BIOKIMIA I
OLEH:
TIM BIOKIMIA
LABORATORIUM KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA
TATA TERTIB PRAKTIKUM
LABORATORIUM KIMIA
FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA
A. Bila hendak praktikum, praktikkan diwajibkan :
1. Datang tepat waktu. Keterlambatan 15 menit tanpa alasan yang sah dianggap tidak
hadir dan tidak diizinkan mengikuti praktikum.
2. Menyiapkan laporan awal, bagan prosedur percobaan dan laporan praktikum.
3. Menyimpan tas pada tempat yang telah disediakan (dibawah meja kerja).
4. Mengisi form kehadiran tiap kali mengikuti praktikum.
5. Membawa alat‐alat yang diperlukan selama praktikum berlangsung (handuk kecil,
untuk lap, gunting, lem, korek api, sabun cuci tangan).
6. Meminjam dan memeriksa ulang alat kaca yang diperlukan selama praktikum kepada
laboran, jika terdapat ketidaklengkapan dan kerusakan, maka praktikan diberikan
waktu minimal satu jam untuk menukarnya.
B. Selama praktikum berlangsung, praktikan diwajibkan :
1. Berpakaian sopan dan memakai jas laboratorium.
2. Tidak makan, minum, dan merokok di dalam laboratorium.
3. Tidak bercanda dan bertindak yang dapat menimbulkan kecelakaan terhadap orang
lain.
4. Tidak mereaksikan sembarang bahan kimia tanpa ada petunjuk praktikum yang jelas
dan tanpa seizin dosen dan asisten dosen.
5. Tidak membuang sampah atau bahan sisa percobaan ke dalam wastafel.
6. Menjaga kebersihan, ketertiban, dan keamanan laboratorium secara bersama.
C. Setelah praktikum selesai, praktikan diwajibkan :
1. Mencuci dan membersihkan semua alat kaca yang digunakan selama praktikum
dengan sabun cair/tepol yang telah disediakan.
i
2. Memeriksa kembali kelengkapan dan keutuhan alat yang dipinjam kemudian
mengembalikannya kepada laboran.
3. Memberihkan meja praktikum masing‐masing tanpa mengandalkan mahasiswa yang
piket.
4. Lapor diri apabila selama praktikum memecahkan alat kaca.
5. Menyerahkan data/laporan sementara kepada asisten dosen untuk di paraf oleh
dosen pembimbing.
6. Meninggalkan laboratorium dengan seizin dosen pembimbing atau asisten dosen.
Jakarta, Agustus 2012
Kepala Laboratorium Kimia
Dr. Yusmaniar, M.Si
NIP. 19620626 199602 2 001
ii
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I
DAFTAR ISI
TATA TERTIB PRAKTIKUM i
DAFTAR ISI iii
I. UJI KUALITATIF ASAM AMINO 1
1. Uji Nitroprusida 2
2. Uji Sistin 3
3. Kromatografi Kertas Asam Amino 4
II. UJI KUALITATIF PROTEIN 7
1. Pengendapan dengan Logam 8
2. Pengendapan dengan Garam 9
3. Pengendapan dengan Alkohol 10
4. Uji Koagulasi 10
5. Denaturasi Protein 11
6. Uji Sulfur dalam Protein 11
III. UJI KUALITATIF KARBOHIDRAT 13
1. Uji Anthrone 13
2. Uji Pikrat 14
3. Uji Fearon 15
4. Uji Foulger 16
5. Uji Iodine 17
6. Uji Asam Musat 18
IV. UJI KUALITATIF LIPID 20
1. Isolasi Lipid 20
2. Emulsi 21
3. Tes Kelarutan 22
4. Uji Penyabunan 23
5. Uji Peroksida 24
6. Uji Busa (untuk Sabun) 24
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/20007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/20007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN I
I. TUJUAN
Asam amino adalah molekul organik dengan massa molekul rendah (antara 100-200)
yang mengandung setidaknya satu gugus karboksil (COOH) dan satu gugus amino (NH2)
dan merupakan suatu komponen penting untuk biosintesis protein. Di dalam protein
terdapat sekitar 20 asam amino. Semuanya merupakan suatu α-amino dengan pengecualian
untuk prolin dan hidroksiprolin. Variasi yang terjadi antar asam-asam amino terletak pada
gugus R atau rantai sampingnya (Gambar 1.1). Dari pengetahuan sifat kimia gugus R, sifat
suatu asam amino dapat diramalkan, sebaliknya, pengetahuan tentang sifat asam amino
akan membantu dalam mengidentifikasi gugus R.
H O
gugus N C C gugus
α-amino H O H α-karboksil
H
Gambar I.1. Stuktur Umum Asam Amino. Bagian asam amino ditunjukan dalam kotak
merupakan bagian yang umum untuk semua asam -amino sedangkan R mewakili rantai samping
yang memiliki stuktur berbeda untuk setiap asam amino. Gugus karboksil dan amino dapat
dimanfaatkan untuk menganalisa suatu asam amino secara umum dalam suatu campuran,
sedangkan R dimanfaatkan dalam menganalisa asam amino secara spesifik.
III.1.Uji Nitroprusida
Reaksi antara gugus sulfidril dari sisteina, peptida (glutation) atau protein dengan
nitroprusida dalam suasana amoniak berlebih dapat diterangkan sebagai berikut :
[Fe3 + (CN )5 NO ]2− + NH 3 + RSH → NH 4 + [Fe2 + (CN )5 NOSR ]2 −
Reagen Nitroprusida 1%: Cari penyusun reagen ini, lalu kumpulkan ke asisten.
Sisteina hidroksida Ammonium hidroksida encer
Berbagai larutan asam amino
Prosedur:
Pertanyaan:
Prosedur:
Pertanyaan:
Kromatografi kertas salah satu jenis kromatografi yang memiliki fasa stasioner dan
gerak berupa cairan yang tidak saling campur. Pada sistem ini biasanya digunakan larutan
jenuh dari suatu pelarut nonpolar (misalnya n-butanol) dan pelarut polar (misalnya air).
Campuran pelarut ini bermigrasi keseluruh kertas, komponen polar teradsorpsi pada media
pendukung (selulosa) menghasilkan ribuan tetes kecil adsorpsi dari fasa stasioner. Tetesan
fasa stasioner yang teradsopsi ini dicuci berturut-turut dengan melewatkan fasa gerak yang
berupa pelarut nonpolar sehingga partisi atau pemisahan sampel campuran terjadi.
Pada kromatografi kertas, sampel (campuran zat) diteteskan dengan pipa kapiler diatas
kertas, kemudian campuran pelarut (eluen) dilewatkan untuk bermigrasi melewati noda
(spot) dengan arah ke atas (ascending) atau ke bawah (descending). Lamanya proses
migrasi bergantung pada ketebalan kertas, pelarut yang dipilih dan suhu. Jarak yang
ditempuh oleh setiap senyawa dari garis dasar relatif terhadap jarak tempuh pelarut/eluen
didefinisikan sebagai Rf.
Nilai Rf dari suatu senyawa dalam sistem kromatografi kertas bergantung pada banyak
variabel diantaranya sistem pelarut, suhu, lamanya elusi, dan jenis kertas. Karena
dipengaruhi oleh banyak variable, maka Rf suatu zat dalam suatu sistem yang diketahui
merupakan suatu nilai kasar. Oleh karena itu, untuk analisis kualitatif suatu sampel yang
diketahui digunakan bersama-sama sampel yang tidak diketahui. Dua senyawa yang
berbeda dalam satu sistem pelarut tertentu dapat memiliki nilai Rf yang sama, oleh karena
itu hasil analisis yang diperoleh dengan teknik kromatografi kertas harus uji dengan
metode yang lain.
Senyawa yang dianalisis dengan tekhik kromatografi kertas dapat ditentukan lokasinya
pada kertas dengan berbagai cara. Pada percobaan ini, noda ditentukan lokasinya pada
kertas dengan menggunakan senyawa pewarna, yaitu ninhidrin.
Prosedur:
Tugas:
Hitung harga Rf tiap-tiap noda dan catat warnanya. Kemudian tetapkan komponen-
komponen asam amino dalam larutan yang diselidiki dengan membandingkan Rf–nya
dengan Rf asam-asam amino standar.
1. Diantara metode analisa kualitatif di atas metode manakah yang bisa dimanfaatkan
untuk analisa kuantitatif? Jelaskan!
2. a. Apa yang dimaksud dengan zwitterion?
b. Akibat terbentuknya zwitterion ini, dari gugus manakah dari asam amino yang
menghasilkan nilai pKa dan pKb?
3. Salah satu cara biosintesis asam amino dalam tubuh adalah dengan mengubah suatu
asam amino yang jumlahnya berlebih menjadi asam amino yang diinginkan melalui
reaksi transaminasi. Tuliskan mekanisme reaksi transaminasi tersebut lengkap dengan
enzimnya dan asam amino apa yang disintesis dengan cara interkonversi?
4. Berikan contoh berikut penjelasannya tentang suatu penyakit yang diakibatkan oleh
kekurangan asam amino tertentu?
5. Apa keuntungan dan kerugian metode pimisahan dengan kertas kromatografi?
6. Apa metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisa kuantitatif? Jelaskan!
7. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf?
V. PUSTAKA
Clark, J. M. and Switzer, R. L., 1976. Experimental Biochemistry, 2nd ed.,W. H. Freeman
and Company, San Fransisco, USA.
I. TUJUAN
Protein terdiri dari berbagai macam asam amino yang berikatan satu sama lain
melalui ikatan peptida. Karena setiap protein berbeda baik dalam jumLah dan jenis
asam amino penyusunnya, maka setiap protein mempunyai sifat fisika dan kimia
yang semuanya hampir berbeda kecuali dalam hal tertentu.
Penambahan garam, asam, basa, logam dan pelarut lain dapat mempengaruhi
larutan protein dalam air. Adanya perbedaan kelarutan dapat disebabkan oleh
terbentuknya suatu senyawa kompleks yang tidak larut di dalam air, berubahnya
struktur protein sehingga mempengaruhi kelarutannya, atau adanya perbedaan sifat
dan pelarut lain yang ditambahkan.
Prosedur:
1. Siapkan 5 tabung reaksi dan lakukan percobaan dengan mengikuti petunjuk pada
tabel 1.
2. Amati yang terjadi, bila ada endapan, dipisahkan dan dilarutkan kembali dalam
air. Amati yang terjadi.
3. Bila ada protein yang larut kembali, lakukan tes dengan pereaksi Biuret.
Pertanyaan:
Reagen Millon: Larutan Merkuri dan ion mercuro dalam asam nitrat dan asam
nitrit.
Reagen Biuret: Tambahkan 1 mL NaOH 2,5 N ke dalam 3 mL larutan protein dan
aduk.
Tambahkan pula setetes CuSO4 0.01 M. Aduk, jika tidak timbul
warna,
tambahkan lagi setetes atau 2 tetes larutan CuSO4.
Larutan protein Larutan (NH4)2SO4
Prosedur:
Pertanyaan:
III.4.Uji Koagulasi
Reagen dan Bahan:
Reagen Millon: Larutan Merkuri dan ion mercuro dalam asam nitrat dan asam
nitrit.
Larutan protein NaOH 2,5 N
Asam asetat 1 M
Prosedur:
1. Tambahkan 2 tetes HOAc 1M ke dalam 5 mL larutan protein. Letakkan tabung
dalam air mendidih selama 5 menit.
2. Ambil endapan dengan batang pengaduk. Uji kelarutan endapan di dalam air. Uji
endapan dengan reagen Millon.
Pertanyaan:
1. Apa fungsi penambahan asam kedalam larutan protein?
2. Protein apa yang menggumpal pada saat pendidihan?
III.5.Denaturasi Protein
Prosedur:
1. Siapkan 3 tabung reaksi dan lakukan percobaan dengan mengikuti petunjuk pada
tabel 3.
2. Tempatkan ketiga tabung reaksi tersebut dalam air mendidih selama 15 menit.
3. Dinginkan pada suhu kamar dan amati apa yang terjadi. Ke dalam tabung no. 2
dan 3 ditambahkan 5 mL larutan buffer asetat pH 4,7 dan amati apa yang terjadi.
Tabel 3. Denaturasi Protein
Nomor Tabung Reaksi 1 2 3
Putih telur (mL) 5 5 5
Buffer asetat pH 4,7 (mL) 1 – –
HCl 0,1 M (mL) – 1 –
NaOH 0,1 M (mL) – – 1
Pertanyaan:
1. Sifat fisik protein apa yang mempengaruhi kelarutan dari protein dalam percobaan
ini?
2. Perubahan kimia apa yang berhubungan dengan denaturasi telur?
Prosedur:
1. Campur 0,5 gram serbuk albumin dengan dua kali berat dari fusion mixture.
Panaskan dalam cawan porselin sampai tak berwarna.
2. Dinginkan dan larutkan dalam air panas. Saring jika perlu. Asamkan filtrat dengan
HCl. Panaskan hingga mendidih dan tambahkan beberapa tetes larutan BaCl2.
Pertanyaan:
Mengapa protein memberikan uji positif pada sulfur?
V. PUSTAKA
I. TUJUAN
III.1.Uji Anthrone
Reaksi anthrone merupakan metode yang baik dan cepat untuk menentukan
heksosa, aldopentosa, dan asam heksuronat, juga untuk mengetahui adanya
polisakarida. Larutan yang berwarna kehijauan ini memiliki absorpsi maksimum
620 nm, namun beberapa kabrohidrat dapat memberikan warna lain. Reaksi tidak
sesuai jika terdapat protein yang mengandung banyak gugus triptofan, karena
akan memberikan warna merah.
Reagen Anthrone 0,2%: Larutkan 0,2 gram anthrone dalam 100 mL H2SO4
pekat
Larutan glukosa 1% Larutan laktosa 1%
Larutan fruktosa 1% Larutan sukrosa 1%
Larutan galaktosa 1% Larutan amilum 1%
Larutan maltosa 1% H2SO4 50%
Kertas saring Asam asetat glasial
Prosedur:
Pertanyaan:
III.2.Uji Pikrat
Larutan Asam Pikrat Jenuh: Larutkan 1,2 gram asam pikrat dalam 100 mL
aquades
Larutan glukosa 1% Larutan laktosa 1%
Prosedur:
Pertanyaan:
III.3.Uji Fearon
Prosedur:
Pertanyaan:
III.4.Uji Foulger
Uji Foulger berfungsi untuk uji gula yang bergugus keto. seperti halnya uji
Seliwanoff.
Reagen Foulger: Tambahkan 2 gram stano klorida ke dalam 40 gram urea yang
telah
dilarutkan didalam 80 mL H2SO4 40% (v/v). Didihkan
campuran ini
hingga terlihat bening. Encerkan hingga 100 mL dengan
H2SO4 40%.
Larutan glukosa 0,5% Larutan maltosa 0,5%
Larutan fruktosa 0,5% Larutan sukrosa 0,5%
Larutan manosa 0,5% Larutan laktosa 0.5%
Larutan xylosa 0,5% Larutan dextrin 0,5%
HCl pekat Larutan amilum 0,5%
Prosedur:
Pertanyaan:
Larutan gula mana yang menunjukkan uji positif?
III.5.Uji Iodine
Larutan Iodine 0.01 M: Larutkan 10 gram kalium iodida dalam 1 liter air.
Tambahkan 2,5 gram iodin dan aduk.
Larutan amilum 1% HCl 6 N
NaOH 6 N
Prosedur:
Pertanyaan:
Glukosa 50 mg Galaktosa 50 mg
HNO3 pekat Aquades
Prosedur:
1. Siapkan dua tabung reaksi. isi tabung pertama dengan 50 mg glukosa dan
yang lainnya dengan 50 mg galaktosa.
2. Ke dalam masing-masing tabung. tambahkan 1 mL air suling dan HNO3
pekat. Panaskan kedua tabung tersebut dalam penangas air dalam lemari
asam
selama 30 - 60 menit.
3. Tambahkan H2O pada tiap tabung dan diamkan satu malam. Amati dan
tuliskan perubahan yang terjadi!
IV. PUSTAKA
Frais, F., 1971. Practical Biochemistry in Introductory Course, 1st ed., Butterworth
& Co.. Ltd., London, halaman 23-25.
I. TUJUAN
Mengetahui cara mengisolasi lipid dari suatu sampel beserta uji kualitatifnya.
Lipid merupakan biomolekul organik yang tidak larut di dalam air tetapi larut di
dalam pelarut organik seperti eter, kloroform, dan benzen. Dalam tubuh, lipid
berfungsi sebagai surnber energi, komponen struktur membran, sumber bahan
baku bagi biosintesis basa-basa purin serta pirimidin yang menyusun asam
nukleat, biosintesis asam amino tertentu, dan sebagainya.
Selain lipid yang berada dalam keadaan bebas terdapat pula lipid yang
berikatan dengan senyawa lain. Bila lipid berikatan dengan protein disebut
lipoprotein, bila berikatan dengan karbohidrat disebut glikolipid, dan bila berikatan
dengan fosfat anorganik disebut fosfolipid.
III.1.Isolasi Lipid
Prinsip isolasi lipid adalah berdasarkan perbedaan kelarutan lipid dengan
senyawa lain yang ada di dalam sampel. Campuran lipid dari suatu jaringan dapat
dipisahkan berdasarkan kelarutan dalam berbagai pelarut lipid atau pelarut
organik. Sebagai contoh fosfolipid dapat dipisahkan dari sterol dan lipid netral
dengan menggunakan aseton, sebab fosfolipid tidak larut dalam aseton. Untuk
fraksinasi lipid dapat dilakukan penyabunan.
III.2.Emulsi
Kebanyakan lipid larut dalam etanol 95%, tetapi membentuk suatu emulsi
apabila ke dalamnya ditambahkan beberapa tetes air. Emulsi yang terbentuk
mempunyai penampilan seperti susu dan tidak stabil. Akan kembali kepada
Prosedur:
a. Sabun sebagai emulgator (pencegah emulsi)
Siapkan 4 tabung reaksi dan lakukan percobaan mengikuti petunjuk pada tabel
1. Tabel 1. Emulsi.
Nomor Tabung reaksi 1 2 3 4
H2O (mL) 5 5 5 5
Minyak parafin (tetes) 1 – 1 –
Minyak kelapa (tetes) – 1 – 1
HCl encer (tetes) 1 1 – –
Soda (tetes) – – 1 1
Keempat tabung reaksi dikocok dan ditutup ibu jari. Amati dan jelaskan
perubahan yang terjadi pada keempat tabung tersebut.
Setiap senyawa lipid mempunyai karakteristik kelarutan yang berbeda dan sifat
ini digunakan pada ekstraksi dan isolasi lipid dari sampel biologis.
Prosedur:
III.4.Uji Penyabunan
Apabila lemak atau minyak dipanaskan dengan penambahan alkali, maka akan
terbentuk garam asam lemak atau sabun dan gliserol. Proses ini dikenal dengan
saponifikasi. Sabun larut dalam air, tetapi akan mengendap apabila ditambahkan
NaCl berlebih.
Prosedur:
1. Tambahkan 3 mL larutan KOH alkoholis 10% ke dalam tabung reaksi yang
berisi 2 tetes minyak.
2. Panaskan campuran di dalam penangas air mendidih selama 1 menit.
3. Setelah dingin, tambahkan HCl sedikit berlebih.
4. Pisahkan asam lemak bebas dengan cara mengekstraksinya dengan
kloroform atau eter.
5. Lakukan uji busa
III.5.Uji Peroksida
Prosedur:
1. Larutkan kira-kira 1 mL minyak olive di dalam 1 mL klorofrom, tambahkan 2 mL
asam asetat glasial dan satu tetes larutan KI 10%, aduk dengan rata dan
biarkan selama 5 menit.
2. Ulangi percobaan dengan menggunakan minyak/lemak tengik.
Pertanyaan:
Lipid mana yang menunjukan uji positif?
III.6.Uji Busa (untuk Sabun)
Prosedur:
Pertanyaan:
Prosedur:
Pertanyaan:
1. Apa hasilnya?
2. Senyawa organik lain apa yang juga menghasilkan reaksi positif?
III.8.Uji Aklorein
Apabila lesitin atau gliserol dipanaskan disertai dengan penambahan kalium
bisulfit, maka akan terjadi dehidratasi membentuk akrolein yang berbau khas.
Reaksi :
CHOH CH2
KHSO4
CHOH CH + H2O
CH2OH CHOH
Gliserol akrolein
Prosedur:
1. Tambahkan kalium bisulfat anhidrida sebanyak 100 mg kedalam tabung reksi
kering yang berisi 1 - 2 tetes gliserol.
2. Panaskan campuran dan cium bau yang terbentuk.
3. Ulangi percobaan dengan menggunakan lemak dan lesitin (hasil percobaan
isolasi lipid III.1.)
III.9.Tes Fosfat
Fosfolipid jika direaksikan dengan ammonium molibdat akan menghasilkan
kompleks amonium fosfomolibdat yang berwarna biru, seperti reaksi dibawah ini.
Prosedur:
1. Tambahkan 1 mL air ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 tetes larutan lesitin
(hasil percobaan isolasi lipid III.1.), kemudian kocok sampai homogen.
2. Tambahkan 1 mL larutan amonium molibdat 2,5% dalam asam sulfat 5 N lalu
kocok campuran.
3. Tambahkan 5 tetes larutan asam askorbat 5 % dan amati perubahan warna
yang terjadi.
Petanyaan:
1. Bagaimana hasil dari percobaan tersebut?
2. Lipid apa yang mengandung nitrogen, juga fosfor?
Prosedur:
1. Siapkan 15 tabung reaksi dan lakukan percobaan mengikuti petunjuk pada
tabel 3.
2. Buat larutan brom dengan cara melarutkan 1 mL Br2 dilarutkan di dalam 20 mL
klorofrom.
Tabel 3. Uji Ketidak Jenuhan Lemak.
Petanyaan:
Amati dan jelaskan perubahan-perubahan yang terjadi.
Prosedur:
1. Dalam tabung reaksi kering, larutkan 10 mg kolesterol (hasil percobaan isolasi
lipid III.1.) di dalam 2 mL klorofom anhidrat. Tambahkan volume dua tetes
H2SO4 pekat (B.D. 1,84).
2. Kocok tabung perlahan-lahan. Biarkan lapisan cair terpisah, amati warnanya.
Pertanyaan:
1. Lapisan mana yang merupakan lapisan klorofom? Bagaimana warnanya?
2. Jelaskan warna lapisan asam sulfat dalam cahaya yang dipantulkan dan
cahaya yang distransmisi!
Prosedur:
1. Dalam tabung reaksi kering, larutkan 10 mg kolesterol (hasil percobaan isolasi
lipid III.1.) di dalam 2 mL klorofom anhidrat. Tambahkan enam tetes asam
asetat anhidrida dan dua tetes H2SO4 pekat (B.D. 1,84).
2. Kocok tabung perlahan-lahan sampai homogen. Biarkan untuk beberapa
menit, amati warna yang terbentuk.
Pertanyaan:
1. Jelaskan warna dari pada isi tabung?
2. Bagaimana kepekaan dari kedua uji diatas tersebut: Salkowski dan
Liebermann – Burchard terhadap kolesterol?
3. Apa yang menyebabkan reaksi warna ini berguna untuk penentuaan
kuantitatif?
IV. PUSTAKA
Frais, F., 1971. Pratical Biochemistry in Introductory Course, 1st ed., Butterworth &
Co. Ltd., London, halaman 23-25.
ENZIM
ENZIM
I. TUJUAN
Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai biokatalis. Enzim sebagai protein
mempunyai sifat protein dan sebagai biokatalis enzim mempunyai aktivitas.
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain suhu, pH, waktu
inkubasi, konsentrasi substrat, koenzim, inhibitor dan lainnya.
ENZIM
Hasil pertanian pada umumnya tidak dapat disimpan dalam waktu yang lama.
Salah satu penyebab cepat rusaknya komoditi ini adalah terjadinya pencoklatan
yang diikuti oleh perubahan penampilan, rasa dan bau.
Reaksi pencoklatan terutama disebabkan oleh enzim polifenol oksidase (PFO)
yang terkandung dalam buah, sayur dan umbi-umbian tersebut. Pada percobaan
ini polifenol oksidase diisolasi dari kentang.
Enzim polifenol oksidase adalah suatu enzim yang dapat mengkatalisis reaksi
hidroksilasi dan oksidasi substrat dari golongan senyawa-senyawa fenolik. Enzim
ini juga dikenal dengan nama fenol oksidase, fenolase, tirosinase, katekholase,
dopa oksidase dan katekol oksidase. Pada umumnya polifenol oksidase dapat
mengkatalisis dua macam reaksi yaitu:
1. Hidroksilasi pada senyawa monofenol menghasilkan difenol pada posisi orto,
dengan enzim yang berperan adalah kresolase.
2. Oksidasi orto difenol menghasilkan quinon, dengan enzim yang mengkatalisis
disebut katekolase.
Prosedur:
ENZIM
Prosedur:
1. Siapkan 3 tabung reaksi dan lakukan percobaan sesuai petunjuk pada tabel 6.
2. Inkubasi tabung-tabung yang telah terisi pada suhu 30 °C selama 30 menit.
3. Aktivitas enzim dihentikan dengan merendam tabung dalam air mendidih
selama 3 menit.
4. Tentukan perubahan absorbansi pada λ = 470 nm. Aktivitas polifenol oksidase
adalah selisih antara absorbansi sampel dengan absorbansi kontrol. Aktivitas
polifenol oksidase dinyatakan dalam unit aktivitas. Satu unit aktivitas polifenol
oksidase dapat dinyatakan ekuivalen dengan kenaikan 0,001 Absorbansi per
menit. Aktivitas spesifik dinyatakan dalam unit per mg protein.
Prosedur:
1. Tambahkan 5,0 mL pereaksi CuS04 ke dalam 0,5 mL larutan enzim kasar.
Kocok dan inkubasi selama 10 menit. Ke dalam campuran tersebut tambahkan
0,5 mL reagen Folin Ciocalteu 1 M dan ukur absorbansinya pada λ = 700 nm.
2. Larutan standar yang dapat digunakan adalah larutan Bovin Serum Albumin
dengan konsentrasi 20 - 200 µg.
ENZIM
Prosedur:
1. Siapkan 11 tabung reaksi dan lakukan percobaan sesuai petunjuk pada tabel
2.
2. Inkubasi tabung-tabung yang telah diisi pada 30°C selama 30 menit.
3. Aktivitas enzim dihentikan dengan merendam tabung dalam air mendidih
selama 3 menit.
4. Tentukan perubahan absorbansi pada λ = 470 nm.
Keterangan:
K1 = kontrol 1
K2 = kontrol 2
S = sampel
ENZIM
ENZIM
Bahan (mL) K1 K2 S K1 K2 S K1 K2 S K1 K2 S K1 K2 S
Larutan buffer
2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0
fosfat 0,1 M pH 6,8
Larutan Katekol
2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0
2,0 x 10–3 M
H20 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5
Larutan enzim
– 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5
kasar
Suhu inkubasi
pada waktu 30 26 °C 28 °C 30 °C 32 °C 34 °C
menit
Prosedur:
1. Sediakan 15 tabung reaksi dan ikuti prosedur pada tabel 5.
2. Aktivitas enzim dihentikan dengan merendam dalam air mendidih selama 3
menit.
3. Perubahan absorbansi ditentukan pada λ = 470 nm.
ENZIM
Prosedur:
1. Cuci mulut dengan cara berkumur-kumur menggunakan air sehingga bebas
dari sisa makanan.
2. Tampung air liur sampai volumenya kurang lebih 25 mL.
Prosedur:
1. Sediakan 5 tabung reaksi dan ikuti prosedur pada tabel 6.
2. Inkubasi pada suhu 38° C. Tentukan pada pH berapa yang paling cepat
mencapai titik akromatik.
3. Lakukan tes iodium pada setiap tabung. Untuk tabung No. 1 dan 2, sebelum
penambahan larutan terlebih dahulu harus diasamkan dengan asam asetat.
Nomor Tabung 1 2 3 4 5
Larutan buffer 5 mL (pH) 8,0 7,4 6,8 6,0 5,2
Larutan tepung 1% (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Larutan NaCl 0,1 M (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Larutan saliva 1 : 9 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Prosedur:
1. Sediakan 4 tabung reaksi dan ikuti prosedur pada tabel 7.
2. Setelah penambahan saliva larutan harus langsung diinkubasi dan jangan
dibiarkan pada rak tabung, kecuali tabung no. 2. Setiap menit ambil 1 mL
sampel dan lakukan tes dengan iodium, yaitu dengan menambahkan 2 tetes
larutan Iodium 0,01 M.
3. Amati aktivitas enzimnya.
ENZIM
Nomor Tabung 1 2 3 4
Larutan tepung 1% 5 5 5 5
(Saliva
L) encer 1 : 9 2 2 2 2
(Suhu )inkubasi Air es Suhu kamar 38 °C Air
didih
Prosedur:
1. Sediakan 6 tabung reaksi dan ikuti prosedur pada tabel 8.
2. Diamkan selama 10 menit sambil beberapa kali dikocok, kemudian tambahkan
5 mL larutan tepung 1% pada setiap tabung. Inkubasi pada suhu 38°C selama
15 menit.
3. Lakukan uji Iodium dan uji Benedict pada setiap setengah jumlah volum larutan
dalam tabung.
4. Amati serta tentukan apakah senyawa-senyawa tersebut berfungsi sebagai
inhibitor terhadap ptialin.
IV. PUSTAKA
DNA
DNA
I. TUJUAN
DNA
Prosedur:
1. Kupas kulit buah, potong-potong daging buah menjadi bagian yang lebih kecil,
timbang sebanyak 20 g, kemudian haluskan sampai berbentuk seperti bubur
dengan menggunakan mortar. Lalu masukkan kedalam gelas kimia 100 mL.
2. Tambahkan 3 g NaCl dan 10 mL detergen cair pada campuran diatas,
kemudian tambahkan air sampai volume total campuran menjadi 100 mL.
3. Aduk campuran dengan batang pengaduk, kemudian saring campuran dengan
kertas saring. Biarkan hasil saringan beberapa menit sampai terlihat homogen.
4. Ambil 6 ml hasil saringan dan masukkan kedalam gelas kimia 30 mL yang
bersih. Kemudian teteskan sedikit demi sedikit etanol pekat sebanyak 9 mL
dengan pipet tetes secara perlahan dan tanpa digoyang-goyang. Tunggu
beberapa menit untuk melihat proses pengendapan DNA. Hasil preparasi
dapat diamati dengan terlihatnya benang-benang halus berwarna putih yang
mengambang dalam larutan tersebut.
5. Benang-benang halus DNA dapat diambil dengan menggunakan batang
pengaduk atau alat lainnya dengan cara melilitkan secara perlahan.
Catatan: Etanol dingin bersuhu -20°C atau dalam freezer
DNA
1. Buat spektrum serapan dari 1 mL larutan DNA pada range 230-300 nm.
2. Catat puncak serapan dan tentukan λ maksimum (λ maksimum DNA 258 nm
dan A maksimum protein 280 nm).
3. Tentukan kemurnian DNA dalam sampel dengan memggunakan perbandingan
260 nm/280 nm).
III.3.ELEKTROFORESIS
1. Kemurnian DNA berasal dari asam nukleat yang diekstrak, dimana dapat
dilihat dari jumlah dan tipe/jenis pola pita-pita yang terbentuk.
2. Gunakan 0,1 mL sampel DNA untuk dianalisis dengan elektroforesis.
3. Ke dalam tabung Eppendorf tambahkan 10 µL sampel dan 10 µL buffer,
campur dengan menggunakan Vortex.
4. Isi salah satu sumur pada gel dengan DNA, lalu aliri arus 75 Volt dan buffer
TAE selama 1-15 menit atau sampai zat warna hampir mencapai ujung gel.
5. Gel difotografi dengan alat dokumentasi gel.
DNA
5’ G G A T C C 3’ EcoRI 5’ G G A T C C 3’
+
H2O
3’ C C T A G G 5’ 3’ C C T A G G 5’
Sebanyak kurang lebih 200 enzim retriksi telah diisolasi dan dikarakterisasi.
Enzim ini digunakan dalam rekjayasa genetic untuk memotong DNA. Enzim ini
sering digunakan untuk memotong plasmid sehingga dapat digabungkan dengan
fragmen DNA asing untuk menghasilkan DNA rekombinan. Enzim retriksi juga
digunakan untuk analisa DNA dan kontruksi peta retriksi dari suatu plasmid.
Tujuan percobaan ini adalah membuat analisa retriksi plasmid DNA setelah
dipotong dengan beberapa enzim retriksi. DNA adalah suatu molekul bermuatan
negatif. Pemotongan plasmid DNA dengan enzim retriksi akan menghasilkan
fragmen DNA linier. Fragmen DNA akan bermigrasi dalam medium pendukung
agarosa dalam suatu medan listrik dengan kecepatan berbanding terbalik dengan
ukurannya. Fragmen DNA atau DNA hasil elektroforesis divisualisasikan dengan
merendam gel hasil elektroforesis dalam larutan etidium bromida. Fragmen DNA
yang mengikat etidium bromida akan mengalami fluoresensi jika diberi sinar UV.
Untuk menentukan ukuran fragmen DNA hasil pemisahan, digunakan DNA
standar yang telah dipotong dengan enzim retriksi tertentu dan PDI1 dengan
berbagai enzim retriksi, menganalisa fragmen DNA yang dihasilkan dengan
elektroforesis gel agarosa dan membuat peta retriksi plasmid pRS.314-PDI.
Reagen dan Alat:
Enzim retriksi dan buffernya Alat elektroforesis
TAE buffer (Tris-asetat 0,04 M, EDTA 0,002 M, pH Power supply
7,8)
Gel-loading buffer (Tris-asetat 0,04 M mengandung Lampu UV
50% gliserol dan 0,25 % bromphenol blue, pH 8,0)
Gel agarosa 1% dalam TAE Inkubator 37ºC
PERHATIAN:
Ethidium bromide adalah senyawa mutagenik dan karsinogenik. Gunakan sarung
tangan dan jas lab selama bekerja. Gunakan kacamata pelindung atau letakkan
DNA
gel agarosa di bawah shield khusus ketika melihat DNA, jangan menyantuh alat
elektroforesis yang sedang ada voltase.
Prosedur:
1. Pemotongsn DNA dengan Enzim Retriksi
a. Masukkan ke dalam tabung Eppendorf komponen-komponen berikut: 15µl
H2O, 2 µl larutan DNA, 2 µl buffer dan 1 µl enzim retriksi.
b. Inkubasi campuran reaksi pada 37 ºC selama 1 jam.
Tugas Praktikum:
1. Buat kurva kalibrasi untuk fragmen DNA standar.
2. Tentukan ukuran fragmen DNA plasmid Prs.314-PDI1 yang telah dipotong
dengan enzim retriksi dan buat peta plasmidnya.
DNA
V. PUSTAKA