PETUNJUK PRAKTIKUM

METABOLISME
BIOMOLEKUL

OLEH :
Irma Ratna Kartika, M.Sc.Tech

LABORATORIUM KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA
Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

TATA TERTIB PRAKTIKUM

LABORATORIUM KIMIA
FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA

A. Bila hendak praktikum, praktikkan diwajibkan :

1. Datang tepat waktu. Keterlambatan 15 menit tanpa alasan yang
sah dianggap tidak hadir dan tidak diizinkan mengikuti praktikum.
2. Menyiapkan laporan awal, bagan prosedur percobaan dan laporan
praktikum.
3. Menyimpan tas pada tempat yang telah disediakan (dibawah meja
kerja).
4. Mengisi form kehadiran tiap kali mengikuti praktikum.
5. Membawa alat-alat yang diperlukan selama praktikum berlangsung
(handuk kecil, untuk lap, gunting, lem, korek api, sabun cuci
tangan).
6. Meminjam dan memeriksa ulang alat kaca yang diperlukan selama
praktikum kepada laboran, jika terdapat ketidaklengkapan dan
kerusakan, maka praktikan diberikan waktu minimal satu jam untuk
menukarnya.

B. Selama praktikum berlangsung, praktikan diwajibkan :

1. Berpakaian sopan dan memakai jas laboratorium.
2. Tidak makan, minum, dan merokok di dalam laboratorium.
3. Tidak bercanda dan bertindak yang dapat menimbulkan kecelakaan
terhadap orang lain.
4. Tidak mereaksikan sembarang bahan kimia tanpa ada petunjuk
praktikum yang jelas dan tanpa seizing dosen dan asisten dosen.
5. Tidak membuang sampah atau bahan sisa percobaan kedalam
i
wastafel.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

6. Menjaga kebersihan, ketertiban, dan keamanan laboratorium

secara bersama.

C. Setelah praktikum selesai, praktikan diwajibkan :

1. Mencuci dan membersihkan semua alat kaca yang digunakan
selama praktikum dengan sabun cair/tepol yang telah disediakan.
2. Memeriksa kembali kelengkapan dan keutuhan alat yang dipinjam
kemudian mengembalikannya kepada laboran.
3. Memberihkan meja praktikum masing-masing tanpa mengandalkan
mahasiswa yang piket.
4. Lapor diri apabila selama praktikum memecahkan alat kaca.
5. Menyerahkan data/laporan sementara kepada asisten dosen untuk
di paraf oleh dosen pembimbing.
6. Meninggalkan laboratorium dengan seizin dosen pembimbing atau
asisten dosen.

Jakarta, Agustus 2014

Kepala Laboratorium Kimia

Drs. Zulhipri, M.Si.

NIP. 19580703 198903 1 001

ii

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

DAFTAR ISI

TATA TERTIB PRAKTIKUM i

DAFTAR ISI iii
I. UJI KUANTITATIF KARBOHIDRAT 1
A. Penentuan Gula Pereduksi dengan Metode Somogyi-Nelson 2

B. Penentuan Karbohidrat dengan Metode Anthrone 2

II. UJI KUANTITATIF PROTEIN 4

A. Penentuan Protein dengan Metode Lowry 5
B. Penentuan Protein dengan Metode Biuret 5

III. UJI KUANTITATIF LIPID 7

A. Penentuan Angka Asam 7
B. Penentuan Angka Iodium 8
C. Penentuan Angka Peroksida 9

D. Penentuan bilangan TBA (Asam Tiobarbiturat) 9

IV. DARAH 11
A. Penentuan Kolesterol dalam Darah 11
B. Penentuan Glukosa dalam Darah 12

V. URINE 14
A. Penentuan Sifat Fisik dari Urine 14
B. Penentuan Beberapa Komponen yang Terdapat dalam Urine 15
C. Penentuan Beberapa Senyawa pada Urine tidak Normal 16

VI. ELEKTROFORESIS GEL POLIAKRILAMID-SDS 19

iii

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

UJI KUANTITATIF KARBOHIDRAT

I. TUJUAN
1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi karbohidrat.
2. Mahasiswa dapat membandingkan metode Somogyi-Nelson dan
metode Anthrone.

II. TEORI SINGKAT

Pada percobaan ini digunakan metode penentuan gula pereduksi
dengan metode Somogyi-Nelson, dimana gula pereduksi bila dipanaskan
dengan larutan tembaga tartrat yang bersifat basa akan menghasilkan
tembaga oksida (Cu2O). Tembaga oksida ini akan bereaksi dengan
larutan arsenomolibdat menghasilkan warna biru molibdenum dan
intensitas warnanya diukur dengan spektrofotometer. Pada penentuan ini
perlu ditambahkan natrium sulfat ke dalam larutan yang berwarna biru
untuk mencegah oksigen dari udara yang dapat mengoksidasi kembali
Cu2O. Penentuan ini tidak dapat digunakan untuk campuran gula-gula
pereduksi. Selain itu protein perlu dipisahkan terlebih dahulu dengan
menambahkan Zn(OH)2 sebagai pengendap protein.
Reaksi anthrone merupakan metode yang baik dan cepat untuk
menentukan heksosa, aldopentosa, dan asam heksuronat, juga untuk
mengetahui adanya polisakarida. Larutan yang berwarna kehijauan ini
memiliki absorpsi maksimum 620nm, namun beberapa karbohidrat dapat
memberikan warna lain. Reaksi tidak sesuai jika terdapat protein yang
mengandung banyak gugus triptofan, karena akan memberikan warna
merah.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

III. PROSEDUR KERJA

A. Penentuan Gula Pereduksi dengan Metode Somogyi-Nelson
1. Pipet 0,1 mL larutan standar gula pereduksi yang mengandung 50 -
250 µg/mL, masukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1,5 mL air
kemudian aduk sampai homogen.
2. Pindahkan campuran ke dalam tabung reaksi yang berisi 1 mL
pereaksi Ba(OH)2 0,3 M dan 0,2 mL larutan ZnSO4. Kemudian kocok
dan sentrifugasi selama beberapa menit.
3. Pindahkan 1 mL supernatan ke dalam tabung reaksi lain selanjutnya
tambahkan 1 mL pereaksi Somogyi-Nelson (tembaga – alkali).
4. Pasang penutup pada tabung, kemudian panaskan tabung di dalam
penangas air selama 15 menit.
5. Dinginkan tabung dan tambahkan 1 mL pereaksi arsenomolibdat.
Biarkan larutan beberapa saat sampai tidak timbul gelembung-
gelembung udara.
6. Encerkan larutan yang berwarna biru hingga volume 10 mL dan ukur
absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm.
7. Sampel dan blanko diperlakukan sama dengan larutan standar
(prosedur dimulai dari nomor 1 – 6).
8. Hitung kadar gula pereduksi yang didapat dari kurva absorbansi vs
konsentrasi standar.

B. Penentuan Karbohidrat dengan Metode Anthrone

1. Tambahkan 4 ml reagen anthrone (0,2 % anthrone dalam H2SO4
pekat) kedalam 1 ml larutan karbohidrat (yang tidak mengandung
protein) kocok dengan cepat (awas asam kuat).
2. Letakkan tabung-tabung tersebut diatas penangas air yang sedang
mendidih tutup mulut tabung dengan kelereng untuk mengurangi
penguapan larutan tersebut. 2

3. Dinginkan dan setelah 20 menit, ukur absorbansinya pada panjang

gelombang 620 nm.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

4. Larutan standar dan blanko diperlakukan sama dengan sampel

(prosedur dimulai dari nomor 1 – 3).
5. Hitung kadar karbohidrat yang didapat dari kurva absorbansi vs
konsentrasi standar.
6. Konsentrasi karbohidrat standar yang dibuat adalah 5, 10, 15, 20 dan
25 mg/100mL.

IV. PUSTAKA
Harrow, B., et al. 1960. Laboratory Manual of Biochemistry, 5th ed., W. B.
Sanders Comp., New York, 1-4.

Frais, F. 1971. Practical Biochemistry in Introductory Course, 1st ed.,

Butterworth & Co., Ltd., London, 23-25.

Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

UJI KUANTITATIF PROTEIN

I. TUJUAN
1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi protein.
2. Mahasiswa dapat membandingkan metode Lowry dan metode
Biuret.

II. TEORI SINGKAT

Penentuan konsentrasi protein merupakan proses yang rutin
digunakan dalam kerja Biokimia. Ada beberapa metode yang biasa
digunakan dalam rangka penentuan konsentrasi protein, yaitu metode
Biuret, Lowry, dan Bradford. Masing-masing metode mempunyai
kekurangan dan kelebihan. Pemilihan metode yang terbaik untuk suatu
pengukuran bergantung pada beberapa faktor misalnya; banyaknya
material atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan
pengukuran, alat spektrofotometri yang tersedia (VIS atau UV) dan lain
sebagainya.
Prinsip metode Lowry adalah mempertajam warna yang dihasilkan
pada metode Biuret. Pada metode ini, setelah protein direaksikan dengan
pereaksi Biuret, ditambahkan pereaksi fosfomolibdat-fosfotungstat. Pada
reaksi lanjutan ini akan terjadi reaksi oksidasi-reduksi dengan gugus
tirosin dan triptofan yang ada pada protein. Batas deteksi untuk metoda ini
adalah 20-200 µg protein.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

II. PROSEDUR KERJA

A. Penentuan Protein dengan Metode Lowry
1. Sediakan alat-alat gelas dan ikuti prosedur seperti tabel dibawah ini.
Blanko Standar Sampel
Zat
1 2 3 4 5 6 7 8
BSA 400 ppm (mL) – 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 – –
Sampel (mL) – – – – – – 0,2 0,4
H2O (mL) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 – 0,3 0,1
Pereaksi Lowry (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Kocok, diamkan 10 menit dan langsung ditambahkan
Folin-Ciocalteu 1 N (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

2. Inkubasi semua larutan pada suhu kamar selama 30 menit, baca

absorbansinya pada λ = 700 nm. Waktu inkubasi ini dapat dimulai
(start) setelah penambahan/pencampuran reagen Folin-Ciocalteu ke
dalam tabung terakhir.
3. Konsentrasi sampel dihitung dari kurva absorbansi vs. konsentrasi
standar.

B. Penentuan Protein dengan Metode Biuret

1. Sediakan alat-alat gelas dan ikuti prosedur seperti tabel dibawah ini.
Blanko Standar Sampel
Zat
1 2 3 4 5 6 7 8
BSA 10 mg/mL (mL) – 0,2 0,6 1 1,4 1,8 – –
Sampel (mL) – – – – – – ? ?
H2O (mL) 2 1,8 1,4 1 0,6 0,2 ? ?
Pereaksi Biuret (mL) 8 8 8 8 8 8 8 8

2. Kocok semua larutan, diamkan pada suhu kamar selama 30 menit dan
baca absorbansinya pada λ = 550 nm.
3. Konsentrasi protein dalam sampel dihitung dari kurva absorbansi vs.
konsentrasi standar.
5

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

Pertanyaan:
1. Apakah kelebihan dan kelemahan kedua metode tersebut diatas?
2. Jelaskan sedikitnya dua metode lain (secara spektrofotometri) dalam
menentukan konsentrasi protein berikut kelebihan dan kekurangannya
dibandingkan dengan kedua metode diatas.

IV. TUGAS PENDAHULUAN

1. Mengapa metode Lowry lebih peka dibandingkan Biuret dalam
menganalisa protein?
2. Beri penjelasan mengenai metode lain untuk menentukan konsentrasi
protein berikut kelebihan dan kekurangannya

IV. PUSTAKA
Colowick, S. P. dan Kaplan, N. O. 1957. Methods in Enzymology, Vol. V,
Acad. Press Inc., New York, halaman 448-450.

Holme, D. J. dan Peck, H. 1993. Analytical Biochemistry, 2nd ed.,

Longman Scientific and Technical, New York.

Alexander, R. R. dan Griffiths, J. M. 1993. Basic Biochemical Methods, 2nd

ed., A. John Wiley & Sons, Inc., New York.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

UJI KUANTITATIF LIPID

I. TUJUAN
1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi lipid.
2. Mahasiswa dapat membandingkan berbagai metode penentuan
lipid

II. TEORI SINGKAT

Lipid merupakan komponen jaringan yang heterogen dan
penggolongannya didasarkan atas kelarutannya di dalam pelarut-palarut
lemak, seperti eter dan lain-lain. Sedangkan komponen-kompnen
campuran lipid dapat difraksinasi lebih lanjut dengan menggunakan
perbedaan kelarutannya di dalam berbagai pelarut organik. Sebagai
contoh; fosfolipid dapat dipisahkan dari sterol dan lemak netral atas dasar
ketidak larutannya di dalam aseton.

III. PROSEDUR KERJA

A. Penentuan Angka Asam
Selama disimpan, minyak atau lemak dapat menjadi tengik karena
adanya asam lemak bebas dan senyawa aldehid sebagai akibat terjadinya
pemutusan ikatan rangkap melalui pembentukan peroksida oleh oksidasi
udara atau hidrolisis oleh mikroorganisme. Jumlah asam lemak bebas
yang terdapat dalam minyak dapat menunjukkan umur penyimpanan dan
kualitas minyak tersebut.
Angka asam adalah jumlah mg KOH yang dibutuhkan untuk
menetralkan asam lemak bebas yang terdapat dalam 1 g lemak atau
minyak. 7

Prosedur:

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

1. Larutkan 10 g sampel dalam 50 mL alkohol secara kuantitatif,

kemudian tambahkan
indikator phenolphthalein.
2. Titrasi campuran dengan larutan NaOH 0,1 N sampai timbul warna
merah jambu yang tidak hilang selama 30 detik. Lakukan hal yang
sama pada blanko.
3. Hitung angka asarn sampel.

B. Penentuan Angka Iodium

Angka iodium adalah jumlah mg iodium yang diserap oleh 1 g minyak
atau lemak. Angka iodium dapat menunjukkan indikasi seberapa banyak
asam lemak tidak jenuh yang terdapat dalam minyak atau lemak. Asam
lemak tidak jenuh dapat mengalami reaksi adisi dengan halogen pada
ikatan rangkapnya. lodin monoklorida bereaksi dengan ikatan rangkap dan
jumlah iodium yang bereaksi dapat ditentukan dengan cara mentitrasi
iodium yang sisa dengan dengan larutan standar tiosulfat, setelah terlebih
dahulu ditambah KI.

Prosedur:
1. Timbang 0,5 g sampel dalam erlenmeyer tertutup dan larutkan dalam
10 mL kloroform.
2. Tambahkan 10 mL larutan Hannus/Wijs secara kuantitatif ke dalamnya
dan diamkan selama 30 menit di tempat gelap.
3. Tambah 10 mL larutan KI 15% lalu kocok.
4. Semprot dinding erlenmeyer dan tutupnya dengan air didih.
5. Titrasi campuran dengan larutan natrium tiosulfat 0,1 N sampai larutan
berwarna kuning.
6. Tambahkan 1 mL larutan kanji, selanjutnya titrasi kembali sampai
warna biru hilang. Lakukan percobaan yang sama untuk blanko. 8
7. Hitung angka iodium sampel.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

C. Penentuan Angka Peroksida

Lipid mudah mengalami oksidasi sehingga menyebabkan tengik. Lipid
bila teroksidasi akan menghasilkan senyawa hidroperoksida. Untuk
mengetahui banyaknya lipid yang teroksidasi ditentukan dengan bilangan
peroksida. Ada beberapa cara untuk penentuan ini.
Prosedur:
1. Masukkan 100 mg sampel ke tabung reaksi, tambahkan 0,5 mL larutan
KI, larutan AlCl3 0,5 mL dan 1 mL n-heksana.
2. Inkubasi campuran pada 37°C selama 5 menit.
3. Tambahkan 15 mL larutan HCl 0,01 N dan 0,5 mL larutan kanji. Kocok
campuran dengan kuat dengan menggunakan corong pisah. Pisahkan
lapisan bawah dan baca absorbansinya pada λ = 560 nm.
4. Lakukan kalibrasi menggunakan larutan standar KIO 3 dengan cara
mencampurkan 0,2 mL larutan KIO3, 0,5 mL larutan AICl3 dan 0,5 mL
larutan KI lalu tambahkan 15 mL larutan HCl 0,01 N dan 0,5 mL larutan
kanji dan diukur absorbansinya pada λ = 560 nm.
1,2 x A x K
Angka proksida 
m x A st

Dengan:
A = absorbansi sampel pada λ = 560 nm
Ast = absorbansi standar pada λ = 560 nm
m = berat minyak (g)
K = faktor konversi volume (1,01212)

D. Penentuan bilangan TBA (Asam Tiobarbiturat)

Hidroperoksida yang merupakan hasil utama pada reaksi oksidasi lipid
dapat mengalami penguraian menjadi senyawa yang lebih kecil seperti
aldehida. Aldehida dapat menimbulkan bau dan rasa tidak enak pada lipid.
Selain itu aldehida dapat bersifat karsinogenik. Untuk mengetahui 9
banyaknya aldehida dapat digunakan metode TBA, Sebagai contoh reaksi
antara malonaldehida dengan TBA.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

Prosedur:
1. Timbang 0,2 g minyak dan 1 mL heksana. Kocok campuran.
2. Pipet 0,5 mL campuran, tambahkan 4 mL larutan TCA 20% dan 2 mL
larutan asam tiobarbiturat 0,67%.
3. Tambahkan 1 mL kloroform ke dalam campuran, kocok dan pisahkan
dengan corong pisah. Ukur absorbansi larutan yang berwarna merah
jernih pada λ = 531.5 nm.

IV. PUSTAKA
Frais, F. 1972. Practical Biochemistry in Introductory Course, 1st ed.,
Butterworth & Co., Ltd., London, 104.

Harrow, B., et al. 1960. Laboratory Manual of Biochemistry, 5th ed., W. B.

Sanders Comp., New York, 13-17.

Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.

10

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

DARAH

I. TUJUAN
1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi kolesterol dalam darah.
2. Mahasiswa dapat menentukan kadar glukosa dalam darah.

II. TEORI SINGKAT

Kolesterol termasuk senyawa lipid kelompok steroid, bisa terdapat
bersama lemak hewan, tidak terdapat bersama lemak tumbuhan.
Kolesterol terdapat pada seluruh tubuh, terutama pada jaringan syaraf,
baik pada sistem syaraf pusat maupun sistem syaraf tepi (perifer), juga
terdapat pada anak ginjal, plasma darah dan lemak kulit. Hablur kolesterol
berbentuk persegi panjang dan sukar larut dalam air, keberadaannya
dalam serum berkonjugasi sebagai lipoprotein 25% kolesterol dan 75%
ester asam lemak tak jenuh. Pemeriksaan kolesterol secara klinis dapat
dipergunakan untuk menganalisis metabolisme tubuh. Kadar kolestrol
dalam serum bergantung pada usia, jenis kelamin, pola hidup, pola
makanan, keseimbangan hormonal dan kehamilan. Kadar kolesterol
normal dalam darah adalah 140 – 250 mg/100 mL.
Dalam lingkungan asam, kolesterol bereaksi dengan asam menjadi
senyawa yang tidak stabil dan memberikan warna yang intensif, sehingga
berguna untuk identifikasi.

III. PROSEDUR KERJA

A. Penentuan Kolesterol dalam Darah
a. Pembuatan Filtrat Darah Bebas Protein
1. Diambil 0,1 mL darah yang “oxalated”, dimasukkan dalam tabung 11
sentrifuse yang telah berisi 1,9 mL aquades, dicampur hingga
homogen.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

2. Ditambahkan 1,5 mL Ba(OH)2 0,3 M, diaduk hingga homogen.

3. Ditambahkan lagi kedalamnya 1,5 mL ZnSO4 5 %.
4. Semua campuran dihomogenkan dan dimasukkan ke dalam tabung
sentrifuse selama 20 menit.
5. Filtrat bening hasil sentrifuse akan digunakan untuk menentukan
kadar kolesterol dalam darah.

b. Penentuan Kolestrol dalam Darah (500 nm)

1. Serum darah sebanyak 1 mL dimasukkan kedalam tabung
sentrifuse kemudian ditambahkan 1 mL kloroform, kocok dan
sentrifuse selama 5 menit.
2. Ambil supermatannya dan pindahkan ke tabung reaksi, kemudian
tambahkan 0,5 mL asam asetat anhidrida dan 3 tetes asam sulfat
pekat.
3. Kocok hati-hati dan periksa warna yang terbentuk.
4. Warna yang terbentuk tidak stabil dari warna merah berubah ke
biru dan hijau.
5. Ukur absorbansinya pada panjang gelombang 430 nm dan 560 nm.
6. Kadar kolesterol darah diukur dari kurva absorbansi vs konsentrasi
kolesterol standar.

c. Pertanyaan
1. Mengapa terjadi perubahan warna tidak stabil pada supernatan
yang dihasilkan?
2. Berapakah kadar kolesterol dalam darah secara semikuantitaf?
3. Apakah kesimpulan percobaan anda?

B. Penentuan Glukosa dalam Darah

Salah satu cara penentuan kadar glukosa darah dapat dilakukan 12
dengan metode kondensasi gugus amin. Prinsipnya adalah aldosa
dikondensasi dengan o-toluidin dalam suasana asam dan menghasilkan

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

larutan berwarna hijau setelah dipanaskan. Kadar glukosa ditentukan

dengan membandingkan warna yang terjadi hasil spektrofotometer
dengan larutan standar glukosa yang telah ditentukan konsentrasinya.
Prosedur:
1. Diambil 0,1 mL darah yang “oxalated”, dimasukkan dalam tabung
sentrifuse yang telah berisi 1 mL TCA kemudian disentrifuse selama 5
menit.
2. Sebanyak 0,5 mL serum darah diambil dan ditambahkan 2 mL o-
toluidin lalu dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 8 menit.
Kemudian didinginkan dengan air mengalir.
3. Setelah 20 menit, ukur absorbansinya pada panjang gelombang 630
nm.
4. Kadar glukosa darah diukur dari kurva absorbansi vs konsentrasi
glukosa standar.
5. Konsentrasi glukosa standar yang dibuat adalah 5, 10, 15, 20 dan 25
mg/100mL.

13

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

URINE

I. TUJUAN
Mahasiswa mengetahui berbagai uji kualitatif urine.

II. TEORI SINGKAT

Urine merupakan cairan yang diekskresikan oleh ginjal. Komponen dan
kadar dari zat-zat yang terdapat dalam urine berbeda-beda tergantung
dari apa yang dimakan dan apa yang tidak dibutuhkan oleh tubuh. Bagian
yang tidak dibutuhkan tersebut akan dikeluarkan oleh tubuh.
Selain air, urine mengandung garam-garam, asam, basa, sisa-sisa
metabolisme yang tidak dibutuhkan lagi oleh tubuh, zat hasil detoksifikasi
dan kelebihan zat yang dikeluarkan oleh darah. Untuk mengetahui apakah
fungsi organ tubuh normal atau tidak dapat dilakukan percobaan terhadap
urine.

III. PROSEDUR KERJA

A. Penentuan Sifat Fisik dari Urine
Prosedur:
1. Kumpulkan urine selama 24 jam dan beri pengawet. Sebagai
pengawet dapat dipakai 2 mL toluene atau 2 mL formaldehida
40%.
2. Lakukan penentuan-penentuan sebagai berikut:

a. Penentuan volume urine

Setelah ditampung selama 24 jam, tentukan volume urine kemudian
kocok urine tersebut sarnpai homogen. Pisahkan sebanyak 250 mL 14
untuk pemeriksaan di laboratorium.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

b. Penentuan kejernihan dan warna

Amati warna urine dan kejernihannya.
c. Penentuan pH urine
Tentukan pH urine menggunakan kertas pH universal.

B. Penentuan Beberapa Komponen yang Terdapat dalam Urine

a. Penentuan garam-garam ammonium
1. Tempatkan 2 mL urine ke dalam tabung reaksi.
2. Tambahkan larutan NaOH encer sampai larutan bersifat basa
(gunakan kertas lakmus merah).
3. Panaskan campuran di penangas air.
4. Cium bau uap yang keluar dan uji uap tersebut dengan kertas
lakmus merah basah.

b. Pemeriksaan sulfat anorganik dan sulfat eterial

1. Tempatkan 5 mL urine dalam tabung reaksi.
2. Asamkan dengan 1 mL larutan HCl 0,5 M.
3. Tambahkan 1 mL larutan BaCl2 1 M, kocok dan saring endapan
yang terbentuk.
4. Pisahkan fiitrat dan endapannya.
5. Larutkan endapan dalam 1 mL HCl 0,5 N dan amati perubahan
yang terjadi.
6. Didihkan filtrat di penangas air, bila tidak ada endapan, tambahkan
lagi 1 mL larutan BaCl2 1 M. Bila timbul kekeruhan rnenunjukkan
adanya sulfat eterial.

c. Penentuan asam urat

Tes ini dinamakan juga tes mureksid. Asam urat bila dioksidasikan
oleh asam nitrat akan menghasilkan asam dialurat dan alloksan, yang 15
akan mengalami kondensasi dengan adanya NH3. Hasil kondensasi ini

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

dinamakan mureksid atau ammonium purpurat yang berwarna ungu

kemerahan.
Prosedur:
1. Tempatkan 2 mL urine dalam cawan penguap.
2. Tambahkan 4 tetes HNO3 pekat dan panaskan di atas hot plate
dalam lemari asam sampai airnya menguap.
3. Amati warna yang terbentuk pada endapan dan tambahkan 2 mL
larutan NH3 1:100.
4. Amati perubahan warna yang terjadi.

d. Penentuan kreatinin
Percobaan ini berdasarkan pembentukan warna merah rubi bila
kreatinin direaksikan dengan nitroprusida dalam suasana basa. Warna
tersebut lama kelamaan berubah menjadi kuning. Bila campuran
tersebut diasamkan dengan asam asetat, warnanya akan berubah
menjadi hijau dan kemudian menjadi biru karena terbentuknya biru
prusian.
Prosedur:
1. Tempatkan 5 mL urine dalam tabung reaksi dan tambahkan 5 tetes
larutan natrium nitroprusida 0,1 M.
2. Teteskan larutan NaOH 1 M tetes demi tetes sampai warna merah
timbul.
3. Didihkan campuran tersebut dan amati perubahan warna yang
terjadi.
4. Asamkan dengan asam asetat glasial dengan hati-hati, panaskan
dan amati perubahan warna yang terjadi.

C. Penentuan Beberapa Senyawa pada Urine tidak Normal

Yang dimaksud dengan urine tidak normal adalah urine dengan kadar 16
senyawa-senyawa tertentu di atas batas ambang normal. Senyawa

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

tersebut bila dalam keadaan normal tidak terdeteksi, tetapi pada

keadaan tidak normal (penderita), senyawa tersebut akan terdeteksi.
a. Penentuan adanya glukosa yang berlebih
Glukosa pada penderita diabetes kadarnya dalam darah berlebih
dan dikeluarkan melalui urine. Adanya glukosa sebagai gula
pereduksi dapat dideteksi dengan pereaksi Benedict.
1. Teteskan 5 tetes urine tidak normal ke dalam tabung reaksi.
2. Tambahkan 1 mL larutan Benedict dan didihkan selama 5 menit
di penangas air
3. Amati perubahan yang terjadi.

b. Penentuan benda-benda keton

Benda-benda keton merupakan senyawa-senyawa yang terbentuk
akibat metabolisme yang tidak sempurna. Benda-benda keton
terdiri dari aseton, 6-hidroksibutirat dan asetoasetat. Terbentuknya
benda keton dapat menyebabkan terjadinya asidosis. Benda-benda
keton ini dapat dikeluarkan melalui urine.
Prosedur:
1. Tempatkan 1 mL urine tidak normal dalam tabung reaksi.
2. Jenuhkan dengan larutan (NH4)2SO4 jenuh sambil dikocok.
3. Tambahkan 2 tetes larutan natrium nitroprusida 5% (fresh/baru
dibuat) dan 1 mL NH3 pekat.
4. Kocok dan biarkan selama 30 menit. Warna ungu yang timbul
menandakan adanya keton.

c. Penentuan darah
Darah kadang-kadang ada dalam urine, terutama bila ada infeksi
atau luka pada saluran urine dan luka pada ginjal.
Prosedur: 17
1. Tempatkan 2 rnL urine tidak normal dalam tabung reaksi.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

2. Tambahkan 1 mL larutan Benzidin jenuh dan 3,5 mL larutan

H2O2 3%.
3. Kocok campuran dan amati perubahan yang terjadi.

18

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

ELEKTROFORESIS GEL POLIAKRILAMID-SDS

I. TUJUAN
1. Mahasiswa mengetahui dan mempergunakan alat elektroforesis
2. Mahasiswa dapat menentukan berat molekul protein.

II. TEORI SINGKAT

Protein adalah suatu polimer yang monomernya terdiri asam amino yang
terikat oleh ikatan peptide. Suatu protein aktif merupakan suatu polipeptida yang
telah melipat membentuk struktur tersier dan kuarterner. Protein tertentu
mempunyai susunan dan jumlah asam amino tertentu. Dengan kata lain protein
mempunyai berat molekul tertentu dan biasanya dinyatakan dengan susunan Da.
Satu molekul asam amino mempunyai berat molekul 110 Da. Berat molekul satu
protein dapat ditentukan dengan berbagai macam cara, salah satunya adalah
dengan elektroforesis sodiumdodecyl sulfate-polycrylamide gel electrophoresis
(SDS-PAGE). Metode SDS-PAGE juga dapat digunakan untuk menetukan
apakah suatu protein terdiri dari satu submit atau lebih.
Metode SDS-PAGE adalah pemisahan protein didasarkan pada perbedaan
berat molekul protein dalam suatu medan listrki. SDS adalah suatu detergen
yang bermuatan negatif yang akan membentuk kompleks dengan molekul
protein. Dengan demikian protein akan bermuatan negatif dengan muatan yang
sebanding dengan panjang rantai subunit. SDS mengikat bagian hidrofobik dari
protein dan merusak struktur sekunder, tersier dan kuarterner protein. Gel
polikarilamid adalah media pendukung yang dipakai untuk memisahkan protein.
Gel ini merupakan hasil polimerisasi dari akrilamid dengan menggunakan N,
N’metilen-bis-akrilamid sebagai pembentuk ikatan silang. Molekul protein akan
bermigrasi melewati pori gel akrilamid dengan mobilitas yang tergantung pada
panjangnya. Jika suatu protein mengandung lebih dari satu submit maka pada
elektroforesis akan terdapat lebih dari dua molekul yang bermigrasi. Berat
molekul protein dapat ditentukan dengan menggunakan kurva kalibrasi antara 19

logaritma berat molekul protein standar dan jarak migrasi.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

Teknik elektroforesis SDS-PAGE ini juga dapat digunakan untuk berbagai

keperluan, misaknya: penentuan kemurnian protein, penentuan konsentrasi
protein, penentuan adanya proteolisis dan deteksi adanya modifikasi pada
protein.

III. PROSEDUR KERJA

Alat:
1) Bio-Rad Mini-Protean II.
2) Power supply.
3) Tabung Eppendorf.
4) Gel loading tips.

Bahan:
1) Akrilamid : bis-akrilamid (39:1)
2) Tris-HCl pH 6.8 1M
3) Tris-HCl pH 8,7 1M.
4) SDS 20%.
5) N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin (TEMED).
6) Ammonium persulfat 10%.
7) Running Buffer (1g SDS, 3,03 g Tris, 14,4 g glisin, ditambahkan air
sampai dengan
100 mL).
8) Larutan staining (40 mL metanol, 15 mL asam asetat, 0,1 g Coomassie
brilliant blue G250, ditambahkan air sampai dengan 100 mL).
9) Larutan destaining (10 mL metanol, 7,5 mL asam asetat, ditambahkan
air sampai dengan 100 mL).
10) 5x Sampel Buffer (12,5 mL 1M Tris pH 6,8; 20 mL gliserol, 10 mL β
mercaptoethanol, 40 mL 10% SDS, 15 mg Bromophenol Blue).

20

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

Tabel Komposisi Gel Poliakrilamid 10%

Larutan Induk Stacking Gel (mL) Running Gel (mL)
Acr/Bis 2, 5 10
H2O 14,84 13
1 M Tris pH 6,8 2,5 -
1 M Tris pH 8,7 - 15
20% SDS 0,1 0,2
10% APS 0,1 0,2
TEMED (μl) 16 30

PERHATIAN!!!
 Akrilamid adalah senyawa neurotoxin, Jadi gunakan sarung
tangan kalau membuat gel akrilamid.
 Polimer akrilamid tidak bersifat neurotoxin.
 Jangan menyentuh alat elektroforesis yang sedang ada voltase.

Cara Kerja:
A. Persiapan Gel
1. Campurkan semua larutan untuk separating gel dengan urutan
penambahan sesuai dengan tabel diatas.
2. Tuangkan (dengan menggunakan pipet) larutan ke dalam gel
sandwich sampai kira-kira 1,5 cm dari bagian atas plate.
3. Tambahkan air sampai ketinggian kira-kira 1-5 mm.
4. Diamkan sampai terjadi polimerisasi (30 menit).
5. Campurkan semua larutan untuk stacking gel dengan urutan
penambahan sesuai dengan tabel di atas.
6. Buang air yang terdapat pada bagian atas separating gel.
7. Tuangkan campuran stacking gel di atas separating gel dan
siapkan comb.
8. Diamkan sampai terjadi polimerisasi (30 menit).

B. Persiapan Sampel
21
1. Siapkan larutan protein standard an sampel protein.
2. Tambahkan larutan 5x sampel buffer.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

3. Didihkan selama 5 menit.

C. Elektrolisis Gel
1. Pasangkan gel sandwich yang telah disiapkan ke alat
elektroforesis.
2. Tuangkan running buffer kedalam tank elektroforesis.
3. Masukan sampel protein (10-20 μg) ke dalam tiap-tiap lubang gel
dengan pipet mikro (Eppendorf).
4. Pasang penutup alat elektroforesis.
5. Sambungkan ke power supply dan lakukan elektroforesis pada
voltase tetap 200 V.
6. Matikan alat setelah blue dye tepat keluar dari gel (kira-kira 60
menit).

D. Staining dan Destaining

1. Keluarkan gel dari plate (gunakanlah sarung tangan).
2. Masukan kedalam larutan destaining (50 mL).
3. Biarkan selama 15 menit.
4. Pindahkan kedalam larutan destaining (50 mL).
5. Biarkan sampai gel menjadi bersih (30 menit-semalam).
Tugas:
1. Buat kurva kalibrasi protein standar.
2. Tentukan berat molekul protein sampel yang dianalisis.

IV. TUGAS PENDAHULUAN

1. Jelaskan reaksi pembentukan polimer poliakrilamid dan sebutkan
fungsi bis-akrilamid, TEMED, ammonium persulfat dan
merkaptoetanol.
22
2. Jelaskan prinsip elektroforesis.
3. Jelaskan bagaimana cara memvisualisasikan protein hasil
pemisahan dengan SDS-PAGE.

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

Petunjuk Praktikum Metabolisme Biomolekul

V. PUSTAKA
Bollag, D. M., Rozycki, M. D. and Edelstein, S. J. 1996, Protein Methods,
2nd ed., A John Willey & Sons, Inc. Pub, New York.

Boyer, R. F. 1993, Modern Experimental Biochemistry, 2nd ed., The

Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. California.

Matthew, C. K. and van Holde, K. E. 1991, Biochemistry, The

Benjamin/Cummnings Publishing Company, Inc. California.

23

Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ