BAB IV.

KROMATOGRAFI CAIR

A. INTERAKSI SOLUT-FASE GERAK-FASE DIAM

Sistem paling sedrhana dari kromatografi cair adalah kromatografi kolom
terbuka. Sistem ini tergolong non-instrumental method. Hampir semua sampel
dapat dianalisis dengan metode ini dan tidak perlu pre treatment seperti
penguapan pada kromatografi gas. Hal yang menjadi kekurangan dari sistem ini
adalah keterbatasannya dalam menjaga laju alir fase gerak dan membuat fase
diam terpacking secara merata. Oleh karena itu dalam banyak kasus sering
terjadi pelebaran pita kromatogram.
Ada banyak macam interaksi solut-fase diam-fase gerak yang mendasari
terjadinya proses pemisahan dalam kromatografi ini, yaitu : Adsorpsi permukaan
(didasarkan pada mekanisme adsorpsi-desorpsi solut dalam fase diam)
1. Partisi (didasarkan pada partisis solut dalam fase diam dan fase gerak)
2. Ion exchange atau pertukaran ion (didasarkan pada pertukaran ion solut
dan fase diam)
3. Eksklusi (didasarkan pada perbedaan ukuran partikel solut)

Kromatografi adsorpsi
Dalam kromatografi adsorpsi fase diam yang digunakan merupakan
padatan biasanya silika dan alumina. Solut dan fase gerak dapat berinteraksi
dengan sisi polar dari fase diam. Pemisahan terjadi oleh karena perbedaan
kekuatan adsorpsi solut terhadap fase diam.
Fase diam alumina dapat digunakan untuk analisis amina dan derivatnya.
Fase gerak yang dapat dipakai adalah heksana, kloroform atau 2-propanol.
Sedangkan fase diam silika dapat digunakan untuk analisis eter, ester, porphirin
dan vitamin larut lemak. Fase gerak yang dapat dipakai adalah heksana,
kloroform dan 2-propanol.

Kromatografi Partisi
Pemisahan dalm kromatografi partisi terjadi oleh karena adanya partisis
solut dalam dua fase cair yang berbeda. Perjalanan solut dalam kolom hampir
sama dengan perjalanan solut dalam ekstraksi berkelanjutan. Solut yang lebih
larut dalam fase diam akan tertahan lebih lama dalam kolom daripada solut yang
kelarutannya dalam fase diam kecil. Ada dua tipe dalam kromatografi partisi yaitu
:
1. Normal phase chromatography atau kromatografi fase normal, bila fase
diamnya bersifat polar dan fase geraknya bersifat non polar. Fase diam
yang dapat digunakan adalah amino (-NH2), Cyano (-CN) dan Diol
(glycidoxy-ethilmethokxysilane)
2. Reverse phase chromatography atau kromatografi fase terbalik, bila fase
diamnya bersifat non polar dan fase geraknya bersifat polar. Fase diam
yang dapat digunakan adalah RP-2 ( Si-CH2-CH3 ), RP-8 (Si-(CH2)7-
CH3), RP-18 (Si-(CH2)17-CH3.

Ion Exchange Chromatography atau Kromatografi Penukar Ion

Fase diam yang digunakan adalah molekul yang memiliki muatan ionik di
permukaannya dan muatannya berlawanan dengan muatan ionik solut. Kadang
molekul fase diam ini diikatkan pada bahan penyangga. Kromatografi tipe ini
cocok digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa ionik.
Pada gambar di atas fase diam mempunyai muatan positif. Bila ada solut
yang bermuatan positif lebih kuat maka dapat mendesak dan menggantikan
muatan positif fase diam dan terjadilah proses retensi solut dalam fase diam.
Adanya perbedaan kekuatan interaksi antara solut dan fase diam menyebabkan
terjadinya pemisahan. Ada dua macam kromatografi penukar ion yaitu :
1. Penukar kation (cationic exchange}, bila muatan yang dipertukarkan
adalah positif
X+ + R-K+ X+R- + K+
Penukar kation kuat dapat menggunakan golongan asam sulfonat,
sedangkan penukar kation lemah dapat menggunakan golongan
karboksilat (-COOH)
2. Penukar anion (anionic exchange), bila muatan yang dipertukarkan
adalah negatif
x- + R+Cl- X-R+ + Cl-
Penukar anion kuat dapat menggunakan golongan amino quarterner,
sedangkan penukar anion lemah dapat menggunakan golongan amin
primer.
 Di samping pemilihan fase diam, perlu mendapat perhatian adalah
pemilihan buffer. Derajat keasaman (pH) buffer harus dipilih pada pH di mana
komponen sampel yang akan dianalisis berada dalam bentuk ion. Untuk
pemisahan anion disarankan pH>6 atau pH>pKa, sedangkan untuk pemisahan
kation disarankan pH<6 atau pH<pKa. Konsentrasi buffer juga harus seminimal
mungkin untuk menghindari terjadinya kompetisi dengan solut.

Size Exclusion Chromatographyatoau Kromatografi Eksklusi

Kromatografi eksklusi juga disebut kromatogarfi permeasi gel. Proses
pemisahan didasarkan pada ukuran partikel solut. Sebagai fase diam adalah
material yang terkontrol ukuran partikelnya, bisa silika atau gelas yang ukuran
partikelnya terkontrol atau gel organik seperti agarosa dan poliakrilamid. Sistem
kromatografi ini biasa dipakai untuk menentukan ukuran partikel dari senyawa
polimer seperti protein. Partikel solut denan ukuran partikel besar akan terelusi
lebih cepat karena mereka melewati ruang antar partikel fase diam. Sebaliknya,
partikel solut dengan ukuran partikel kecil akan terelusi lebih lama karena
mereka harus melewati pori-pori fase diam.

Ion Pair Chromatography atau Kromatografi Pasangan Ion

Prinsip pemisahan tidak berbeda jauh dengan kromatografi penukar ion
yaitu adanya pergantian ion solut dengan ion fase diam seperti pada gambar
III.6. Hanya saja fase diam yang dipakai adalah fase diam reverse phase Q atau
C18. Lapisan muatan fase diam dibuat dengan jalan melewatkan fase gerak yang
berisi pasangan ion. Pasangan ion selanjutnya akan mengimpregnasi C8 atau
C18 sehingga fase diam menjadi bermuatan. Pasangan ion fase gerak tertata
melapisi C8 atau C18 dengan muatan positif berada bebas dan muatan negatif
terikat pada C8 atau Q8. Bila terdapat ion positif lebih kuat daripada muatan
positif fase gerak, maka ion solut ini akan mengganti kedudukannya dan menjadi
tertahan dalam kolom. Untuk mengeluarkan solut maka dilakukan pendesakan
dengan fase gerak yang memiliki kekuatan muatan positif jauh lebih kuat
daripada muatan ion positif ion solut.
B. Pemilihan Fase Gerak
Untuk menentukan jenis fase gerak maka perlu mengetahui terlebih
dahulu sistem kromatografi apa yang akan dikerjakan. Pemilihan sistem
kromatografi didasarkan pada jenis dan sifat dari solut yang akan dianalisis.
Berikut ini garis besar menentukan sistem kromatografi yang sesuai.
Dalam memilih fase gerak, perlu memperhatikan dua hal penting yaitu :
1. Solvent strength, yaitu kemampuan membawa solut melintasi fase diam.
Sebagai fase diam acuan adalah silika atau alumina.
2. Polarity index, yaitu kepolaran dari fase gerak, terutama dalam kromatografi
fase terbalik.
Harga solvent strength dan plarity yang optimum dapat dicari dengan
mencampur lebih dari satu macam pelarut.
Pemilihan fase gerak untuk kromatografi fase terbalik didasarkan pada
hukum Snyder. Menurut Snyder solven atau pelarut dapat diklasifikasikan
menjadi tujuh golongan berdasarkan keasaman, kebasaan, momen dipol dan
sifat kimianya, seperti gambar IV. 1 dan tabel IV. 1 berikut ini.

Gambar IV. 1. Skema pemilihan sistem kromatografi

Tabel IV. 1. Klasifikasi solven menurut Snyder
GOLONGAN CONTOH SOLVEN
I ETER ALIFATIK, ALKIL AMINA
II ALKOHOL ALIFATIK
III TETRA HIDRO FURAN, PIRIDIN, DIMETIL SULFOKSIDA,
AMIDA
IV FORNAMIDA, ASAM ASETAT, GLIKOL
V DIKLORMETAN, 1,2-DIKLOROETIL
1,2
VI ALKIL HALIDA, ESTER, KETON, NITRIL
VII BENZENA DAN DERIVATNYA
VIII KLOROFORM, M-KRESOL,
M AIR

Gambar IV.2. Pembagian solven berdasarkan Snyder

Dalam praktek tidak semua solven tersebut dapat dipakai karena
beberapa alasan, antara lain :

Tidak semua dapat dicampur pada berbagai perbandingan

Menimbulkan interaksi kimia

Mengganggu sinyal detektor,
detektor, seperti dapat menyerap sinar ultra violet

Viskositas sangat tinggi

Toksik dan mudah terbakar

Tekanan uapnya terlalu tinggi

Terlalu mahal
Dari sekian jenis solven yang paling sering digunakan adalah :

Metanol, mewakili golongan asam

Asetonitril, mewakili golongan basa

Terra hidro furan, mewakili golongan yang mempunyai momen dipol
besar

Air, untuk mengatur polaritas
Syarat fase gerak yang baik untuk kromatografi cair adalah :

Viskositas rendah

Tersedia dalam kemurnian yang tinggi

Tidak menginterferensi sinyal detektor

Dapat bercampur dengan fase gerak yang lain

Untuk meningkatkan resolusi pemisahan dan efektifitas elusi, maka teknik

elusi dapat dikembangkan, yaitu dengan teknik elusi gradien. Elusi gradien
adalah elusi menggunakan komposisi fase gerak yang diubah-ubah secara
terprogram, sedangkan bila elusi dikerjakan dengan satu macam komposisi fase
gerak mulai dari start hingga finish disebut elusi isokratik. Perubahan komposisi
fase gerak dapat dikerjakan secara linear atau non linear (curved program).
Dengan teknik elusi gradien maka resolusi dapat diatur sedemikian rupa
sehingga waktu analisis dapat dipersingkat. Teknik elusi gradien ini terutama
ditujukan untuk :

Sampel yang terdiri dari campuran senyawa yang meiliki kisaran harga
factor kapasitas 0.5<k'<20

Sampel yang terdiri dari molekul-molekul dengan berat molekul cukup
besar (BM>1000)

Sampel yang mengandung senyawa pengganggu dengan waktu retensi
sangat besar

Sampel dengan konsentrasi sangat encer sehingga volume yang
dianalisis sangat banyak. Dengan teknik ini diharapkan dapat
meminimalkan pelebaran pita kromatogram karena overload volume.
C. Instrumentasi Kromatografi Kolom Terbuka
Instrumentasi dalam kromatografi cair kolom terbuka hanya terdiri dari
kolom tempat fase diam yang terbuat dari kaca, tempat fase gerak dan
tampungan hasil elusi yang dapat menggunakan erlenmeyer atau beker glass.
Hasil elusi selanjutnya dapat dianalisis menggunakan detektor yang sesuai.

Gambar IV.3. Instrumentasi kromatografi kolom

Kromatografi kolom terbuka biasanya dimanfaatkan untuk clean up atau
pembersihan suatu larutan atau ekstrak sampel sebelum akhirnya dianalisis
secara instrumentasi. Seperti misalnya pada penghilangan klorofil dari ekstrak
tanaman menggunakan kolom berisi fase diam florisil atau penghilangan lemak
dari ekstrak makanan dengan menggunakan kolom berisi fase diam alumina.

D. Solid Phase Extraction SPE (Ekstraksi Padat Cair)

Bila dibandingkan dengan ekstraksi cair-cair seperti yang umum dipakai,
SPE memiliki banyak keuntungan, yaitu :

Ekstraksi analit lebih komplit atau sempurna

Pemisahan bahan pengganggu dari analit lebih efisien

Mengurangi kebutuhan pelarut

Fraksinasi terhadap larutan sampel lebih mudah dikerjakan

Dapat menghilangkan partikulat

Mudah dilakukan otomatisasi
Namun demikian teknik SPE memiliki kekurangan yaitu variabilita isi dari tiap
cartridge cukup besar dan sering terjadi adsorbs! irreversibel beberapa
komponen dalam cartridge.
Teknik SPE ini dapat diaplikasikan untuk keperluan antara lain :

Menghilangkan material pengganngu dan perusak kolom HPLC

Pemekatan sampel

Desalting atau menghilangkan garam-garam
garam

Penggantian pelarut

Derivatisasi in situ

Penyimpanan sampel terutama dalam masa transportasi sampel

E. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi
HPLC merupakan pengembangan dari kromatografi kolom terbuka. HPLC
digunakan untuk analisis senyawa yang non volatil
volatil dan termolabil. Fase diam
dalam HPLC merupakan material yang dipacking dalam kolom dan memiliki
ukuran partikel berdiameter 3-10m.
3 m. Oleh karena itu fase gerak tidak dapat
melewati fase diam hanya dengan mengandalkan gaya gravitasi seperti pada
kromatografi
grafi kolom terbuka. Diperlukan suatu pompa yang mendorong fase
gerak agar dapat melewati fase diam dengan kecepatan tertentu yang dapat
memberikan jumlah lempeng teoritik maksimum, sehingga mendapatkan
pemisahan yang maksimal.
Pilihan detektor untuk HPLC lebih terbatas bila dibandingkan dengan
kromatografi gas. Detektor yang paling banyak dipergunakan adalah
spektrofotometer dengan keterbatasan hanya molekul yang dapat mengabsorpsi
sinar saj'a yang dapat dianalisis.

Gambar IV.4. Bagan alat HPLC

Solven atau fase gerak untuk HPLC hendaknya memenuhi kriteria :

Mempunyai kemurnian tinggi

Sebelum digunakan disaring terlebih dahulu dengan kertas saring dengan
ukuran pori 0.2 m

Bebas dari gas yang dapat mengganggu detektor atau menyumbat
kolom.Dapat dilakukan dengan memanaskan solven sebelum digunakan
atau mengaplikasikan motor vaccum.

Keterangan Bagan Alat HPLC

Gradient controller atau pengatur gradien, adalah alat untuk mengatur komposisi
fase gerak apabila elusi dikerjakan secara gradien
Pump/dampning system, adalah pompa yuntuk menyedot fase gerak yang
dilengkapi dengan peredam getaran, sehingga aliran fase gerak stabil tidak
dipengaruhi oleh getaran pompa selama bekerja.
Sample introduction, adalah alat untuk memasukkan sampel biasanya berupa
rotary loop. Ketika injektor berada dalam posisi load sampel dimasukkan dengan
bantuan syringe, sehingga sampel akan memenuhi tempat penampungan
sampel. Bila volume sampel terlalu besar, maka kelebihan sampel akan terbuang
secara otomatis ke saluran pembuangan (vent). Ketika injektor ini diposisikan
inject, maka aliran fase gerak akan berubah, fase gerak akan mengalir dengan
membawa sampel ke arah kolom.
Column/Pre column, adalah bagian jantung pemisahan dalam HPLC. Kolom
biasanya terbuat dari bahan stainless steel dan ukuran diameter dalam terukur
dengan presisi tinggi. Guard column adalah kolom berukuran kecil yang
diletakkan di antara injektor dan kolom analitik. Fungsinya adalah untuk
menahan senyawa yang kemungkinan dapat menyumbat kolom analitik. Fase
diam dibuat dari jenis bahan yang sesuai dengan fase diam pada kolom analitik.
Kolom analitik biasanya berukuran panjang 15 cm, diameter dalam 4.6 mm
dengan ukuran partikel fase diam 10 m (memiliki jumlah lempeng teoritik sekitar
5000), 5 m (memiliki jumlah lempeng teoritik sekitar 9000), 3 m (memiliki
jumlah lempeng teoritik sekitar 15000). Agar diperoleh hasil pemisahan yang
baik, maka perlu dilakukan evaluasi kolom secara berkala. Evaluasi terhadap
kelayakan kolom dapat dipantau dengan mengevaluasi harga beberapa
parameter di bawah ini secara berkala :

Faktor kapasitas berkisar 2-10

Jumlah lempeng teoritik tidak mengalami perubahan yang signifikan

Faktor resolusi (Rs) harus > 1.5

Peak asimetri < 1.2

Tekanan kolom dalam kisaran normal (dapat dikerjakan oleh pompa
dengan ringan)
Ada banyak faktor yang mempengaruhi efisiensi kolom sehingga harus
dioptimasi agar diperoleh pemisahan yang baik, yaitu :

Kecepatan alir fase gerak, kecepatan alir yang sangat lambat akan
menyebabkan terjadinya difusi longitudinal, sedangkan bila terlalu cepat
akan menyebabkan terjadinya transfer masa non ekuilibrium, sehingga
terjadi pelebaran pita kromatogram

Ukuran partikel fase diam, semakin kecil ukuran partikel maka efisiensi
semakin baik Tetapi menyebabkan tekanan dalam kolom semakin besar
sehingga dibutuhkan kekuatan pompa yang semakin besar.

Panjang kolom, semakin panjang akan semakin besar harga efisiensi
kolom, tetapi dapat menyebabkan terjadinya pelebaran pita.

Viskositas fase gerak, semakin kecil harga viskositas fase gerak maka
efisiensi kolom semakin besar.

Temperatur, semakin tinggi temperatur maka viskositas semakin rendah
dan efisiensi kolom menjadi lebih besar.

Volume ekstra kolom, semakin besar volume ekstra kolom
maka kemungkinan terjadinya pelebaran pita semakin besar, sehingga
efisiensi semakin berkurang.

Jumlah sampel dan volume sampel, bila jumlah maupun volume sampel
sangat besar (overload) maka kemungkinan terjadinya pelebaran pita
semakin besar, sehingga efisiensi semakin berkurang.

Detector, merupakan alat untuk melihat adanya sinyal dari analit atau solut yang
sedang dianalisis. Hendaknya memiliki kriteria : sensitivitasnya tinggi, batas
deteksi rendah, linearitas respon tinggi dan reprodusibilitasnya tinggi. Ada
banyak detektor yang dapat diaplikasikan, yaitu :

Detektor spektrofotometer UV/Vis, merupakan detektor universal dan
dapat diaplikasikan pada semua analit yang dapat menyerap sinar uv/vis.
 Fase gerak yang dipakai tidak boleh menyerap sinar uv/vis pada panjang
gelombang yang dipilih.

Detektor spektrofluorometer, merupakan detektor yang lebih selektif dan
lebih sensitif daripada detektor spektrofotometer. Tidak semua senyawa
bersifat fluoresens dan tidak semua senyawa yang berfluorsens memiliki
panjang gelombang eksitasi dan emisi yang sama dengan senyawa lain.

Detektor indeks bias, merupakan detektor yang sinyalnya tergantung
pada perubahan harga indeks bias fase gerak oleh karena adanya analit
atau solut.

Detektor elektrokimia, ada banyak jenisnya antara lain : detektor
konstanta dielektrika (didasarkan pada perubahan polaritas fase gerak
oleh karena adanya solut), detektor konduktometer (didasarkan pada
perubahan sifat penghantaran listrik dari fase gerak oleh karena adanya
solut), detector amperometer (didasarkan adanya perubahan kekuatan
medan listrik dari fase gerak karena adanya solut).

Contoh Aplikasi Pemisahan Peptida Dan Protein Dengan Rp-HPLC

Kondisi Awal Yang Bisa Dipakai:

VARIABEL PEPTIDA PROTEIN
Kolom Bonded phase C18 atau C8 C4, C3, CN
Dimensi Partikel 0.46 X 15 atau 25 cm 0.46 x 5-15 cm
3.5-10 m (diameter) 3.5-10 m (diameter)
80-300 A (pori) 300 A (pori)
Fase gerak Solven A 0.12% TFA/air 0.12% TFA/air
Solven B Gradien 0.10%TFA/air 0.10%TFA/air
0-60% B/60 menit 0-60% B/60 menit

Temperatur 40 - 80 C 40 - 80 C
Kecepatan alir 0.5 - 2 ml/menit 0.5 - 2 ml/menit
Ukuran sampel Volume 10-50 L 10-50 L
Berat 1-100 g 1-100 g
Problem yang mungkin muncul:

Bentuk pita yang jelek : melebar, tailing

Recovery rendah

Timbul pita yang misterius

Pita ganda untuk satu jenis analit

Performance kolom berubah, tr tidak reprodusibel
Faktor penyebab :

Kolom rusak, terlalu asam, terlalu hidrofob, terlalu kecil ukuran pori-
porinya

Denaturesi sampel

Isomerisasi (cis ke trans)
Pengatasannya :

Pemisahan pada ph rendah (fase gerak 0.1 % Tetra fluoro Acid)

Gunakan asetonitril sebagai solven organik. Untuk sampel yang hidrofob
gunakan propanol

Analisis dikerjakan pada temperatur kolom 50 - 80c

Gunakan zwitterionic detergent

Contoh aplikasi pemisahan peptida dan protein dengan ion exchange HPLC
Kondisi yang bisa dipakai :
VARIABEL PROTEIN ASAM PROTEIN BASA
(ANION EXCHANGE) (KATION EXCHANGE)

Kolom
Bonded phase DEAE, SAX, PEI CM, SP
Ukuran 5-25 x 0.46cm 5-25 x 0.46 cm
Fase gerak
Solven A 10mm tris atau phosphat (pH 8) 10mm bis-tris atau phosphat (pH
Solvent A + 0.5m NaCI atau Na- 6) Solvent A + 0.5m NaCI atau
asetat Na-asetat
Solven B 0-100% B dalam 30 menit 0-100% B dalam 30 menit
Gradien

Temperatur 35 c 35 c
Kecepatan alir 1.0ml/ menit l.0ml/menit
Ukuran sampel 10-50 l 10-50 l
Volume Berat 1-100 g 1-100 g

Keuntungan :

Konformasi protein tetap terjaga,

Kemungkinan denaturasi kecil,

Dapat digunakan untuk isolasi dan purifikasi protein dengan tetap
berbentuk bioaktif

Protein basa biasa memakai kation exchange, dengan ph 3
Problem yang sering muncul:

Recovery rendah dan dapat diatasi dengan menggunakan gradien elusi
dengan fase gerak mengandung garam.

Contoh analisis campuran aspartam, benzoat dan kafein dengan RP-HPLC

Variabel Kondisi
Fase diam C18, panjang 15 cm
Fase gerak A : asam asetat 0.02 M dalam air pH 4.0; B :
asetonitril
Elusi 85 % A dan 15 % B, kecepatan alir 1 ml/menit
Temperatur Temperatur kamar
Detektor Spektrofotometer UV 254 nm
Volume injeksi 20 l
Perhitungan Standard eksternal

Contoh analisis campuran asam salisilat, kafein dan parasetamol dengan

RP-HPLC

Variabel Kondisi
Fase diam C18, panjang 15 cm
Fase gerak A : buffer TBA, dibuat dengan melarutkan 4.0
gram KH2P04 dan 1.5 gram Tetra butilamonium
bromida dalam 350 ml aquadest (larutan 1).
 Melarutkan NaaHP04 dalam aquadest hingga
diperoleh konsentrasi lg/100 ml (larutan 2).
Campur larutan 1 dan 2 hingga diperoleh pH 6.
Encerkan dengan aquadest hingga 1 L.
B : Asetonitril
Elusi 85 % A dan 15 % B, kecepatan alir l ml/menit
Temperatur Temperatur kamar
Detektor Spektrofotometer UV 254 nm atau ,
maksimumnya
Volume injeksi 20 l
Perhitungan Standard eksternal