Kromatografi

Rimadani Pratiwi
Outline

Pendahuluan

Kromatografi Kertas (KK)

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Kolom (KK)

Pendahuluan - Kromatografi

 Definisi
• Metode analisis untuk pemisahan, identifikasi dan penentuan
senyawa dalam suatu matriks campuran

 Prinsip
• Distribusi suatu senyawa antara fase diam dan fase gerak

 Sejarah
• Pertama kali dilakukan oleh botanis dari rusia Mikhail Tswett
(1872-1919) yang menggunakan kolom dengan fase diam CaCO3
untuk memisahkan pigmen warna dari ekstrak tumbuhan. Fase
gerak yang digunakan petroleum eter. Tswett memberi nama
teknik ini dengan nama “chromatography” yang berasal dari
Bahasa yunani yaitu “khromatos-warna” dan “graphos-tulis”.
Istilah-istilah dalam kromatografi

 Fase diam (stationary phase)  Eluent

• Fase yang terdapat di kolom atau
pelat yang berada pada posisi yang
tetap
• Biasanya berupa padatan atau
cairan yang dilapiskan pada
permukaan padat
 Fase gerak (mobile phase)
• Fase yang bergerak melewati
fase diam
• Biasanya berupa cairan atau gas
• Pelarut atau fase gerak yang
dilewatkan ke kolom
 Eluate
• Hasil dari pemisahan
 Elution
• Proses fase gerak melewati kolom
 Kromatogram
• Hasil kromatografi berupa grafik
Jenis-jenis kromatografi

Kromatografi

Berdasarkan Berdasarkan
fase diam dan mekanisme
fase gerak pemisahan

Kromatografi Size-exclusion
Kromatografi Kromatografi Kromatografi Kromatografi
pertukaran chromatograp Elektroforesis
planar kolom adsorpsi partisi
ion hy

Kromatografi Kromatografi
Kromatografi Kromatagogra Kromatografi
lapis tipis cair kinerja
Kertas (KK) fi kolom gas (GC)
(KLT/TLC) tinggi (HPLC)
Jenis-jenis fase diam

• Silika gel (G, GF)

• Adsorpsi-desorpsi
• Alumina
• Adsorpsi-desorpsi
• Kieselguhr
• Adsorpsi-desorpsi
• Selulosa
• Partisi
Fase gerak

• Tergantung sifat senyawa yang Non Polar

akan dipisahkan dan fase diam
yang digunakan
• Fase gerak:
• Mudah diperoleh
• Murni
• Stabil
• Mudah dihilangkan dari plat
• Tidak toksik

Polar
Hal yang harus diperhatikan dalam kromatografi

• Kepolaran senyawa target yang akan dipisahkan

• Jenis fase diam yang dipilih
• Kepolaran fase gerak yang digunakan
 Kromatografi Kertas
• Teknik yang banyak digunakan untuk pemisahan, identifikasi, atau
mengetahui kemurnian suatu zat
• Fase diam: Kertas (Cellulose)
• Prinsip: partisi
 Kromatografi Lapis Tipis (KLT/TLC)

• Teknik yang banyak digunakan untuk pemisahan, identifikasi, dan

kuantifikasi suatu senyawa
• Prinsip pemisahan
• Adsorpsi/partisi
• Kelebihan
• Simple, low cost, selective
• Kekurangan
• resolusi dan sensitivity rendah
Fase Diam KLT

• Fase diam KLT terikat pada suatu

plat yang terbuat dari kaca,
alumunium atau plastic
(polyethylene terephthalate)
• Pengikatan pada plat biasanya
menggunakan binding agent seperti
kalsium sulfat (gypsum) yang
dicampur dengan fase diam.
• Kebanyakan fase diam bersifat
adsorben (e.g silica dan alumina)
• Partisi (e.g selulosa)
 Teknik Pada Kromatografi Planar

Satu arah Dua arah/

Dua Dimensi

- Digunakan jika
pada proses
pemisahan
senyawa
memiliki nilai Rf
yang mirip
- Menggunakan 2
pelarut yang
berbeda
Aplikasi KK dan KLT

Chamber
(harus dijenuhkan)
Aplikasi KK dan KLT

 Kafein
• fase diam: silica gel
• fase gerak: kloroform:methanol
(90:10)  Isolasi
• Rf 58  Sintesis
Animasi KLT
Contoh

• Fase diam = silika gel  polar

• Solut teradsorpsi
• Fase gerak masuk  jika fase gerak lebih polar dari solute, maka solute
akan terdesorpsi dari fase diam digantikan dengan fase gerak.
• Fase gerak semakin kurang polar  desorpsi semakin lemah karena
solute tertahan di fase diam
TERIMA KASIH
 Kromatografi Kolom

• Metode untuk pemisahan

dan pemurnian suatu
senyawa
• Prinsip : Adsorpsi/partisi
• Fase diam ditempatkan di
dalam sebuah kolom
TLC to Column Chromatography
Packing Kolom – Cara Basah
Loading sample
Animasi Kromatografi Kolom
Parameter-parameter dalam kromatografi kolom

1. Resolusi (R)
2. Faktor kapasitas (k’)
3. Faktor selektifitas (α)
4. Efisiensi kolom (N)
5. Kapasitas puncak (nc)
Kromatogram

 Waktu retensi (tr)

• Waktu yang diperlukan analit untuk
bergerak dari titik injeksi ke detector

 Volume retensi (Vr)

• Volume fase gerak yang diperlukan analit
untuk mencapai puncak maksimum

 Kekosongan waktu (void time, tm)

• Waktu yang diperlukan solute yang tidak
tertahan dalam kolom untuk bergerak
dari titik injeksi ke detector

 Lebar pita (w)

• Lebar pita kromatogram
1. Resolusi (R)

• Derajat pemisahan antara 2 puncak

 Meningkatkan interaksi antara

solute dengan kolom
 Meningkatkan efisiensi kolom
 Meningkatkan selektifitas
kolom
 Rs = 1.5
2. Faktor kapasitas (k’)
• Ukuran seberapa kuat suatu solute tertahan dalam fase diam
Berdasarkan distribusi solute: Berdasarkan kromatogram:

 Sm = solute pada fase gerak

 Ss = solute pada fase diam
 Kd = koefisien partisi
 D = rasio distribusi
 Vs = volume fase diam
 Vm = volume fase gerak
 Fm = fraksi solute dalam fase
gerak

 u = kecepatan rata-rata fase gerak

 L = panjang kolom
 tm = void time
 v = kecepatan rata-rata solut
 tr = waktu retensi
 Fm = fraksi solute dalam fase gerak
3. Faktor selektivitas (α)
• Rasio faktor kapasitas untuk 2 solute yang
menunjukkan selektivitas kolom salah satu solut

 k’ = faktor kapasitas
 tm = void time
 tr = waktu retensi
4. Efisiensi Kolom (N)

• Menunjukkan ukuran kuantitatif tingkat

pelebaran pita kromatogram
• Secara teoritik: kromatografi kolom
seolah-olah terdiri dari bagian-bagian
diskrit dimana partisi solute antara fase
diam dan fase gerak terjadi  pelat
teoritis
• Efisiensi kolom didefinisikan sebagai
jumlah pelat teoritis  N = jumlah plat teoritis
 L = panjang kolom
 H = tinggi pelat teoritis
 σ2 = varians
 τ = standar deviasi (satuan waktu)
5. Kapasitas Puncak (nc)
• Jumlah maksimum solute yang dapat melalui suatu kolom

 nc = kapasitas puncak
 N = jumlah plat teoritis
 Vmin , V max = volume volume min – max fase
gerak agar solute dapat dielusi dan terdeteksi

Catatan:
 Bukan berarti kolom tersebut dapat memisahkan 86 solute
 Pada kebanyakan kondisi, kapasitas puncak yang diperoleh biasanya
kurang dari perhitungan teoritis
 Kolom dengan jumlah plat teoritis yang besar, lebih mungkin untuk dapat
memisahkan campuran kompleks
Simetri dan Asimetri Kromatogram

 Tailing  biasanya terjadi ketika suatu sisi aktif dari fase

diam menahan solute lebih kuat dari sisi lainnya
 Fronting  biasanya terjadi jika terlalu banyak injek sample
TERIMA KASIH
 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

 Teknik kromatografi yang menggunakan fase gerak berupa cairan

 Sampel
• liquid atau solid yang dilarutkan dalam pelarut yang sesuai
 Prinsip
• pemisahan berdasarkan interaksi antara fase diam dan fase gerak
Animasi HPLC
Wadah fase gerak HPLC

• Harus bersih dan inert (wadah pelarut

laboratorium)
• Daya tampung 1-2 L pelarut
Pompa HPLC

• Menjamin proses penghantaran fase gerak agar berlangsung secara

tepat, reprodusible, constant, dan bebas dari gangguan
• Inert terhadap fase gerak
• Bahan: gelas, baja tahan karat, Teflon, atau batu nilam
• Memberikan tekanan hingga 5000 psi dan mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit
Injector HPLC

• Sampel disuntikan secara langsung ke

dalam injector
• Alat penyuntik terbuat dari kaca atau
tembaga tahan karat
• Autosampler
Autosampler HPLC
 Parameter Kolom Konvensional Mikrokolom
Kolom HPLC
Bahan Stainless steel Stainless steel
Diameter internal 2,1 - 4,6 mm 44 – 200 µm
Panjang kolom 30 – 300 mm Hingga beberapa meter
Efisiensi kolom 40.000 – 60.000 Hingga 250.000
(plat teoritis)
Packing kolom Partikel silika berpori 3 Ukuran partikel 3 – 5 µm
– 10 µm
Kecepatan alir 1-3 mL/menit 10 – 100 µL/menit
Kinerja • Paling umum • Konsumsi fase gerak 80%
digunakan dalam atau lebih kecil dari kolom
analisis rutin konvensional
• Sangat efisien dan sensitive
(cocok jika jumlah sample
sedikit)
• Menghasilkan sinyal yang
lebih besar pada detector
• Tidak setahan kolom
konvensional dan jarang
digunakan dalam analisis
rutin
Fase Diam HPLC

• Kebanyakan berupa silika yang

dimodifikasi secara kimiawi 
Bonded stationary phase
• Permukaan silika bersifat polar
dan sedikit asam karena adanya
 R  alkil atau alkil tersubstitusi
residu gugus silanol (Si-OH)
 Gugus R ini menentukan sifat dari fase
• Untuk mencegah fase diam larut
diam
dalam fase gerak dan keluar dari
kolom, maka fase diam ini  Normal-phase chromatography
direaksikan dengan partikel silika (kromatografi fase normal)
dengan organoklorosilane  silika  Reverse-phase chromatography
fase terikat (kromatografi fase terbalik)
Fase Diam HPLC
 Normal-phase chromatography
• Fase diam : polar
• Fase gerak : non-polar
• R  gugus polar  cyano (-C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH), amino (-
C3H6NH2)

 Reverse-phase chromatography
• Fase diam : non-polar
• Fase gerak : polar
• R  n-octyl (C8), n-octyldecyl (C18)
• Menggunakan buffer pada fase gerak (pH < 7.5) Karena dalam suasana basa silika
akan terhidrolisis
• Paling banyak digunakan karena range kepolarannya lebih luas (rendah, sedang,
tinggi)  ODS (Oktadesil silika, C18)
Animasi Fase Diam HPLC
Fase gerak HPLC
• Sebelum digunakan harus di saring dan degassing (penghilangan gas) terlebih
dahulu
• Gunakan pelarut, buffer, reagen dengan HPLC grade
• Elusi solute dari kolom tergantung kepolaran
• Normal-phase chromatography
• Fase diam : polar
• Fase gerak : non-polar
• Solut yang kurang polar akan kurang teretensi pada fase diam sehingga akan
terelusi lebih dulu dari kolom. Penggunaan fase gerak yang kurang polar akan
membuat waktu retensinya lebih lama

• Reverse-phase chromatography
• Fase diam : non-polar
• Fase gerak : polar
• Solut yang lebih polar akan terelusi lebih dulu
• Fase gerak yang lebih polar akan membuat waktu retensi lebih lama
Indeks kepolaran (Polarity index, P)

• Ukuran kuantitatif kepolaran suatu pelarut

• Bisa menggunakan campuran 2 pelarut atau

lebih untuk memodifikasi tingkat kepolaran

Fase gerak yang digunakan pada RP HPLC adalah

campuran 60% v/v water dan 40% v/v methanol.
Berapa indeks kepolaran fase gerak tersebut?

Pab = (0,6)(10,2) + (0,4)(5,1) = 8,2

Isocratic vs gradient elution

 Isocratic elution
• Penggunaan satu jenis atau campuran fase gerak yang komposisinya dijaga
constant selama pemisahan

 Gradient elution
• Penggunaan fase gerak campuran yang komposisinya berubah selama proses
pemisahan
Animasi Isocratic vs gradient elution
Sampel

• Sampel dalam bentuk cairan dapat langsung

dianalisis setelah dihilangkan partikel-partikel
pengganggu
• Solid sampel dilarutkan terlebih dahulu dalam
pelarut yang sesuai
• Volume sampel (0,5 µl – 2 ml)
Detektor HPLC
 Detektor spektrofotometri UV-Vis
• UV/Vis
• Photodiode-array (PDA)
 Detektor Fluoresensi
 Detektor elektrokimia
• Amperometri
• Voltametri
 Detektor indeks bias (universal)
 Detektor Mass Spectrometry (universal)
Detektor spektrofotometri
 Spektrofotometri UV-Vis
 Paling banyak digunakan dalam bidang farmasi
 Detektor dengan λ tetap (254 nm, 280 nm, 334 nm, dll),
 Detektor dengan λ bervariasi, dapat memilih λ yang memiliki sensitifitas lebih
tinggi
 kromatogram  absorbansi sebagai fungsi waktu

 Photodiode-array (PDA)
 Termasuk detector UV-Vis
 Mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang
gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run)
 Memberikan lebih banyak informasi komposisi sample disbanding UV-Vis
 Kromatogram  absorbans sebagai fungsi panjang gelombang dan waktu

 Fluoresensi
 Lebih sensitive dan selektif
 kromatogram  intensitas sebagai fungsi waktu

 Keterbatasan: harus menggunakan fase gerak yang tidak mempunyai

absorbansi yang sama dengan analit
Aplikasi HPLC

• Banyak digunakan dalam penetapan kadar obat

• Kualitatif dan kuantitatif
• Analisis lingkungan
• Farmasi
• Industri
• Forensik
• klinik
Terima Kasih