Planar Chromatography

Lestyo Wulandari
 Summary Planar Chromatography

A. Introduction

B. Theory

C. Types of planar Chromatography

D. Stationary and mobile phases of TLC

E. Sampel Application

F. Elution and Development

F. Qualitative and quantitative analysis

parameter KLT KCKT KG

F diam Datar Kolom Kolom

F gerak Cair Cair Gas

Aplikasi sampel ditotolkan diinjeksi diijneksi

Pergerakan f kapilaritas pompa pompa

gerak
Retensi Retardaction factor Retention time Retention time
Kromatogram Rf vs RD tr vs RD tr vs RD
Sistem Deteksi terpisah Terpadu Terpadu /online
/online
Fase 3 fase 2 fase 2 fase
 Planar Chromatography
A. Introduction
1. Planar chromatography adalah teknik kromatografi di mana
media pendukungnya adalah flat bed atau plane daripada kolom

2. Ini adalah jenis kromatografi pertama yang dikembangkan tetapi

saat ini tidak digunakan sebanyak teknik kromatografi kolom.

3. Secara tradisional kromatografi planar telah

dilakukan dengan mengaplikasikan pita kecil
sampel ke salah satu ujung piring yang
mengandung lapisan fase diam. Ujung pelat dekat
titik aplikasi sampel kemudian ditempatkan dalam
fase gerak dan pelarut diizinkan untuk bermigrasi
ke atas piring dengan aksi kapiler. Sebagai pelarut
perjalanan oleh sampel, ia mulai membawa zat
terlarut dengannya. Zat terlarut yang berbeda akan
memiliki interaksi yang berbeda dengan fase diam
dan bergerak, membuatnya bermigrasi dengan
kecepatan yang berbeda di atas lempeng
4. Dalam kromatografi planar modern, pendekatan dasar yang sama
digunakan, tetapi fase gerak dapat diterapkan oleh pompa atau gaya
selain aksi kapiler. Teknik-teknik yang lebih baru juga cenderung lebih
otomatis daripada jenis tradisional kromatografi planar dalam hal
aplikasi sampel deteksi.
5. Attributes of Planar chromatography
When Is TLC Used?
TLC digunakan jika
 zat-zat tersebut tidak mudah menguap atau volatilitasnya rendah
 sejumlah besar sampel harus dianalisis secara bersamaan, berbiaya
efektif, dan dalam jangka waktu terbatas
 sampel yang akan dianalisis akan merusak atau menghancurkan kolom
LC (kromatografi cair) atau GC (kromatografi gas)
 pelarut yang digunakan akan menyerang sorben dalam kemasan kolom
LC
 setelah kromatografi, semua komponen sampel harus dapat dideteksi
(tetap di awal atau bermigrasi dengan depan)
B. Theory
 Prinsip Pemisahan
 Perbedaan antara kromatografi kolom dan
planar
 Penyimpanan
 Laju aliran
 Efisiensi
Principle of Separation

1. Metode berdasarkan polaritas

LSC (adsortion), LLC (partisi)
2. Metode berdasarkan muatan ionik
KIE, elektroforesis
3. Metode berdasarkan ukuran
ultrafiltrasi, GPC
Differences between column and planar
chromatography

 Salah satu perbedaan antara kromatografi kolom dan planar

adalah adanya fase ketiga dalam sistem planar. Fase ketiga ini
adalah atmosfer atau uap gas yang terletak di atas permukaan.
Untuk mendapatkan pemisahan yang dapat direproduksi, perlu
untuk mengontrol fase ini serta fase diam dan bergerak.

 kromatografi planar memisahkan berdasarkan jarak perjalanannya

yang berbeda dalam jumlah waktu yang ditentukan. Kromatografi
kolom memisahkan zat terlarut dengan waktu perjalanannya yang
berbeda sepanjang jarak tertentu, panjang kolom. Perbedaan ini
berarti bahwa ekspresi yang sedikit berbeda untuk retensi,
efisiensi dan resolusi harus digunakan untuk kromatografi planar.
4. Retention:
a. The fundamental parameter in TLC is the Retardation factor Rf:

Rf = Zs / (Zf – Zo)

Zf: Distance traveled by the solvent front from the point of application.
Zs: Distance traveled by the solute front from the point of application.

Zo: Distance between the point of application of solvent and solute.

Zf

Zs

Zo
 5. Flow rate

• laju aliran fase gerak melalui sistem dengan aliran kapiler tidak konstan
dengan waktu
• Untuk sistem dengan aliran kapiler, perubahan kecepatan fase gerak
dengan waktu dijelaskan oleh persamaan berikut:

Zf

Zs where
K= flow constant [mm2/s]
ZF = distance between the solvent front
Zo and the solvent level [mm]
t = development time [s]
5. Flow rate

where
K= flow constant [mm2/s]
ZF = distance between the
solvent front and the solvent
level [mm]
t = development time [s]
5. Efficiency

The efficiency of a separation in planar chromatography is described in terms

of theoritical plate, plate height, capacity factor (k) and resolution.

(a) Theoritical plate (N)

N = (Zs / )2

N = 16*(Zs / Wb)2

N: number of theoretical plates;

: standard deviation of the solute band (in distance units)

Wb: baseline width of the solute band (in distance units)

b. The value of Rf is related to the capacity factor (k) of the solute by the
following equation:

k = (1- Rf)/ Rf

c. The plate height equation for a planar system with capillary flow is
shown below

H = Zf /N

d. Resolution:

Zs
Rs =
wavg
C. Types of planar Chromatography

1. Ada tiga jenis utama kromatografi planar

    a. kertas kromatografi
           b. Kromatografi lapis tipis (KLT)
c. elektroforesis

2. Kromatografi Kertas adalah jenis khusus kromatografi planar di mana kertas

digunakan sebagai bahan pendukung dan fase diam. Meskipun metode ini
penting secara historis, karena merupakan jenis kromatografi pertama yang
dijelaskan, metode ini jarang digunakan dalam praktik saat ini.

3. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah jenis utama kromatografi planar yang
digunakan saat ini. Ini melibatkan penggunaan bahan non-kertas sebagai
media pendukung.

4. TLC konvensional dan TLC kinerja tinggi (HPTLC): dengan efisiensi

pemisahannya.
Stationary and mobile phases of TLC

Fase gerak yang digunakan dalam TLC juga pada dasarnya sama dengan yang
digunakan dalam kromatografi cair kolom. Jenis persis yang digunakan
akan tergantung pada fase diam dan jenis pemisahan yang akan
dilakukan.
Fase diam pada KLT:
1. Silika gel, alumina, kieselgur (KLT polaritas)
2. Sellulosa, kiselguhr, silika gel (KLT polaritas)
3. Selulosa Penukar Ion, Resin penukar ion (KLT muatan ion)
4. Gel tipe Sephadex, biogel (ukuran KLT)
5. Poliamida (polaritas)
Fase diam organik tidak dapat digunakan dg eluen asam kuat
FASE DIAM PADA KLT

1. Silika gel

silikon dioksida, tiap atom silikon

dikelilingi empat atom oksigen,
bentuk tetrahedron. Pada
permukaan silika gel, pasangan
bulk (SiO2)x surface
elektron bebas dari atom oksigen
berikatan dengan hydrogen
FASE DIAM PADA KLT
1. Silika gel

Macam produk silika gel

• Silika gel dengan perekat gypsum sebanyak 5-15%

dikenal dengan nama Silika Gel G, untuk analit yang berfluoresen

atau analit yang berwarna setelah diberi panampak noda

• Silika gel tanpa perekat

lebih stabil dibandingkan silika gel dg perekat. Dikenal dengan

nama Silika gel N atau H

• Silika gel untuk preparatif

biasanya dengan perekat gypsum dan campuran 2 indikator 

254nm dan 366nm. Dikenal dg Silika gel GF254,366
FASE DIAM PADA KLT
1. Silika gel

Macam produk silika gel

• Silika dengan perekat dan indikator pendarfluor

untuk analit yang tidak berfluoresensi diperlukan suatu fase diam

yang berfluoresensi, sehingga noda analit akan tampak pada
radiasi UV sebagai suatu noda analit yang menutup fluoresensi
fase diam (quenching fluorescence) berwarna biru dibawah lampu UV

Indikator pendarfluor : Mangan-activated tin silicate / tin cadmium

sulphide berwarna hijau dibawah lampu UV

Dikenal dg nama Silika gel F254 karena berfluoresensi pd  254nm

FASE DIAM PADA KLT
1. Silika gel

Macam produk silika gel

• Modifikasi Silika (Silica bonded phase)
• Reversed-Phase

• Amino-Bonded Phase.

• Cyano-Bonded Phase.

• Diol-Bonded Phase.

• Chiral-Bonded Phases.
FASE DIAM PADA KLT
2. Alumina

Alumina / Al2O3 adalah penjerap/fase diam anorganik yang

aktif kuat dg pH=9, alumina netral pH=7, alumina asam=4

digunaan untuk senyawa yang agak polar, pemisahan gula-

gula atau asam amino yang bersifat hidrofilik kuat

3. Kieselgur

adalah fosil dari diatomea sejenis ganggang laut yaitu

asam silikat dan dipakai sebagai penjerap alami pada KLT.
FASE DIAM PADA KLT
4. Selulosa

Sama dengan pd kromatografi kertas, beda pada serat

selulosa pada KLT lebih pendek

Selulosa yang dipakai:

• Native fibrous cellulose dikenal sbg MN 300

• Microcrystalline cellulose dikenal sbg avicel

Selulosa dapat dipakai sebagai RPTLC

Selulosa dapat dipakai Cellulose ion exchanger dg cara esterifikasi

gugus hidroksil dengan gugus asam atau basa. Contoh
diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose), carboxylmethyl-
cellulose (CM-cellulose)
FASE DIAM PADA KLT
4. Sepadex

merupakan cross-linked polymeric dextran gel. Sepadex gel

terdapat dalam 4 ukuran partikel :

coarse 100-300m

medium 50-150m

fine 20-80m

superfine 10-40m

digunakan utk size exclution chromatography.

E. sample application
 Manual
 Semi automated : Nanomat, Linomat
 Automatic : Automatic TLC Sampler (ATS)
F. Elution and Development:

1. Zat terlarut dapat dielusi dalam kromatografi planar menggunakan elusi

isokratik atau gradien.

2. For gradient elution in TLC

F. Elution and Development

Pengembangan linear adalah yang paling umum dan akrab dari teknik ini

• Teknik ini melibatkan pengaplikasian zat terlarut pada penopang pada

pelat persegi panjang dan dielusi dengan fase gerak yang mengalir hanya
dalam satu arah.
b. Pengembangan linier dapat dilakukan dengan sampel dan fase gerak
yang diterapkan di bagian bawah penopang (pengembangan menaik), di
bagian atas penopang (pengembangan turun), atau ke tepi penopang
yang terbentang rata (pengembangan mendatar).

i. Ascending and descending development

ii. Horizontal development

1. Pelat HPTLC (lapisan menghadap ke

bawah)
2. piring kaca untuk konfigurasi sandwich
3. reservoir untuk mengembangkan
pelarut
4. strip kaca
5. pelat penutup
6. pendingin baki
Standar Kerja
Kromatografi Planar
1. Menyiapkanlah dan menjenuhkan larutan pengembang

Tuangkan bahan pelarut ke

dalam chamber/beaker pada
kedalaman kurang dari 0.5 cm
 Untuk membantu
kejenuhan kolom TLC
dengan bahan pelarut
yang mudah menguap,
garis bagian dari di
dalam beaker kertas
saring.

Tutup beaker dengan kaca arloji.

2. Menyiapkan lempeng TLC

Di bawah baris,tandai dengan

angka perlahan sample yang
akan ditotolkan pada lempeng.
Beri jarak antar sample
sedemikian rupa sehingga
mereka tidak bergerak bersama-
sama, sekitar 4 sample pada
lempeng 5 cm yang dianjurkan.
Gunakan pensil namun jangan
ditekan terlalu keras Karena
dapat mengganggu permukaan
lempeng.
3. Penotolan pada lempeng TLC

menambahkan beberapa mengaduk sampai larut

tetesan bahan pelarut
yang mudah menguap
Celupkan pipet kapiler Yakinkan larutan Yakinkan jika seluruh
pada larutan sudah terisi larutan dalam microcap
telah mengalir

lakukan proses membilasan sebanyak

3 kali!

bilas microcap dengan Keringkan dengan

bahan pelarut bersih menyentuhkannya pada
handuk
Lempeng dengan bintik
noda yang siap untuk
dikembangkan
 4. Mengembangkan lempeng

Letakan lempeng dalam kolom pengembang

Solven akan bergerak
pastikan solvent tidak terlalu dalam
berdasarkan gaya
kapilaritas.
sekitar 3/4 jalan pada Sudah mencapai 0.5 Siap dipindahkan
lempeng cm dibawah batas dari beaker.

dengan cepat tandai satu Apabila noda berwarna,

garis pada lempeng tandai dengan pensil.
dengan suatu pensil
5. Visualisasi noda

- Visualisasi langsung
- pewarnaan (disemprot dg penampak noda)
- Lampu UV
- Densitometer (sumber radiasi D2, Tungsten, Merkuri)

Lampu UV Tampak dua noda di

bawah sinar UV
DENSITOMETER
(CAMAG TLC SCANNER 3)
Sistem Optic Densitometer
 The Beer-Lambert Law
The amount of radiation absorbed may be measured in a number of
ways:
Transmittance, T = P / P0
% Transmittance, %T = 100 T

Absorbance,
A = log 1 = ε . c . b
A = log10 P0 / P
T
A = log10 1 / T
A  Absorban
A = log10 100 / %T
T  % transmitan
A = 2 - log10 %T 
ε  absorbansi molar (L. mol-1.cm-1)
c  konsentrasi (mol. L-1)
b  tebal larutan
Quantitative analysis
The Kubelka-Munk Theory of Reflectance

Detektor fotometrik mengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan pada

sisi pelat yang tidak dimurnikan. Sinyal adalah fungsi dari jumlah molekul
penyerap dalam lapisan. Hukum Beer-Lambert tidak dapat digunakan
untuk menghitung konsentrasi zat, karena hamburan dalam lapisan
memberikan kontribusi yang signifikan. Solusi terbaik adalah persamaan
hiperbolik yang diajukan oleh Kubelka dan Munk.

R = 2,303  c
S
R = Diffuse reflectance
 = Extinction Coefficient
C = Concentration
S = Scattering coefficient
Chromatogram evaluation with
densitometry
 Evaluasi kuantitatif pelat TLC / HPTLC selalu dilakukan dalam mode
penyerapan atau fluoresensi.

 Pengurangan sinyal (absorbansi) atau kenaikan (fluoresensi) antara

zona dan area kosong lapisan adalah pengukuran yang menjadi dasar
analisis kuantitatif. Sinyal dari masing-masing zona zat dibandingkan
dengan latar belakang pelat bebas zat. (R   C)
R = 2,303  c
S
 Untuk perhitungan kalibrasi dan hasil, data puncak yang diperoleh
tidak diketahui dibandingkan dengan data yang diperoleh untuk
standar pada pelat yang sama.
Qualitative analysis
Qualitative analysis

Sampel Rf Senyawa r(s,m) r(m,e) purity identity

TEH CELUP A 0,64 Kafein 0,999271 0,999675 ok Kafein
TEH CELUP B 0,64 Kafein 0,999332 0,999691 ok Kafein
TEH CELUP C 0,65 Kafein 0,999389 0,999677 ok Kafein
TEH CELUP D 0,65 Kafein 0,999168 0,999704 ok Kafein
TEH CELUP E 0,64 Kafein 0,999379 0,999857 ok Kafein
TEH CELUP F 0,64 Kafein 0,999231 0,999833 ok Kafein
TEH CELUP G 0,65 Kafein 0,997549 0,999782 ok Kafein
TEH CELUP H 0,64 Kafein 0,996340 0,999871 ok Kafein
Tahapan ASF dengan KLT
1. Menentukan analit dan matriks
2. Menentukan sifat fiskim analit dan matriks
3. Menentukan metode  KLT densitometri
4. Optimasi kondisi analisis
5. Validasi metode analisis
6. Aplikasi
Optimasi Kondisi Analisis KLT
1. Optimasi fase diam, dipilih fase diam yang dapat memisahkan analit
dg matriks, ketersediaan fase diam
2. Optimasi pelarut
dipilih pelarut yang dapat melarutkan analit, mudah menguap
3. Optimasi fase gerak, menyesuaikan f diam, memberikan
kromatogram yang efisien, Rf berada di rentang 0,2-0,8
4. Optimasi konsentrasi
dipilih konsentrasi dengan preparasi sampel yang efisien (tdk byk
pengenceran), memberikan respon yg signifikan
5. Optimasi panjang gelombang, dipilih panjang gelombang dengan
respon tinggi dan kromatogram efisien
Pemisahan berdasarkan
polaritas (sifat fiskim yg diamati)
 Hidrokortison
 Log P =1,6 pKa 5,1

 Nipagin
 Log P = 2 pKa =8,4

 Betamethasone
 Log P =1,9 pKa?
 Benzoic acid
 Log P =1,9 pKa =4,2
Uji selektifitas
 Dapat memisahkan respon analit dg respon
matriks
 Memastikan respon matriks tidak
mengganggu respon analit
 Pd kromatografi dilihat dari nilai Resolusi
Uji purity dan uji identity pd
KLT densitometri
 Uji purity (uji kemurnian)
 Membandingkan spektra pada tiga posisi (awal,
tengah, akhir) puncak kromatogram
 Bila spektra sama/identik  murni

 Uji identitas (menentukan identitas dari sampel berdasar

karakter yang spesifik)  uji spesifisitas
 Membandingkan spektra sampel dg spektra standar
 Bila spektra sama/identik identitas sampel=standar
Uji purity pd KLT densitometri

Sampel Rf Senyawa r(s,m) r(m,e) purity identity

TEH CELUP A 0,64 Kafein 0,999271 0,999675 ok Kafein
TEH CELUP B 0,64 Kafein 0,999332 0,999691 ok Kafein
TEH CELUP C 0,65 Kafein 0,999389 0,999677 ok Kafein
TEH CELUP D 0,65 Kafein 0,999168 0,999704 ok Kafein
TEH CELUP E 0,64 Kafein 0,999379 0,999857 ok Kafein
TEH CELUP F 0,64 Kafein 0,999231 0,999833 ok Kafein
TEH CELUP G 0,65 Kafein 0,997549 0,999782 ok Kafein
TEH CELUP H 0,64 Kafein 0,996340 0,999871 ok Kafein
Uji purity dan identity
Sampel Kesimpulan
Rf R(s,m) R(m,e)
Track uji kemurnian
4 0,40 0,9995 0,999301 ok
5 0,39 0,999563 0,999240 ok
9 0,39 0,999697 0,999263 ok

Sampel Kesimpulan
Rf R(s,s) R(s,a)
Track uji identitas

4 0,40 0,999336 - ok

5 0,39 0,999202 - ok

9 0,39 0,999155 0,993611 ok

References :
 Sherma. J & Fried. B. 2003. Handbook of Thin Layer
Chromatography Third Edition, Marcel Dekker, Inc. New York

 Elke Hahn-Deinstrop. 2007. Applied Thin-Layer

Chromatography. WILEY-VCH Verlag GmbH

 Peter E. Wall. 2005. Thin-layer Chromatography. A Modern

Practical Approach. The Royal Society of Chemistry. UK
Tugas membuat prosedur
analisis sediaan obat
1. Tablet
2. Tablet
3. Kapsul
4. Sirup Larutan
5. Sirup emulsi
6. Sirup Suspensi
7. Dry sirup
8. Krim
9. Krim
10. salep
Isi makalah
1. Menentukan analit dan matriks sampel
 Formula dibuat
 Analit :
 Matriks :
2. Menentukan sifat fiskim analit dan matriks
1. Analit : pemerian, struktur kimia, kelarutan, BM, TD, TL, ʎmax, log P
2. Matriks : pemerian, struktur kimia, kelarutan, BM, TD, TL, ʎmax, Log P
3. Menentukan metode analisis
Alasan pemilihan metode analisis
4. Menentukan preparasi sampel
Menyesuaikan bentuk sediaan
5. Validasi metode analisis
Menentukan kondisi analisis : pelarut, f diam, f gerak, laju alir, panj gel
pengamatan, kons uji
6. Aplikasi
Prosedur lengkap spt buku petunjuk prak
Metode Analisis Spekro UV Vis

 Analit yg dapat terdeteksi dg spektro uv vis adalah

yang memiliki gugus kromofor atau kromofor dan
auksokrom
 Gugus kromofor : gugus dg ik rangkap tekonjugasi
(C-C=C-C=C-C)
 Auksokrom : gugus yang memiliki atom dg
pasangan elektron bebas (O,P,S,N)
Optimasi kons uji
A11 = 715
maksudnya lautan paracetamol konsentrasi 1%b/v dalam kuvet 1cm akan
memberikan absorbansi sebesar 715

Syarat rentang abs yg memberikan korelasi linier terhadap konsentrasi adalah

antara abs 0,2-1,5 (tergantung kepekaan spektrofotomreter uv vis)

Agar abs 0,2  kons ppm????

0,2/715 x 10.000ppm = 2,8ppm
Agar abs 1,5  kons ppm????
1,5/715 x 10.000ppm = 21ppm
Konsentrasi uji berada pd rentang 2,8 ppm – 21 ppm

1% b/v 1 gram analit dalam 100mL pelarut

Ppm = µg/mL
1% = 10.000 ppm
Any Comments, Questions, and
Suggestions ?
Thanks for your Help!
Wassalam…