Parameter Kesesuaian Sistem

dalam HPLC dan Spektrofotometri

Ida Musfiroh &

Rimadani Pratiwi
Uji Kesesuaian Sistem (UKS)

• Uji kesesuaian sistem dapat didefinisikan sebagai

serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode
tersebut dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang
dapat diterima.
• Uji kesesuaian sistem menjamin bahwa sistem dan
prosedur yang digunakan harus mampu memberikan
data yang dapat diterima.
Uji Kesesuaian Sistem (UKS)

UKS ditujukan untuk memastikan efektivitas sistem

operasional dari suatu sistem sebelum digunakan untuk
analisis (terutama analisis Kuantitatif)

Spektrofotometri HPLC
UKS - Spektrofotometri

UKS pada Spektrofotometri meliputi:

1. Kalibrasi Skala Absorbansi
2. Kalibrasi Skala Panjang Gelombang
3. Penentuan Resolusi
4. Penentuan Adanya Sesatan Sinar (Stray Radiation)
UKS - Spektrofotometri

1. Kalibrasi Skala Absorbansi

• Menggunakan larutan K2Cr2O7 0.0005% dalam H2SO4 0.005 M

• Blanko: H2SO4 0.005 M

Panjang gelombang 350.0 nm

Absorbansi 0.640 ± 0.010
UKS - Spektrofotometri

2. Kalibrasi Skala Panjang Gelombang

• Menggunakan larutan holmium perklorat 5% b/v

Panjang gelombang:
241 ± 1 nm
287,15 ± 1 nm
361,5 ± 1 nm
UKS - Spektrofotometri

3. Penentuan Resolusi (daya pisah)

• Menggunakan larutan toluene 0,02% b/v dalam heksan

Rasio absorbansi pada 269 dan 266 nm ≥ 1.5

UKS - Spektrofotometri

4. Penentuan Adanya Sesatan Sinar (Stray Radiation)

• Sesatan sinar: Sinar yang sampai ke detektor tetapi tidak melewati
sampel
• Menggunakan larutan KCl 1,2% b/v dalam air, blanko air pada λ 200
nm

Jika absorbansi ≤ 2
Terjadi sesatan sinar
Kriteria Uji Kesesuaian Sistem Spektrofotometri

No Parameter Kriteria
1. Kalibrasi Skala Absorbansi λ 350.0 nm
A 0.640 ± 0.010
2. Kalibrasi Skala Panjang gelombang 241 ± 1 nm
287,15 ± 1 nm
361,5 ± 1 nm

3. Resolusi R ≥ 1,5
4. Sesatan sinar Jika absorbansi ≤ 2
Terjadi sesatan sinar
UKS - HPLC

UKS pada HPLC meliputi:

1. Keberulangan penyuntikan (presisi)
2. Resolusi (R)
3. Faktor kapasitas (k’)
4. Faktor selektifitas (α)
5. Efisiensi kolom (N)
6. Faktor ikutan (Tailing factor)
Kromatogram

§ Waktu retensi (tr)

• Waktu yang diperlukan analit untuk
bergerak dari titik injeksi ke detector

§ Volume retensi (Vr)

• Volume fase gerak yang diperlukan analit
untuk mencapai puncak maksimum

§ Kekosongan waktu (void time, tm)

• Waktu yang diperlukan solute yang tidak
tertahan dalam kolom untuk bergerak
dari titik injeksi ke detector

§ Lebar pita (w)

• Lebar pita kromatogram
1. Keberulangan penyuntikan

• Dari penyuntikan ulang larutan baku pembanding, yang dinyatakan

sebagai simpangan baku relatif (SBR) atau Koefisien Variasi (KV):

100 ∑ (Xi – X)2

SBR(%)= ----- ------------ RSD (SBR) < 2%
X n-1

SBR = simpangan baku relatif (%)

X = harga rata2 dari n kali penyuntikan
Xi = pengukuran individual/waktu retensi atau luas puncak atau tinggi puncak kromatogram
n = jumlah penyuntikan (n ≥ 6 kali penyuntikan ulang)
2. Resolusi (R)

• Derajat pemisahan antara 2 puncak

¢ Meningkatkan interaksi antara solute dengan

kolom
¢ Meningkatkan efisiensi kolom

¢ Meningkatkan selektifitas kolom

R ≥ 1.5
3. Faktor kapasitas (k’)
• Ukuran seberapa kuat suatu solute tertahan dalam fase diam
Berdasarkan distribusi solute:
2 < k’ < 10
Berdasarkan kromatogram:
¢ Sm = solute pada fase gerak
¢ Ss = solute pada fase diam
¢ Kd = koefisien partisi
¢ D = rasio distribusi
¢ Vs = volume fase diam
¢ Vm = volume fase gerak
¢ Fm = fraksi solute dalam fase
gerak
¢ u = kecepatan rata-rata fase gerak
¢ L = panjang kolom
¢ tm = void time
¢ v = kecepatan rata-rata solut
¢ tr = waktu retensi
¢ Fm = fraksi solute dalam fase gerak
4. Faktor selektivitas (α)
• Rasio faktor kapasitas untuk 2 solute yang menunjukkan selektivitas kolom
salah satu solut

¢ k’ = faktor kapasitas
¢ tm = void time
¢ tr = waktu retensi

α >1
5. Efisiensi Kolom (N)

• Menunjukkan ukuran kuantitatif tingkat

pelebaran pita kromatogram
• Secara teoritik: kromatografi kolom
seolah-olah terdiri dari bagian-bagian
diskrit dimana partisi solute antara fase
diam dan fase gerak terjadi à pelat
teoritis
¢ N = jumlah plat teoritis
• Efisiensi kolom didefinisikan sebagai ¢ L = panjang kolom
jumlah pelat teoritis ¢ H = tinggi pelat teoritis
¢ σ2 = varians
¢ τ = standar deviasi (satuan waktu)

N ≥ 10.000
6. Faktor ikutan (Tailing factor)

Tf = 1 Tf < 1 Tf > 1
Faktor Asimetri
 Kriteria Uji Kesesuaian Sistem HPLC

No Parameter Kriteria
1. Keberulangan Koefisien variasi < 2%
2. Resolusi R ≥ 1,5
3. Faktor kapasitas 2 < k’ < 10
4. Faktor selektivitas α >1
5. Efisiensi kolom N ≥ 10.000
6. Faktor ikutan/simetris Tf = 1
Terima Kasih