Kromatografi Cair PDF
Kromatografi Cair PDF
KROMATOGRAFI CAIR
Kromatografi adsorpsi
Dalam kromatografi adsorpsi fase diam yang digunakan merupakan
padatan biasanya silika dan alumina. Solut dan fase gerak dapat berinteraksi
dengan sisi polar dari fase diam. Pemisahan terjadi oleh karena perbedaan
kekuatan adsorpsi solut terhadap fase diam.
Fase diam alumina dapat digunakan untuk analisis amina dan derivatnya.
Fase gerak yang dapat dipakai adalah heksana, kloroform atau 2-propanol.
Sedangkan fase diam silika dapat digunakan untuk analisis eter, ester, porphirin
dan vitamin larut lemak. Fase gerak yang dapat dipakai adalah heksana,
kloroform dan 2-propanol.
Kromatografi Partisi
Pemisahan dalm kromatografi partisi terjadi oleh karena adanya partisis
solut dalam dua fase cair yang berbeda. Perjalanan solut dalam kolom hampir
sama dengan perjalanan solut dalam ekstraksi berkelanjutan. Solut yang lebih
larut dalam fase diam akan tertahan lebih lama dalam kolom daripada solut yang
kelarutannya dalam fase diam kecil. Ada dua tipe dalam kromatografi partisi yaitu
:
1. Normal phase chromatography atau kromatografi fase normal, bila fase
diamnya bersifat polar dan fase geraknya bersifat non polar. Fase diam
yang dapat digunakan adalah amino (-NH2), Cyano (-CN) dan Diol
(glycidoxy-ethilmethokxysilane)
2. Reverse phase chromatography atau kromatografi fase terbalik, bila fase
diamnya bersifat non polar dan fase geraknya bersifat polar. Fase diam
yang dapat digunakan adalah RP-2 ( Si-CH2-CH3 ), RP-8 (Si-(CH2)7-
CH3), RP-18 (Si-(CH2)17-CH3.
Detector, merupakan alat untuk melihat adanya sinyal dari analit atau solut yang
sedang dianalisis. Hendaknya memiliki kriteria : sensitivitasnya tinggi, batas
deteksi rendah, linearitas respon tinggi dan reprodusibilitasnya tinggi. Ada
banyak detektor yang dapat diaplikasikan, yaitu :
Detektor spektrofotometer UV/Vis, merupakan detektor universal dan
dapat diaplikasikan pada semua analit yang dapat menyerap sinar uv/vis.
Fase gerak yang dipakai tidak boleh menyerap sinar uv/vis pada panjang
gelombang yang dipilih.
Detektor spektrofluorometer, merupakan detektor yang lebih selektif dan
lebih sensitif daripada detektor spektrofotometer. Tidak semua senyawa
bersifat fluoresens dan tidak semua senyawa yang berfluorsens memiliki
panjang gelombang eksitasi dan emisi yang sama dengan senyawa lain.
Detektor indeks bias, merupakan detektor yang sinyalnya tergantung
pada perubahan harga indeks bias fase gerak oleh karena adanya analit
atau solut.
Detektor elektrokimia, ada banyak jenisnya antara lain : detektor
konstanta dielektrika (didasarkan pada perubahan polaritas fase gerak
oleh karena adanya solut), detektor konduktometer (didasarkan pada
perubahan sifat penghantaran listrik dari fase gerak oleh karena adanya
solut), detector amperometer (didasarkan adanya perubahan kekuatan
medan listrik dari fase gerak karena adanya solut).
Temperatur 40 - 80 C 40 - 80 C
Kecepatan alir 0.5 - 2 ml/menit 0.5 - 2 ml/menit
Ukuran sampel Volume 10-50 L 10-50 L
Berat 1-100 g 1-100 g
Problem yang mungkin muncul:
Bentuk pita yang jelek : melebar, tailing
Recovery rendah
Timbul pita yang misterius
Pita ganda untuk satu jenis analit
Performance kolom berubah, tr tidak reprodusibel
Faktor penyebab :
Kolom rusak, terlalu asam, terlalu hidrofob, terlalu kecil ukuran pori-
porinya
Denaturesi sampel
Isomerisasi (cis ke trans)
Pengatasannya :
Pemisahan pada ph rendah (fase gerak 0.1 % Tetra fluoro Acid)
Gunakan asetonitril sebagai solven organik. Untuk sampel yang hidrofob
gunakan propanol
Analisis dikerjakan pada temperatur kolom 50 - 80c
Gunakan zwitterionic detergent
Contoh aplikasi pemisahan peptida dan protein dengan ion exchange HPLC
Kondisi yang bisa dipakai :
VARIABEL PROTEIN ASAM PROTEIN BASA
(ANION EXCHANGE) (KATION EXCHANGE)
Kolom
Bonded phase DEAE, SAX, PEI CM, SP
Ukuran 5-25 x 0.46cm 5-25 x 0.46 cm
Fase gerak
Solven A 10mm tris atau phosphat (pH 8) 10mm bis-tris atau phosphat (pH
Solvent A + 0.5m NaCI atau Na- 6) Solvent A + 0.5m NaCI atau
asetat Na-asetat
Solven B 0-100% B dalam 30 menit 0-100% B dalam 30 menit
Gradien
Temperatur 35 c 35 c
Kecepatan alir 1.0ml/ menit l.0ml/menit
Ukuran sampel 10-50 l 10-50 l
Volume Berat 1-100 g 1-100 g
Keuntungan :
Konformasi protein tetap terjaga,
Kemungkinan denaturasi kecil,
Dapat digunakan untuk isolasi dan purifikasi protein dengan tetap
berbentuk bioaktif
Protein basa biasa memakai kation exchange, dengan ph 3
Problem yang sering muncul:
Recovery rendah dan dapat diatasi dengan menggunakan gradien elusi
dengan fase gerak mengandung garam.
Variabel Kondisi
Fase diam C18, panjang 15 cm
Fase gerak A : asam asetat 0.02 M dalam air pH 4.0; B :
asetonitril
Elusi 85 % A dan 15 % B, kecepatan alir 1 ml/menit
Temperatur Temperatur kamar
Detektor Spektrofotometer UV 254 nm
Volume injeksi 20 l
Perhitungan Standard eksternal
Variabel Kondisi
Fase diam C18, panjang 15 cm
Fase gerak A : buffer TBA, dibuat dengan melarutkan 4.0
gram KH2P04 dan 1.5 gram Tetra butilamonium
bromida dalam 350 ml aquadest (larutan 1).
Melarutkan NaaHP04 dalam aquadest hingga
diperoleh konsentrasi lg/100 ml (larutan 2).
Campur larutan 1 dan 2 hingga diperoleh pH 6.
Encerkan dengan aquadest hingga 1 L.
B : Asetonitril
Elusi 85 % A dan 15 % B, kecepatan alir l ml/menit
Temperatur Temperatur kamar
Detektor Spektrofotometer UV 254 nm atau ,
maksimumnya
Volume injeksi 20 l
Perhitungan Standard eksternal