp : JSPT yang timbul dari variasi kec. Laju melalui

Hp = 2dp kolom karena ada pusaran (JSPT= Jarak Setara
Plat Teori)
dp : diameter partikel
 : konstanta (mendekati 1)
 Difusi molekul
Hd = 2Dm/v

 Hd : JSPT yang timbul dari

difusi memanjang solut
  : faktor kelikuan (<1)
 Dm : koef.difusi solut dalam fase
gerak
 v : kecepatan laju dalam cm/det
 Kinetik alih massa antara fase diam dan fase gerak

QRd 2 v
Hs 
Ds Hm = dp2v/Dm

 Hs : pelebaran pita disebabkan fase diam  dp : diameter partikel

 Q : faktor konfigurasi, tergantung  Dm : koefisien difusi solut dalam
bentuk genangan fase diam & faktor lain fase gerak
 R : Konstanta, tergantung dari kecepatan  v : kecepatan aliran
perpindahan nisbi solut dalam fase gerak
 d : tebal fase diam   : koefisien kolom
 Ds : Koef. Difusi solut dalam fase diam
 v : Kec. Aliran cairan ke bagian bawah
kolom.
-perlu tekanan
-tr>>, eluen>>
H total = Hp + Hd + Hs + Hm

QRd 2 v
= 2dp + 2Dm/v + + dp2v/Dm
Ds

Hs

Hp
Hm

Hd
 An alternative form of this equation is the
van Deemter equation

which emphasizes the importance of the mobile phase’s flow rate. In the
van Deemter equation, A accounts for multiple paths (Hp), B/u for
longitudinal diffusion (Hd), and Cu for the solute’s mass transfer in the
stationary and mobile phases (Hs and Hm).
Beberapa hal yang harus diperhatikan :
 Panjang kolom :
Memperpanjang kolom akan memperbaiki pemisahan (Rs lebih tinggi)

 Diameter kolom
Kapasitas cuplikan naik dengan kuadrat diameter

 Penyangga padat
 partikel tergantung dari tipe penyangga yang digunakan. Beberapa
pendekatan :
 partikel berpori dan kecilluas permukaan tinggi, partikel cukup
rataefisiensi tinggi. Kelemahan : alian tertahan, pengemasan sukar
 manik-manik berpori Pourous Layer Beads (PLB) = Controlled Surface
Porosity Packing (CSPP) = Penyangga perikuler. Manik-manik dilapisi
partikel dan lapisannya berpori. Dengan partikel sekecil mungkin resolusi
dan kapasitas cuplikan diperbaiki, luas permukaan naik kapasitas naik.
Beberapa hal yang harus diperhatikan :
 Fase diam
 Tidak boleh larut dalam fase gerak dan stabil terhadap fase gerak. Mis.
silika sangat larut pada pH>7,5 juga pH<2
 Untuk adsorben : Permukaan harus rata  menghindari tailing dan
adsorpsi irreversible
 Resin (Damar) penukar ion harus punya cukup sambung silang (agar tahan
thdp tekanan)
 Luas permukaan besar  kapasitas tinggi (juga meningkatkan jumlah
cairan)
 Fase gerak
 Harus selektif untuk berbagai komponen
 Tidak terlalu kental, mengurangi penurunan tekanan & menaikkan
kecepatan alih massa
 Mudah menguap : memudahkan menghilangkannya dari cuplikan 
terutama pada Kr. Preparatif
 Kelarutan solut dalam fase gerak  terutama pada Kr. Preparatif
 pemisahan kromatografi yang paling baik

fase diam mempunyai fase gerak bergerak

luas permukaan dengan cepat sehingga
sebesar-besarnya difusi sekecil-kecilnya

penjerap atau Untuk memaksa fase gerak

penyangga berupa bergerak lebih cepat melalui
serbuk halus fase diam yang terbagi dalam
serbuk halus ????

HPLC Tekanan >20 bar (>300 psi)

High Pressure Liquid Chromatography
(HPLC)
Pada HPLC, sampel melewati kolom
kromatrografi dibawa oleh fasa gerak cair.
Pemisahan berdasarkan pada interaksi antara
solute-fase diam, termasuk adsorpsi, partisi,
pertukaran ion, ekslusi ukuran dan interaksi
solute-fase gerak.

In HPLC, a liquid sample, or a solid sample dissolved in a suitable solvent,

is carried through a chromatographic column by a liquid mobile phase.
Separation is determined by solute/stationary-phase interactions,
including liquid–solid adsorption, liquid–liquid partitioning, ion
exchange and size exclusion, and by solute/mobile-phase interactions
 Sistem pada HPLC
Berdasarkan pada jenis fase yang berperan :
 Kromatografi Cair-Cair (LLC) atau kromatografi
partisi
 Kromatografi padat-cair (LSC) atau kromatografi
adsorpsi
 Kromatografi penukar ion
 Kromatografi eklusi ukuran
 Pemisahan pada HPLC
tergantung pada polaritas relatif fase diam dan fase gerak.

 fase diamnya lebih polar dari fase geraknya  Fase normal

 fase diamnya kurang polar dari fase geraknya  Fase balik
KROMATOGRAFI GAS
Gas Chromatography (GC)
Kromatografi gas merupakan teknik pemisahan yang mana
solut-solut yang mudah menguap dan stabil terhadap
panas, bermigrasi melalui kolom yang mengandung fase
diam dengan suatu kecepatan yang tergantung pada rasio
distribusinya. Pada umumnya solut akan terelusi
berdasarkan pada peningkatan titik didihnya, kecuali jika
ada interaksi khusus antara solut dan fase diam.

In gas chromatography (GC) the sample, which may be a gas or liquid, is

injected into a stream of an inert gaseous mobile phase (often called the carrier
gas). The sample is carried through a packed or capillary column where the
sample’s components separate based on their ability to distribute themselves
between the mobile and stationary phases.
The rate theory of chromatography
Van Deemter’s equation
Kromatografi Gas Cair
Fase diamnya adalah cairan yang diikatkan pada
suatu pendukung sehingga solut akan terlarut
dalam fase diamnya. Mekanisme sorpsi-nya adalah
partisi.

Kromatografi Gas Padat

Berbeda dengan KGC, fase diamnya adalah padat.
Penjerapan berdasarkan kompetitif antara fase diam
dan fase gerak.
Instrumentasi
HPLC & GC
HPLC
Instrumen HPLC secara umum tdd reservoir fase
gerak, pompa, injektor, kolom pemisahan, dan
detektor
Campuran senyawa dipisahkan dgn cara melewatkan
sampel ke dalam kolom. Setiap senyawa dlm
campuran melewati kolom dgn kecepatan yg berbeda
tgt pada sifat partisinya di antara FG dan FD.
Skema Instrumen
HPLC
1. Pompa dan Elusi Bergradien
Fungsi:
U/ mendorong FG
melewati kolom.
Akibatnya peningkatan
teknan pd injektor hingga
200 bar, tgt pada:
Kecepatan alir FG
Viskositas
Ukuran partikel FD
Tekanan Bergradien
Jika FG yg digunakan
harus bervariasi, maka
digunakan pompa > 1
2. Injektor
Penyuntikan sampel ke
dalam kolom harus
dilakukan cepat u/
menghindari gangguan
dinamis FG

Katup Bertekanan
Tinggi
3. Kolom
Tabung stainless steel dgn
pjg 3 dan 15 cm, bagian
dalam dilapisi bahan inert,
misal: kaca
Ada dua jenis kolom pada
HPLC :
Kolom konvensional
Kolom mikrobor.
Instrumen HPLC dilengkapi
pengaturan termostat, u/
meningkatkan
reprodusibilitas analisis
4. Fase Diam
Silika Gel (SiO2(H2O)n) Fase Silika Terikat
Gugus silanol dimodifikasi
shg dapat terikat scr
kovalen dgn molekul
organik
Fase monomer, co/ RP-8
dan RP-18 (ODS)
Fase polimer, hsl rx
gugus silanol dgn di-
atau trichlorosilane
Fase Silika Terikat
Fase Diam Lain
U/ meningkatkan kemampuan
pemisahan kelompok senyawa
ttt, bisanya digunakan
sejumlah FD spesifik.
Ke dalam silika terikat suatu
rantai linier, mis: aminopropyl,
cyanopropyl, gugus benzyl,
dipolar ligands (zwitterion)
yang mempengaruhi FD
Misalnya u/pemisahan gula,
peptida dan senyawa hidrofil
5. Fase Gerak
5. Fase Gerak (contd)
6. Detektor
 Detektor universal  mampu mendeteksi zat secara
umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat
selektif, seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrometri massa;
 Detektor yang spesifik  mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,
detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
6. Detektor
Detektor yang ideal :
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan
reprodusibel
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, mampu
mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil
Stabil dalam pengoperasian
6. Detektor

Detektor yang ideal :

Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu
meminimalkan pelebaran pita.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan
konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran
dinamis linier)
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan
kecepatan alir fase gerak
Karakteristik Detektor pada HPLC
Detektor Sensitivitas Kisaran Karakteristik
(g/mL) linier
Absorbansi uv-vis Sensitivitas bagus, paling
Fotometer filter 5 x 10-10 104 sering digunakan,
selektif terhadap
Spektrofotometer 5 x 10-10 105 gugus-gugus dan
Spektrometer >2 x 10-10 105 struktur-struktur yang
photodiode array tidak jenuh
Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus,
selektif, tidak peka
terhadap perubahan
suhu dan kecepatan
alir fase gerak
Karakteristik Detektor pada HPLC
Detektor Sensitivitas Kisaran Karakteristik
(g/mL) linier
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal,
akan tetapi sensitivitasnya
sedang. Sangat sensitif
terhadap suhu dan tidak
dapat digunakan pada elusi
bergradien
Elektrokimia Peka terhadap perubahan
Konduktimetri 10-8 104 suhu dan kecepatan alir fase
Amperometri 10-12 105 gerak, tidak dapat digunakan
pada elusi bergradien. Hanya
mendeteksi solut-solut ionik.
Sensitifitas sangat bagus,
selektif tetapi dengan adanya
kontaminasi elektroda
menimbulkan masalah
GC
Instrumen GC tdd: sumber gas pembawa (FG), inlet
u/mengantarkan sampel ke dalam kolom, kolom dimana
proses pemisahan terjadi, thermostat u/ kolom, detektor
u/mendeteksi keberadaan senyawa kimia yg keluar dari
kolom dan sebuah rekorder.
Sbg tambahan, diperlukan bbrp peralatan shg variasi
temperatur dari bbg senyawa dapat diketahui dgn pasti
dan terkendali.
Peralatan Kromatografi Gas ini blm mengalami
perubahan fungsi selama 40 tahun, meskipun telah
mengalami perubahan desain, materi dan metodologi.
Instrumen GC
1. Gas Pembawa & Pengaturan Aliran
Pemilihan Gas Pembawa
 Gas pembawa: N2 atau He
 Efisiensi kolom dlm GC memiliki
kontribusi thd pelebaran pita
longitudinal (Dg) yg sebanding dgn
akar kuadrat massa molar gas.
 Dlm gb, N2 memiliki kemampuan yg
lebih baik drpd helium dan memiliki
kontribusi yg kecil thd HETP.
 Dari bentuknya, kurva Van Demteer
gas He memiliki efisiensi yang baik
pada kecepatan tinggi.
 Sedangkan u/ gas N2, bentuk
kurvanya sangat tajam; pada
kecepatan 10 cm-1 pemisahannya
sebanding dgn gas He pada kecepatan
50-60 cm-1 .
*
Pengaturan Kecepatan Alir
 U/ GC dgn suhu terprogram
Kesulitan: kerapatan
merupakan faktor kritis krn kolom
molekul gas pembawa mencapai suhu 200 °C atau lebih
dan pengaruhnya thd  Ketika suhu meningkat dgn
proses pemisahan tekanan konstan pd inlet,
kecepatan alir gas berkurang krn
viskositas FG meningkat *

Faktor Kecepatan dan efisiensi

koreksi pemisahan
kecepatan menurun
alir
Sumber Gas & Kemurnian
Sumber gas Kemurnian
Berupa botol atau silinder Gas pembawa hrs terbebas
bertekanan dari kontaminasi
On-site generator, hidrokarbon, uap air atau
menghslkan gas dgn tkt oksigen
kemurnian yg tinggi Mempengaruhi
kepolaran FD dan
menurunkan
sensitivitas detektor
Sistem gas pembawa
dilengkapi saringan
molekul
2. Penghantaran Sampel & Injektor
Penghantaran Sampel
Metode : menggunakan
microsyringe *
Injektor
Fungsi:
Sebagai inlet sampel
Jenis Injektor
Dapat menguapkan,
Direct Vaporization
mencampur sampel dgn
gas pembawa dan Injector
membawanya ke bagian Split/splitless Injector
kolom Cold on-column Injector
(COC)
Programmed
Temperatur Vaporization
Injector (PTV)
3. Oven Thermostat
Oven thermostat memiliki
ruangan yg dapat ditempati
oleh satu atau dua kolom, dan
dapat mencapai suhu 400oC
Kenaikan temperatur
dikendalikan 0.1oC u/
mendapatkan pemisahan yg
reprodusibel
Dengan penggunaan katup
cryogenic dgn N2 atau CO2
dlm bentuk cair, oven terjaga
dalam suhu rendah
4. Kolom
Kolom Kemas Pori pendukung bisa
FD terikat secara kimia berupa diatomit,
pada pori-pori pendukung kieselguhr, tripoli
Ø = 3.18 - 6.35 mm,
panjang 1–3 m
Aliran gas 10-40 ml/min
Berisi pori pendukung yg
stabil dan inert , FD
terikat atau terimpregnasi
ke dalamnya.
4. Kolom (contd)
Kolom Kapiler
Lapisan tipis FD berada di Kolom relatif stabil,
dalam atau terikat pada dapat dibilas u/
lapisan dalam kolom mendapatkan kembali
Ø = 100 to 530 µm, hasil yang baik
ketebalan 50 µm, panjang
12 - 100 m.
Kolom kapiler terbuat dari
aluminium, nickel atau
baja yg tahan hingga 450oC
Lapisan dalam dibuat utk
dapat berikatan dgn FD
4. Kolom (contd)
Kolom 530 µm
Merupakan kolom Keuntungan:
kapiler dgn Ø 530 nm, pjg Meminimalisasi tjdnya
5–50 m bleeding, y/ kehilangan
FD akibat terbawa aliran
Aliran gas min. 5 mL/min
gas
hingga 15 mL/min
Resolusi dan perolehan
hasilnya lebih rendah
dibdgkan kolom kapiler
dgn Ø lebih kecil.
5. Fase Diam
Polysiloxanes
Pengulangan struktur yg
mgd 2 rantai
hidrokarbon per atom
silika
Variasi kombinasi
monomer berpengaruh
thd kepolaran FD dan
stabilitasnya
5. Fase Diam (contd)
Polyethyleneglycols (PEG)
Contoh: Carbowax
Polimer polar ini dapat
digunakan u/deposisi,
impregnasi ataupun sbg
fase terikat
5. Fase Diam (contd)
Fase Diam Chiral
Berupa FD polysiloxane
yang dikombinasi dgn
10-20% cyclodextrin
u/ pemisahan campuran
rasemik, menghasilkan
dua buah puncak yg
sama
5. Fase Diam (contd)
Fase Diam Padat
FD ini berupa adsorben:
silica atau alumina yg
dideaktivasi dgn garam
mineral, saringan
molekuler, glass berpori,
grafit
U/ pemisahan N2, CO,
CO2 dan hidrokarbon dgn
Bj rendah, memiliki
efisiensi yg tinggi.
6. Detektor
Syarat: Jenis Detektor
1. Selektivitas Flame Ionization Detector
2. Kepekaan atau (FID)
keterdeteksian Thermal Conductivity
3. Tanggapan Detector (TCD)
4. Kuantitas minimun yg Nitrogen Phosphorous
terdeteksi Detector (NPD)
5. Rentang linear Electron Capture Detector
(ECD)
Photo-ionization Detector
(PID)
Aplikasi Detektor
 Aplikasi HPLC dan
Gas Chromatography

Analisis Fisisko Kimia

Environmental Analysis One of the most
important environmental applications of gas
chromatography is for the analysis of
numerous organic pollutants in air,
water,and wastewater. The analysis of
volatile organics in drinking water, for
example, is accomplished by a purge and
trap, followed by their separation on a
capillary column with a nonpolar stationary
phase.
Clinical Analysis Clinical, pharmaceutical,
and forensic labs make frequent use of gas
chromatography for the analysis of drugs.
Consumer Goods Many flavors, spices, and
fragrances are readily analyzed by GC,using
headspace analysis or thermal desorption.
Foods and beverages are analyzed either
directly or following a suitable extraction.
Volatile materials, such as those found in
spices and fragrances, often can be obtained
by headspace sampling.
Petroleum Industry Gas chromatography is
ideally suited for the analysis of petroleum
products, including gasoline, diesel fuel, Application of HPLC
and oil.
Application of HPLC

HPLC paling sering digunakan untuk :

 menetapkan kadar senyawa-senyawa
tertentu
 menentukan kadar senyawa-senyawa
aktif obat, produk hasil samping
proses sintetis atau produk-produk
degradasi dalam sediaan farmasi;
 memonitor sampel-sampel yang
berasal yang berasal dari lingkungan;
 memurnikan senyawa dalam suatu
campuran ;
 memisahkan polimer dan
menentukan distribusi berat
molekulnya dalam suatu campuran;
 kontrol kualitas;
 mengikuti jalannya reaksi sintetis.
HPLC merupakan pengembangan lebih lanjut dari
kromatografi kolom dan menjadi alat yang sangat bermanfaat
dalam analisa. Dengan didukung tekanan tingkat tinggi
sampai dengan 400 atm, fase gerak bergerak lebih cepat
melalui fase diam yang terbagi dalam serbuk halus. Penjerap
atau penyangga berupa serbuk halus untuk memperluas
permukaan fase diam. Sehingga dengan fase diam yang
mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya dan fase gerak
bergerak dengan cepat, pemisahan kromatografi yang paling
baik akan diperoleh.
Pemisahan pada HPLC tergantung pada polaritas relatif fase
diam dan fase gerak.
Untuk sample non polar digunakan Fase normal( fase diamnya
lebih polar dari fase geraknya )
Untuk sample yang bersifat polar digunakan Fase balik( fase
diamnya lebih non polar dari fase geraknya )
Fase normal HPLC

Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan

pelarut non polar misalnya heksan.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom
akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding
degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu,
senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat
melewati kolom.
Fase balik HPLC
Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui
pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik
berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa
campuran air dan alkohol seperti metanol.

Atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui
kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon
yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh
karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk
bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi

dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-
senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan
ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam
molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan
menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.

Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.
 Pemanfaatan Kromatografi Gas
Pemanfaatan Kromatografi Gas
Padat:
Mengindentifikasi dan
Mengukur jumlah dari
senyawa yang bersifat gas
seperti : oksigen , nitrogen,
dan karbonsioksida.
Mengukur senyawa senyawa
hidrokarbon dengan berat
molekul yang rendah hinggga
pentana.
Pemanfaatan Kromatografi Gas
Cair:
Merupakan metode yang
dinamis untuk pemisahan
dan deteksi senyawa-senyawa
yang mudah menguap dalam
suatu campuran dengan
meneruskan arus gas melalui
fase diamnya
 Analisis kualitatif
Analisis kualitatif berdasarkan pada perbandingan waktu
retensi yaitu waktu yang diperlukan untuk mengelusikan
senyawa setelah diinjeksikan. Waktu retensi dibandingkan
dengan waktu retensi senyawa standar dan metoda ini
disebut metoda spiking yaitu dengan menambahkan
senyawa cuplikan kepada senyawa yang akan dianalisis.
Waktu retensi atau waktu tambat ialah waktu yang sejak
penyuntikan sampai maksimum puncak. Sifat ini
merupakan ciri khas cuplikan dan fase gerak pada suhu
tertentu. Dengan menggunakan metode yang tepat
terhadap perubahan seperti aliran gas dan suhu, maka
waktu tambat dapat terulang dalam batas 1% dan dapat
digunakan untuk mengidentifikasi tiap puncak. Beberapa
senyawa mungkin mempunyai waktu tambat yang sama
atau berdekatan, tetapi tiap senyawa hanya mempunyai
satu waktu tambat saja. Waktu tambat itu tidak
terpengaruh oleh adanya komponen lain.
 Analisis Kuantitatif
Untuk menganalisis secara kuantitatif dengan
memperhitungkan luas puncak yang terbentuk
berbanding lurus dengan konsentrasi puncak tersebut. Ini
dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi yang
tepat dari setiap komponen. Ketelitian yang dapat dicapai
oleh KGC bergantung pada cara, detector, metode
integrasi, dan konsentrasi cuplikan. Untuk puncak utama,
pengukuran luas secara manual dapat diharapkan
mencapai ketelitian 1 – 2% nisbi. Dengan cara yang tepat.,
misalnya dengan integrator digit elektronik atau alat
penghitung, dapat dicapai ketelitian lebih baik dari 1%
nisbi.
Ada 5 langkah yang harus diperhatikan
dalam analisis kuantitatif:

1. Pencuplikan
Galat pencuplikan yang mungkin
terjadi: saat pengambilan,
penyimpanan, dan praperlakuan
cuplikan
2. Pemisahan kromatografi
Meminimalkan terjadinya galat yang
mungkin terjadi yang dapat
mengakibatkan tumpang tindih
puncak, pembentukan ekor. Yaitu
dengan memilih pelarut yang sesuai
dengan persyaratan (murni, dapat
bercampur dengan pelarut pengelusi,
dan tanggapan dengan detektor kecil)
3. Pengukuran Fisika
 Pendeteksian dan Pemerkuatan
(Detektor) merupakan parameter
yang penting dalam proses
pengkuantifikasian
 Mengukur luas puncak atau tinggi
puncak:
- Secara manual, yaitu puncak
kromatografi normal sering
menyerupai segitiga, luasnya dapat
dihitung dengan rumus
L= HW1/2
-Triangulasi, yaitu dengan
penggambaran garis singgung pada
kedua sisi puncak. Luas dihitung
dengan rumus triangulasi :
Luas= 1/2BH
…Mengukur luas puncak:
- Planimetri, adalah gawai mekanis yang
dipakai untuk mengukur luas puncak
dengan menjejaki garis pinggir puncak.
Luas diukur secara digital pada tombol.
-Gunting dan Timbang, adalah cara
perimetri yang memerlukan pengguntingan
puncak kromatografi dan menimbang
kertasnya pada timbangan analitik.
- Komputer on line, pengukuran dan
perhitungan tidak dilakukan oleh operator;
pada akhir pemisahan hasilnya segera
diperoleh.
4. Mengubah Sinyal menjadi
susunan
5. Pengolahan data secara
Statistik
- ketelitian
- ketepatan
- keterulangan
Pada analisis kuantitatif jumlah (%) suatu senyawa dihitung
berdasarkan pada pengukuran luas puncak kromatogram.
Puncak-puncak pada Kromatogram mirip seperti segitiga.
Salah satu cara pengukuran luas puncak. yang sering
digunakan dengan cara mendekatkan puncak (bentuk bel)
sebagai segitiga adalah :

Persentase relatif salah satu senyawa (komponen) dalam cuplikan dapat

dihitung dengan membandingkan luas komponen dengan jumlah luas semua
cuplikan.
luas komponen
% komponen = ------------------- x 100%
jumlah luas semua cuplikan
 IMPROVED HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF
AMARYLLIDACEAE ALKALOIDS
An improved HPLC method for quantitative determination
of galanthamine, lycorine and norgalanthamine was
developed. HPLC separation was achieved using a reversed
phase C18 column Symmetry® and a gradient system with
acetonitrile as an organic phase and 1% (w/v) ammonium
acetate buffer adjusted to pH 6.6 with acetic acid (flow rate
0.3 – 0.5 ml/min.). The calibration curves were linear from 5
to 150 μg/ml (r2>0.99). The reliability of the proposed
system was proved through reproducibility test with
alkaloids extracts from in vitro shoot-clumps culture
obtained from Leucojum aestivum L. and Pancratium
maritimum L.