Pertanyaan-pertanyaan

1. Mengapa mengambil sampel ini?

2. Alasan pengambilan sampel pada jam 10-12 WITA!

3. Kenapa menggunakan pelarut etanol 96% dan etil asetat?

4. Kenapa di judulmu tidak mencantumkan pelarut/ekstrak apa yang

digunakan?

5. Dimana sampel diambil? Bagaimana cara pengambilan sampelnya?

6. Bagaimana mekanisme kerja antimikroba?

7. Kenapa dilakukan uji skrining untuk uji aktivitas antimikroba?

8. Kenapa dipakai ekstrak bukan yang lain?

9. Apa itu bioautografi? Kenapa dilakukan uji bioautografi?

10. Kenapa menggunakan metode KLT Bioautografi, apakah tidak ada

metode lain yang spesifik?

11. Apa keuntungan metode KLT Bioautografi dibandingkan dengan

metode lain?

12. Berapa standar dikatakan aktif sebagai antimikroba!

13. Apa itu zona hambatan?

14. Kenapa digunakan DMSO sebagai pelarut ekstrak?

15. Berapa standar konsentrasi DMSO sebagai pelarut? Kenapa 0,2 ml?

16. Rumus kimia DMSO!

17. Sifat-sifat DMSO!

18. Alasan penggunaan transmittan 25% untuk bakteri dan 75% untuk

jamur?
19. Kenapa diinkubasi pada suhu 37oC

20. Apa itu KHM & KBM? Apa maksudnya?

21. Alasan penggunaaan ketokonazol sebagai control (+) utk jamur?

22. Alasan penggunaan NaCl 0,9 % untuk suspensi bakteri dan jamur?

23. Mengapa menggunakan 9 mikroba uji?

24. Kenapa panjang gelombang 580nm

25. Setelah larut, ekstrak ditambahkan medium GNA 9,8 ml sehingga

diperoleh konsentrasi 1 mg/ml? kenapa 1 mg/ml?

26. Kenapa menggunakan medium GNA dan GNB?

27. Alasan penggunaan metode bioautografi kontak?

Ringkasan

 Alasan pengambilan sampel:

- Alasannya yang pertama karena tanaman Kumis kucing ini

menurut literatur berkhasiat sebagai antibakteri.

- Alasan yang kedua karena telah dilakukan penelitian sebelumnya

hasil diperoleh bahwa ekstrak n-heksan daun kumis kucing itu

tidak menunjukkan adanya aktivitas antibakteri, hal inilah yang

mendasari saya mengambil sampel kumis kucing dengan

menggunakan pelarut yang lain.

 Alasan pengambilan sampel pada jam 10-12 WITA, karena

diperkirakan pada jam tersebut terjadi proses fotosintesis

sempurna dimana paling banyak terdapat metabolit sekunder

(alkaloid,glikosida, steroid, flavanoid, tannin, resin).

 Alasan penggunaan pelarut Etanol

Etanol merupakan salah satu pelarut semi polar yang dapat

menyari senyawa polar dan non polar.

96% karena memiliki kandungan air yang sedikit sehingga

menghindari rusaknya ekstrak dengan tumbuhnya jamur serta tidak

toksik.

Etil asetat merupakan pelarut non polar dan dapat digunakan

untuk menarik komponen nonpolar yang terdapat dalam sampel.

 Alasan tidak mencantumkan pelarut/ekstrak apa yang digunakan:

Karena, belum diketahui pelarut apa yang menghambat

 Pengambilan sampel:

Pengambilan sampel dilakukan pada pagi hari sekitar pukul

10.00-12.00 siang. Sampel daun dipetik kemudian dicuci dengan air

mengalir untuk menghilangkan kotoran dari sampel tersebut

sehingga tidak mempengaruhi pada saat ekstraksi. Kemudian sampel

tersebut dirajang kecil-kecil lalu dikeringkan dengan cara diangin-

anginkan agar kandungan senyawa kimianya tetap terjaga.

Maksud pemotongan/perajangan di sini adalah untuk

memperluas permukaan bidang sentuh antara etanol dan daun kumis

kucing, dengan demikian penyarian dapat lebih efektif.

Sampel yang telah dikeringkan selanjutnya diekstraksi

dengan metode maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 96%.

Pemilihan metode maserasi karena struktur dari sampel yang lunak

dan juga untuk menjaga agar senyawa kimia dalam sampel tidak

rusak oleh pemanasan.

Partisi dilakukan untuk memisahkan komponen kimia

berdasarkan tingkat kepolarannya. Pemisahan ini dimaksudkan untuk

memudahkan dalam penentuan senyawa aktif tertentu.

 Mekanisme antimikroba

1). Antimikroba yang menghambat metabolisme sel mikroba

Contoh obat yaitu: sulfonamide, trimetoprim, asam p-

aminosalisilat (PAS) dan sulfon.

2). Penghambatan terhadap sintesis dinding sel

Contohnya basistrasin, sikloserin, penisilin, vankomisin.

3). Penghambatan terhadap fungsi membran sel

Contohnya amfoterisin β, kolistin, imidasol, polien, polimiksin.

4). Penghambatan terhadap sintesis protein

Contohnya aminoglikosid, kloramfenikol, tetrasiklin, eritromisin,

linkomisin.

5). Penghambatan terhadap sintesis asam nukleat

Contohnya quinolon dan rifampisin.

 Uji skrining antimikroba dilakukan untuk mencari ekstrak yang

aktif yang dapat menghambat mikroba (bakteri dan jamur) uji yaitu

dari ekstrak etanol, ekstrak larut etil asetat, dan yang tidak larut

etil asetat.
Ulasan mengenai Bioautografi

 Bioautografi : Bio = makhluk hidup, autografi = melakukan

aktivitas sendiri.

Bioautografi merupakan metode yang spesifik untuk

mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT atau kromatografi

kertas yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antifungi,

antiviral dan antibiotik.

KLT bioautografi adalah suatu metode pendeteksian untuk

menentukan senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi dengan

melokalisir/mengukur aktivitas antimikroba pada kromatogram.

KLT Bioautografi adalah pengujian lanjutan yang berfungsi

untuk mengetahui komponen kimia apa yang memberikan aktivitas

antimikroba dari ekstrak.

Dilakukan uji bioautografi yaitu untuk pendeteksian untuk

menentukan senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi dengan

melokalisir/mengukur aktivitas antimikroba pada kromatogram.

 Keuntungan metode KLT Bioautografi ini adalah:

Keuntungan :

1. Dapat mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT yang

mempunyai aktivitas sebaga antibakteri, antifungi, antibiotik,

dan antiviral.

2. Dapat digunakan untuk mendeteksi antibiotik yang belum

diketahui mekanismenya.
 3. Merupakan metode yang sederhana dan mudah dilakukan. Cepat

dalam pengerjaannya 4.

4. hanya membutuhkan perlatan sederhana dan interpretasi

hasilnya relative mudah dan akurat.

Kerugian:

1. Tidak bisa digunakan untuk senyawa yang tidak mempunyai

aktivitas membunuh ataupun menghambat mikroorganisme.

2. Hasil tidak valid karena kemungkinan adanya kontaminan dari

luar atau karena zat yang diidentifikasikan tidak mengandung

khasiat bakteri antibakteri.

3. Mempunyai faktor kesalahan yang besar 4.

 Kenapa menggunakan metode KLT Bioautografi ini: karena

telah dilakukan penelitian sebelumnya menggunakan metode yg lain.

 Alasan penggunaan metode bioautografi kontak.Karena

merupakan metode yang sederhana. Bioautografi kontak dilakukan

dengan meletakkan lempeng kromatografi yang telah dielusi

senyawa yang akan diuji di atas medium padat yang sudah

diinokulasi dengan mikroba uji. Adanya senyawa antimikroba

ditandai adanya daerah jernih yang tidak ditumbuhi mikroba

 Metode Pengujian ANTIMIKROBA

Ada metode lain yaitu metode Difusi dan Dilusi

Metode Difusi (Djide, 2008)

Difusi adalah proses perpindahan molekul secara acak

dari satu posisi ke posisi lain. Ada beberapa metode difusi yang

digunakan dalam penetapan potensi, antara lain :

a. Metode lempeng bujur sangkar

b. Metode lempeng pada cawan petri

c. Pencadang atau reservoir

Metode Dilusi (Turbudimetri) (Djide, 2008)

Prinsip pengujian potensi antibiotika dengan metode ini

adalah membandingkan derajat hambatan pertumbuhan

mikroorganisme uji oleh dosis antibiotika yang di uji terhadap

hambatan yang sama oleh dosis antibiotika baku pembanding dalam

media cair.

 Ekstrak dikatakan aktif jika pada konsentrasi ≤ 1000 μg/ml mampu

menghambat pertumbuhan bakteri dengan tidak adanya

pertumbuhan mikroba pada media pertumbuhan (Hoffmann,1993).

 Zona hambatan yaitu zona bening yang dapat menghambat

pertumbuhan bakteri.

Zona hambatan adalah daerah bening yang tidak ditumbuhi

oleh mikroorganisme. Terbentuknya zona hambatan ini karena zat

antimikroba bekerja pada mikroba yang ada pada medium agar,

 apabila sampel dari bahan alam ini aktif dalam menghambat

pertumbuhan mikroorganisme, maka akan terbentuk zona bening

disekitar bekas totolan yang ditelungkupkan terbalik pada

medium. Biasanya zona bening ini menjadi parameter suatu bahan

alam dikatakan memiliki aktivitas antimikroba yang baik.

 Ulasan Tentang DMSO (CH3)2SO

DMSO merupakan pelarut bersifat polar yang dapat

melarutkan komponen kimia polar dan non polar tanpa memberikan

penghambatan serta tidak toksik terhadap mikroba uji serta

diharapkan terdispersi merata di seluruh medium untuk

mendapatkan hasil yang homogeny.

DMSO dipilih sebagai pelarut karena telah dilaporkan bahwa

penggunaan DMSO tidak berpengaruh pada proliferasi sel

(Maryati dan Sutrisna, 2007).

Penjelasan: DMSO bukan pelarut tetapi bersifat sebagai

solubilizer (membantu melarutkan). Pada konsentrasi rendah

DMSO tidak toksik, toksik jika digunakan sebagai pelarut pada

konsentrasi tinggi. Mekanisme dari DMSO itu sendiri yaitu

membunuh sel bakteri.

 Sifat-sifat DMSO

1. Pada konsentrasi tinggi bersifat toksik

2.Sebagai surfaktan atau penurun tegangan antar muka- surfaktan

berfungsi sebagai antibakteri.

Sulfoxide Dimetil (DMSO) adalah senyawa organosulfur dengan

formula (CH3)2SO. DMSO merupakan cairan tak berwarna yang bersifat

polar dan merupakan pelarut aprotic yang melarutkan baik senyawa polar

dan nonpolar dalam berbagai pelarut organik serta air. DMSO memiliki

sifat yang unik yakni mampu menembus kulit dengan sangat mudah,

sehingga orang dapat mencicipinya segera setelah terjadi kontak dengan

kulit. DMSO memiliki rasa seperti tiram atau bawang putih.

Senyawa ini pertama kali disintesis pada tahun 1866 oleh ilmuwan

Rusia Alexander Zaytsev, yang melaporkan temuannya di tahun 1867.

Sulfoxide Dimetil sebenarnya merupakan produk sampingan dari kraft

pulping. Oxidation of dimethylsulfide with oxygen or nitrogen dioxide

gives DMSO. Proses oksidasi dari Dimethylsulfide dengan oksigen atau

nitrogen dioksida menghasilkan DMSO.

DMSO merupakan pelarut polar aprotic. DMSO bersifat kurang

toksik jika dibandingkan dengan anggota lain dari kelasnya seperti

dimetilformamida , dimetilasetamida , N-metil-2-pirolidon , dan

HMPA. Karena sifat pelarutnya yang sangat baik, DMSO sering digunakan

sebagai pelarut untuk reaksi kimia yang melibatkan garam, terutama

reaksi Finkelstein dan reaksi lain seperti substitusi nukleofilik . Selain itu,

DMSO juga banyak digunakan sebagai ekstraktan dalam biokimia dan

biologi sel. Karena titik didih tinggi, DMSO menguap perlahan pada

tekanan atmosfer normal. Reaksi dilakukan dalam DMSO sering

diencerkan dengan air untuk mengendapkan atau produk-fase terpisah.

DMSO digunakan dalam PCR untuk menghambat struktur sekunder

dalam DNA template atau primer DNA. DMSO ditambahkan ke campuran

PCR sebelum bereaksi, dimana DMSO akan membatu pembentukan

komplemen DNA dan meminimalkan reaksi-reaksi yang mengganggu.

Namun, penggunaan DMSO di PCR dapat meningkatkan tingkat mutasi.

DMSO juga dapat digunakan sebagai cryoprotectant, yang ditambahkan

ke media sel untuk mencegah kematian sel selama proses pembekuan

Sekitar 10% dapat digunakan dengan metode freeze-lambat, dan sel

dapat dibekukan pada -80 ° C atau disimpan dalam nitrogen cair dengan

aman.

(http://wwwkeroro93martablog.blogspot.com/)
 25% T : Karena ukuran bakteri yang kecil sehingga lebih banyak yang

terserap, sedangkan transmittan jamur ialah 75% T karena ukuran

jamur yang besar maka akan terserap sedikit.

 suhu 370C untuk mencapai fase stasioner yaitu pertumbuhan sempurna.

 KHM= Konsentrasi hambat minimum yaitu untuk melihat konsentrasi

terendah, untuk menentukan larutan tetap jernih,

KBM = Konsentrasi Bunuh Minimum, yaitu konsentrasi terendah

dimana tidak terdapat pertumbuhan mikroba.

 Ketokonazol karena merupakan senyawa turunan imidazol, aktivitas

antijamur dengan cara menimbulkan ketidakteraturan membran

sitoplasma jamur Dilakukan pensuspensian NaCl agar sifat isotonis

dari mikroba uji terjaga.

Alasan NaCl fisiologis 0,9%: supaya tidak mengalami lisis, isotonik.

 9 Mikroba uji mewakili bakteri gram positif dan negatif, jamur serta

berdasarkan bakteri pathogenesis.

 panjang gelombang 580nm, karena bisa terbaca ukuran bakteri dan

jamur.

 1 mg/ml, penggunaan konsentrasi tersebut karena menurut Hoffman

ekstrak dikatakan aktif jika pada konsentrasi 1 mg/ml menunjukkan

hambatan pertumbuhan mikroba, maka ekstrak tersebut potensial

untuk diteliti daya antimikroba.

  Digunakan medium GNA Karena

1. medium ini merupakan medium yang umum digunakan untuk

menumbuhkan bakteri dan jamur.

2. Merupakan medium agar yang digunakan pada dilusi padat yang

berfungsi untuk menumbuhkan mikroba uji.

3. Bakteri dan jamur mudah tumbuh pada medium ini mengandung glukosa

sebagai sumber karbohidrat dan pepton sebagai sumber protein.

Sedangkan medium GNB merupakan medium cair yang

digunakan pada pengujian KHM. Medium GNB ini juga berisi pepton

sebagai sumber protein dan glukosa sebagai sumber karbohidrat yang

dapat menunjang pertumbuhan bakteri dan jamur.

 Alasan penggunaan metode bioautografi langsung

Ulasan mengenai Ekstraksi

Ekstraksi adalah penyarian zat-zat aktif dari bagian tanaman obat.

Adapun tujuan dari ekstraksi yaitu untuk menarik komponen kimia yang

terdapat dalam simplisia.

Mekanisme Ekstraksi : berdasarkan atas difusi dan osmosis.

Difusi adalah peristiwa mengalirnya/berpindahnya suatu zat dalam pelarut

dari bagian berkonsentrasi tinggi ke bagian yang berkonsentrasi rendah.

Osmosis adalah perpindahan air melalui membran permeabel selektif dari

bagian yang lebih encer ke bagian yang lebih pekat.

Faktor-faktor yang mempengaruhi laju ekstraksi!

1. Tipe persiapan sampel

2. Waktu ekstraksi

3. Kuantitas pelarut

4. Suhu pelarut

5. Tipe pelarut

Metode-metode ekstraksi!

Metode panas

- Reflux

- Infundasi

- Destilasi uap air

Metode dingin

- Maserasi

- Perkolasi
 - Soxhletasi

Kriteria bahan yang diekstraksi!

- Bahan harus kering

- Bahan harus diserbukkan/dikecilkan ukuran partikelnya.

Kriteria pelarut yang digunakan dalam ekstraksi!

1. Stabil secara fisika dan kimia

2. Selektif

3. Ekonomis

4. Keamanan terjaga

5. Ramah lingkungan

Kenapa harus kering sampai kurang lebih 10 %?

- Untuk menghindari pertumbuhan mikroorganisme

- Mencegah reaksi enzimatis

- Untuk mendapatkan hasil pemisahan yang sempurna pada proses

ekstraksi

- Ekstraksi cair-cair adalah proses pemisahan zat terlarut didalam 2

macam zat pelarut yang tidak saling bercampur atau dengan kata lain

perbandingan konsentrasi zat terlarut dalam pelarut organik, dan pelarut

air.

- Ekstraksi padat cair adalah proses pemisahan untuk memperoleh

komponen kimia zat terlarut dari campurannya dalam padatan dengan

menggunakan pelarut yang sesuai.

 Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah

pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara

dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif,sedangkan

penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan

pencucian alkoholmemungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif

memiliki membran tunggal yang dilapisipeptidohlikan yang tebal (25-50nm)

sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3nm).

Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah

Enterobactericeae, Salmonella spp, Shigellaspp, E. Coli, Yersinia

enterolitica. Sedangkan bakteri gram positif adalah

Staphylococci, Streptococci,Enterococci, Clostridium, Bacillus

.Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah:

1. Larutan violet kristal hucker (1 tetes) sebagai cat utama yang akan

diikat oleh peptidoglikan bakteri.

2. Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama

3. Ethanol 95% (secukupnya sampai cat utama luntur), sebagai bahan

peluntur untukk melunturkan catutama

4. Safranin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel

yang sudah kehilangan warnacat utamanyaP a d a saat pemberian

larutan cat kristal violet, bakteri gram positif dan negatif

s a m a - s a m a berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada gram positif

terbentuk kompleks iodin kristal violet sehinggasel berwarna biru,

demikian juga gram negatif. Namun setelah pencucian dengan etanol warna

unguyang diikat oleh bakteri gram negatif luntur, sedangk an pada

bakteri gram negatif tidak. Pada gram negatif lemak terekstraksi

dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-

iodinkeluar sel, sedangkan pada gram posotif dinding sel dehidrasi, pori

berkerut dan permeabilitas rendahs e h i n g g a kompleks violet

kristal-iodin terperangkap antara dinding sel dan membran

s i t o p l a s m sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan safranin,

bakteri gram negatif mengikatnya sedangkangram negatif

melewatkannya.Bakteri

gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu

sewaktu proses pewarnaan Gram. B a k t e r i j e n i s i n i a k a n b e r w a r n a

biru atau ungu di b a w a h mikroskop, sedangkan bakterigram-

negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi

antara kedua jenisbakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan

strukturdinding selbakteri.Bakteri

gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna

metil ungu pada metod epewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan

mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengana lkohol,

sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram,

suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,

yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau

merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua

tipebakteri ini berdasarkan perbedaan strukturdinding selmereka. Banyak

spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka

berbahaya bagiorganismeinang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan

komponen tertentu pada dinding selgram-negatif, terutama lapisanl

ipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atauendotoksin).

 Alasan pengambilan sampel pada jam 10-12 WITA, karena

diperkirakan pada jam tersebut terjadi proses fotosintesis

sempurna dimana paling banyak terdapat metabolit sekunder

(alkaloid,glikosida, steroid, flavanoid, tannin, resin).

 Alasan penggunaan pelarut Etanol

Etanol merupakan salah satu pelarut semi polar yang dapat menyari

senyawa polar dan non polar.

96% karena memiliki kandungan air yang sedikit sehingga

menghindari rusaknya ekstrak dengan tumbuhnya jamur serta tidak

toksik.

Etil asetat merupakan pelarut non polar dan dapat digunakan untuk

menarik komponen nonpolar yang terdapat dalam sampel.

 Alasan tidak mencantumkan pelarut/ekstrak apa yang digunakan:

Karena, belum diketahui pelarut apa yang menghambat

 Pengambilan sampel:

Pengambilan sampel dilakukan pada pagi hari sekitar pukul

10.00-12.00 siang. Sampel daun dipetik kemudian dicuci dengan air

mengalir untuk menghilangkan kotoran dari sampel tersebut

sehingga tidak mempengaruhi pada saat ekstraksi. Kemudian sampel

tersebut dirajang kecil-kecil lalu dikeringkan dengan cara diangin-

anginkan agar kandungan senyawa kimianya tetap terjaga.

 Maksud pemotongan/perajangan di sini adalah untuk

memperluas permukaan bidang sentuh antara etanol dan daun kumis

kucing, dengan demikian penyarian dapat lebih efektif.

Sampel yang telah dikeringkan selanjutnya diekstraksi

dengan metode maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 96%.

Pemilihan metode maserasi karena struktur dari sampel yang lunak

dan juga untuk menjaga agar senyawa kimia dalam sampel tidak

rusak oleh pemanasan.

Partisi dilakukan untuk memisahkan komponen kimia berdasarkan

tingkat kepolarannya. Pemisahan ini dimaksudkan untuk

memudahkan dalam penentuan senyawa aktif tertentu.

 Mekanisme antimikroba

1). Antimikroba yang menghambat metabolisme sel mikroba

Contoh obat yaitu: sulfonamide, trimetoprim, asam p-

aminosalisilat (PAS) dan sulfon.

2). Penghambatan terhadap sintesis dinding sel

Contohnya basistrasin, sikloserin, penisilin, vankomisin.

3). Penghambatan terhadap fungsi membran sel

Contohnya amfoterisin β, kolistin, imidasol, polien, polimiksin.

4). Penghambatan terhadap sintesis protein

 Contohnya aminoglikosid, kloramfenikol, tetrasiklin, eritromisin,

linkomisin.

5). Penghambatan terhadap sintesis asam nukleat

Contohnya quinolon dan rifampisin.

 Uji skrining antimikroba dilakukan untuk mencari ekstrak yang aktif

yang dapat menghambat mikroba (bakteri dan jamur) uji yaitu dari

ekstrak etanol, ekstrak larut etil asetat, dan yang tidak larut etil

asetat

 Bioautografi : Bio = makhluk hidup, autografi = melakukan aktivitas

sendiri.

Bioautografi merupakan metode yang spesifik untuk mendeteksi

bercak pada kromatogram hasil KLT atau kromatografi kertas yang

mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, antiviral dan

antibiotik.

KLT bioautografi adalah suatu metode pendeteksian untuk

menentukan senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi dengan

melokalisir/mengukur aktivitas antimikroba pada kromatogram.

KLT Bioautografi adalah pengujian lanjutan yang berfungsi

untuk mengetahui komponen kimia apa yang memberikan aktivitas

antimikroba dari ekstrak.

Dilakukan uji bioautografi yaitu untuk pendeteksian untuk

menentukan senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi dengan

melokalisir/mengukur aktivitas antimikroba pada kromatogram.

 Kenapa menggunakan metode KLT Bioautografi ini karena belum

diketahui senyawa antimikroba pada tanaman ini.

Ada metode lain yaitu metode Difusi dan Dilusi

Metode Difusi (Djide, 2008)

Difusi adalah proses perpindahan molekul secara acak

dari satu posisi ke posisi lain. Ada beberapa metode difusi yang

digunakan dalam penetapan potensi, antara lain :

d. Metode lempeng bujur sangkar

e. Metode lempeng pada cawan petri

f. Pencadang atau reservoir

Metode Dilusi (Turbudimetri) (Djide, 2008)

Prinsip pengujian potensi antibiotika dengan metode ini

adalah membandingkan derajat hambatan pertumbuhan

mikroorganisme uji oleh dosis antibiotika yang di uji terhadap

hambatan yang sama oleh dosis antibiotika baku pembanding dalam

media cair.

 Keuntungan metode KLT Bioautografi ini adalah:

Keuntungan :

1. Dapat mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT yang

mempunyai aktivitas sebaga antibakteri, antifungi, antibiotik,

dan antiviral.
 2. Dapat digunakan untuk mendeteksi antibiotik yang belum

diketahui mekanismenya.

3. Merupakan metode yang sederhana dan mudah dilakukan. Cepat

dalam pengerjaannya 4.

Kerugian:

1. Tidak bisa digunakan untuk senyawa yang tidak mempunyai

aktivitas membunuh ataupun menghambat mikroorganisme.

2. Hasil tidak valid karena kemungkinan adanya kontaminan dari

luar atau karena zat yang diidentifikasikan tidak mengandung

khasiat bakteri antibakteri.

3. Mempunyai faktor kesalahan yang besar 4.

12. Ekstrak dikatakan aktif jika pada konsentrasi ≤ 1000 μg/ml

mampu menghambat pertumbuhan bakteri dengan tidak adanya

pertumbuhan mikroba pada media pertumbuhan (Hoffmann,1993).

13. Zona hambatan yaitu zona bening yang dapat menghambat

pertumbuhan bakteri.

Zona hambatan adalah daerah bening yang tidak ditumbuhi

oleh mikroorganisme. Terbentuknya zona hambatan ini karena zat

antimikroba bekerja pada mikroba yang ada pada medium agar,

apabila sampel dari bahan alam ini aktif dalam menghambat

pertumbuhan mikroorganisme, maka akan terbentuk zona bening

disekitar bekas totolan yang ditelungkupkan terbalik pada

 medium. Biasanya zona bening ini menjadi parameter suatu bahan

alam dikatakan memiliki aktivitas antimikroba yang baik.

14. Karena pelarut ini bersifat semipolar yang dapat melarutkan

komponen kimia polar dan non polar tanpa memberikan

penghambatan serta tidak toksik terhadap mikroba uji.

DMSO dipilih sebagai pelarut karena telah dilaporkan bahwa

penggunaan DMSO tidak berpengaruh pada proliferasi sel

(Maryati dan Sutrisna, 2007).

Penjelasan: DMSO bukan pelarut tetapi bersifat sebagai

solubilizer (membantu melarutkan). Pada konsentrasi rendah

DMSO tidak toksik, toksik jika digunakan sebagai pelarut pada

konsentrasi tinggi. Mekanisme dari DMSO itu sendiri yaitu

membunuh sel bakteri.

15. Standar DMSO sebagai pelarut yaitu……

Karena jika lebih dia bersifat toksik.

16. (CH3)2SO

17. Sifat-sifat DMSO

1. Pada konsentrasi tinggi bersifat toksik

2.Sebagai surfaktan atau penurun tegangan antar muka- surfaktan

berfungsi sebagai antibakteri.

18. 25% T : Karena ukuran bakteri yang kecil sehingga lebih banyak

yang terserap, sedangkan transmittan jamur ialah 75% T karena

ukuran jamur yang besar maka akan terserap sedikit.

19. suhu 370C untuk mencapai fase stasioner yaitu pertumbuhan

sempurna.

20. KHM= Konsentrasi hambat minimum yaitu untuk melihat

konsentrasi terendah, untuk menentukan larutan tetap jernih,

KBM = Konsentrasi Bunuh Minimum, yaitu konsentrasi terendah

dimana tidak terdapat pertumbuhan mikroba.

21. Digunakan ketokonazol karena merupakan senyawa turunan

imidazol, aktivitas antijamur dengan cara menimbulkan

ketidakteraturan membran sitoplasma jamur

22. Dilakukan pensuspensian NaCl agar sifat isotonis dari mikroba uji

terjaga.

Alasan NaCl fisiologis 0,9%: supaya tidak mengalami lisis, isotonik.

23. 9 Mikroba uji mewakili bakteri gram positif dan negatif, jamur

serta berdasarkan bakteri pathogenesis.

24. panjang gelombang 580nm, karena bisa terbaca ukuran bakteri dan

jamur.

25. 1 mg/ml, penggunaan konsentrasi tersebut karena menurut

Hoffman ekstrak dikatakan aktif jika pada konsentrasi 1 mg/ml

menunjukkan hambatan pertumbuhan mikroba, maka ekstrak

tersebut potensial untuk diteliti daya antimikroba.

26. Digunakan medium GNA Karena

1. medium ini merupakan medium yang umum digunakan untuk

menumbuhkan bakteri dan jamur.

2. Merupakan medium agar yang digunakan pada dilusi padat yang

berfungsi untuk menumbuhkan mikroba uji.

3. Bakteri dan jamur mudah tumbuh pada medium ini mengandung

glukosa sebagai sumber karbohidrat dan pepton sebagai sumber

protein.

Sedangkan medium GNB merupakan medium cair yang

digunakan pada pengujian KHM. Medium GNB ini juga berisi pepton

sebagai sumber protein dan glukosa sebagai sumber karbohidrat

yang dapat menunjang pertumbuhan bakteri dan jamur.

27. Alasan penggunaan metode bioautografi langsung

B. IDENTIFIKASI BAKTERI

1. Pemeriksaan Mikroskopis

a. Pemeriksaan Langsung

Pemeriksaan langsung digunakan untuk mengamati pergerakan, dan

pembelahan secara biner, mengamati bentuk dan ukuran sel yang alami,

yang pada saat mengalami fiksasi panas serta selama proses pewarnaan

mengakibatkan beberapa perubahan. Suatu teknik pengamatan mikroskop

yang baik adalah dengan membuat sediaan tetesan gantung, karena

bakteri yang diamati dalam keadaan utuh.

b. Pewarnaan

Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe,

berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem

pewarnaan yang digunakan.

a). Untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan

pewarnaan “acid-fast”(tahan asam) untuk genus Mycobacterium.

b). Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan

kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau

Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies)

pada Corynebacterium diphtheriae.

Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan

pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik

pewarnaan yang spesifik. Caranya tidak sulit tetapi membutuhkan kehati-

hatian dalam pembuatannya.

Tahap-tahap yang harus dilakukan secara hati-hati, adalah sebagai

berikut :

1) Menyiapkan kaca objek: menghapus lemak atau minyak untuk

membersihkan kaca dengan menggunakan air hangat atau serbuk

penggosok, selanjutnya

dengan suatu campuran air dan alkohol (alkohol 95%), kemudian kaca

dikeringkan dan disimpan di atas kertas saring sampai siap untuk

digunakan.

2) Pembuatan apusan: menghindari apusan yang tebal dan rapat adalah

penting secara mutlak. Suatu apusan yang baik merupakan selapis tipis.

Apusan dapat dibuat dari biakan kaldu cair atau medium biakan kaldu agar

dengan berbagai cara.

3) Dari biakan kaldu cair, pengambilan satu atau dua loop biakan sel dapat

langsung dipindahkan ke kaca objek dengan loop inokulasi steril dan

sebarkan secara merata kira-kira sebesar uang logam (kurang lebih f 1 – 2

cm).

4) Dari medium kaldu agar: mikroorganisme yang diambil dari medium

padat menghasilkan pertumbuhan yang tebal dan rapat, tidak dapat

langsung dipindahkan ke atas kaca objek. Pemindahan sel dari biakan

dilakukan dengan menggunakan jarum inokulasi steril. Hanya ujung jarum

yang menyentuh biakan, untuk mencegah pemindahan sel terlalu banyak.

Pengenceran dilakukan dengan memutar ujung jarum di atas tetesan air,

sampai kelihatan semitransparan.

Sebelum proses selanjutnya, apusan dibiarkan kering. Jangan ditiup,

biarkan kering di udara.

Proses pembuatan apusan bakteri biasanya dengan menggunakan

fiksasi panas, tanpa difiksasi apusan bakteri akan tercuci selama

memasuki prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dibutuhkan selama protein

bakteri mengalami koagulasi dan melekat di atas permukaan kaca objek.

Fiksasi panas dilakukan dengan melalukan secara cepat apusan kering,

sebanyak dua atau tiga kali di atas lidah api bunsen atau lampu spirtus.

Gambar 7.2 Teknik dasar pewarnaan sel bakteri untuk pengamatan

mikroskopik
Ulasan Mengenai KLT dan UV

 Prinsip Kromatografi Lapis Tipis

Pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip adsorbsi dan

partisi, yang ditentukan oleh fase diam (adsorben) dan fase gerak
(eluen), komponen kimia bergerak naik mengikuti fase gerak karena
daya serap adsorben terhadap komponen-komponen kimia tidak sama
sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang
berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya, hal inilah yang
menyebabkan terjadinya pemisahan.

Adsorpsi (penyerapan) merupakan suatu proses pemisahan

dimana komponen darisuatu fase fluida berpindah ke permukaan zat
padat yang menyerap (adsorben)

Absorpsi adalah proses penyerapan suatu zat oleh zat lain. Dalam
proses ini, zat yang diserap masuk ke bagian dalam zat penyerap.

Prinsip Penampakan Noda

a. Pada UV 254 nm

Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan

sampel akan tampak berwarna gelap.Penampakan noda pada
lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara
sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng.
Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang
dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang
tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih
 tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan
energi.

b. Pada UV 366 nm

Pada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng

akan berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm
adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan
gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda
tersebut. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi
cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron
yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang
lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil
melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada lampu UV
366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak
berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.

c. Pereaksi Semprot H2SO4 10%

Prinsip penampakan noda pereaksi semprot H2SO4 10% adalah

berdasarkan kemampuan asam sulfat yang bersifat reduktor dalam
merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia sehingga panjang
gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV
menjadi VIS) sehingga noda menjadi tampak oleh mata.

Mekanisme kerja H2SO4 !

Jawab:
- Karena adanya gugus auksokrom pada H2SO4 yang berikatan
dengan gugus kromofor pada noda dengan bantuan pemanasan akan
muncul noda.
 1. Bagaimana cara penentuan eluen?
Jawab:
-Penentuan eluen ditentukan dengan melihat kepolaran dari pada
sampel. Pelarut polar hanya dapat melarutkan zat yang bersifat polar ,
begitupun sebaliknya, Pelarut non polar hanya dapat melarutkan zat-
zat yang bersifat non polar. Jika di dalam sampel terdapat berbagai
macam tingkat kepolaran yang berbeda-beda. Maka eluen yang
dipakai sebaiknya dikombinasikan melalui berbagai perbandingan.

2. Pengertian silika Gel 60 F 254 ?

Jawab:

- G = Giphsatig, artinyadia mengandung pengikat. Biasanya kalsium sulfat.

F = Fluorosensi pada panjang gelombang 254.

28. Jelaskan Mekanisme kerja UV 254 !

Jawab:
- UV 254 mengidentifikasikan komponen kimia yang mengandung ikatan
rangkap terkonjugasi yang akan mengabsorbsi kuat sinar UV 254 nm
sehingga nampak pada bercak.

30. Jelaskan Mekanisme kerja UV 366 nm?

Jawab:

- Mengidentifikasikan komponen kimia yang mengandung gugus

kromofor yang lain yang akan memancarkan terang pada bercak dengan
latar yang gelap.
 33. Pada uji KLT, eluen yang digunakan harus di jenuhkan terlebih dahulu.
Kenpa harus dijenuhkan dan bagaimana mekanisme kejanya ?
Jawab:
- Eluen yang kita gunakan harus dijenuhkan terlebih dahulu,
bertujuan untuk menyeimbangkan tekanan udara yang berada
di dalam dan di luar camber, agar nantinya tidak
mempengaruhi proses adsorbsi pada lempeng. Mekanismenya,
eluen akan terserap oleh kertas saring, dan sedikit demi sedikit,
eluen akan naik mengikuti arah rambat dari kertas saring. Keadaan
jenuh didapatkan, ditandai dengan naiknya eluen ke atas dan
membasahi kertas saring sampai batas penutup camber.
34. Bagaimana mekanisme kerja, sehingga pada uji KLT dapat terjadi
flouresensi ?
Jawab:
- Penampakan noda di bawah sinar lampu UV disebabkan adanya
interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh
ausokrom yang terdapat pada noda tersebut. Gugus kromofor
adalah gugus atom yang dapat menyerap radiasi elektromagnetik
(sinar UV) dan mempunyai ikatan rangkap tak jenuh (terkonyugasi).
Flouresensi yang tampak tersebut merupak emisi cahaya yang
dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang
tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi tinggi.
Perbedaan energi emisi yang dipancarkan pada saat kembali ke
energi dasar inilah yang menyebankan perbedaan flouresensi
warna yang dihasilkan oleh tiap noda.
35. Hal-hal apa saja yang terjadi dan mengganggu KLT ?
Jawab:
a. Pembentukan ekor, terjadi akibat adanya pengendalian pH (di mana
asam di kromatografi dalam asam, begitu pula dengan basa),
kelebihan dalam penotolan dan perbandingan konsentrasinya.
b. Kejenuhan camber. Dalam hal ini, jika camber belum jenuh dan
sudah dilakukan pengelusian, maka akan menghasilkan noda yang
kurang baik.
36. Jelaskan definisi silica gel, kenapa harus pake silica gel dan
Komponen dari silica gel?
Jawab:
- Silika gel adalah suatu bentuk dari silica yang dihasilkan melalui
penggumpalan natrium silikat (NaSiO2). Sol mirip agar-agar ini
dapat didehidrasi sehingga berubah menjadi padatan.
Komponennya yaitu silica gel, selulosa dan juga air. Karena pada
permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si.
Permukaan gel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat
membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang
sesuai disekitarnya.
37. Sebutkan beberapa dari fase diam yang dapat digunakan pada Uji
KLT, apa komponennya serta kapan digunakan ?
Jawab:

Fase diam lainnya yang biasa digunakan yaitu;

- Alumina komponennya aluminium oksida. Biasanya digunakan

untuk mengidentifikasi asam amino, hidrokarbon, vitamin dan
alkaloid.
 - silica gel komponenya silica gel, selulosa dan air. Biasanya
digunakan untuk mengidentifikasi asam amino, nukleotida,
hidrokarbon, vitamin, alkaloid dan karbohidrat.
38. Sebutkan dan jelaskan faktor-faktor yg mempengaruhi nilai RF !
Jawab:

Faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Rf yaitu :

1). Suhu , yaitu suhu yang harus digunakan yaitu tetap, untuk
mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang
disebabkan oleh penguapan atau perubahan fase.
2). Pelarut, dimana pelarut disini menyangkut perbandingan dari eluen
yang digunakan
3). Sturuktur kimia dari senyawa yang diidentifikasi, dimana
komponen yang mudah larut dalam pelarut harga Rf-nya akan
mendekati satu sedangkan komponen yang kelarutannya rendah
akan mempunyai Rf hampir nol.
4). Kejenuhan dari chamber
5). Jumlah cuplikan yang digunakan , yaitu penetesan cuplikan dalam
jumlah yang berlebihan memberikan tendensi penyebaran noda-
noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tidak
keseimbangan lainnya yang mengakibatkan kesalahan pada harga
Rf
6). Konsentrasi sampel, semakin tinggi konsentrasi sampel, makin sulit
dibawa oleh eluen sehingga mempengaruhi nilai Rf
39. Mengapa pada hasil yang didapatkan pada lempeng KLT sering
didapatkan noda berekor dan jelaskan cara mengatasinya!
Jawab:
 - Terjadinya noda berekor pada lempeng KLT pada
pengujiannya, disebabkan karena adanya perbedaan pH antara
eluen dengan sampel (ekstrak yang digunakan). Dan hal ini
dapat diatasi dengan menyamakan pH antara eluen dengan
sampel. Dimana jika sampel bersifat basa, dapat ditambahkan
eluen yang juga bersifat basa sehingga dapat dicapai keadaan pH
yang sesuai dengan sampel yang digunakan, begitupun
sebaliknya. Sehingga dapat memberikan kenampakan noda yang
jelas.
40. Bagaimana cara menentukan perbandingan dan jenis eluen yang
digunakan dalam analisis KLT?
Jawab:
- Penentuan jenis eluen yang digunakan dapat dilakukan dengan
dua metode, yaitu metode coba-coba dan metode segitiga
sama sisi. Pada metode coba-coba, yaitu mencampurkan dua
pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat
diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara
optimum. Sedangkan metode segitiga sama sisi yaitu dengan
memperhatikan tiga aspek penting dalam analisis KLT yaitu
sampel, fase diam, dan fase gerak (eluen). Dengan
memperhatikan sifat dari tiga faktor di atas sehingga dapat
diketahui jenis eluen apa yang dapat digunakan.
41. Apa yang dimaksud dengan noda pada lempeng KLT dan bagaimana
mekanisme pembentukan noda!
Jawab:
- Noda pada lempeng menandakan zat yang terkandung dalam
sampel ekstrak yang digunakan, misalnya warna ungu
menandakan senyawa tanin ada dalam ekstrak.
 - Mekanisme pembentukan noda pada lempeng KLT adalah
karena adanya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor
yang terikat oleh gugus ausokrom yang terdapat pada noda
tersebut.
- Gugus kromofor adalah gugus atom yang dapat menyerap
radiasi elektromagnetik (sinar UV) dan mempunyai ikatan
rangkap tak tak jenuh (terkonjugasi). Sedangkan gugus
terkonjugasi adalah struktur molekul dengan ikatan rangkap tak
jenuh lebih dari satu yang berada berselang-seling dengan ikatan
tunggal. Flourosensi warna yang terpapar tersebut merupakan
emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut, ketika
elektron tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi tinggi.
Perbedaan energi emisi pada saat kembali ke energi dasar inilah
yang menyebabkan perbedaan flouresensi warna yang dihasilkan
oleh tiap noda pada lampu UV 254 nm dan 366 nm.
- Auksokrom merupakan gugus yang dapat meningkatkan daya
kerja khromofor sehingga optimal dalam pengikatan
42. Mengapa pada uji sinar tampak digunakan H2SO4 , berapa
konsentrasinya, dan mengapa digunakan pemanasan ?
Jawab:
- H2SO4 digunakan dengan menyemprotkannya pada lempeng KLT
dengan maksud agar noda yang ada pada lempeng KLT yang
belum terlihat dengan UV 254 nm dan 366 nm dapat terlihat oleh
mata, asam sulfat yang bersifat reduktor dalam merusak gugus
kromofor dan ausokrom dari zat aktif simplisia sehingga panjang
gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV
menjadi VIS) sehingga noda menjadi tampak oleh mata. Digunakan
konsentrasi 10 % dengan alasan karena dengan konsentrasi 10%
sudah dapat menampakkan noda ataupun merusak gugus
 kromofor dan ausokrom pada lempeng KLT, bilamana kurang dari
10%, maka noda tidak dapat tampak sementara jika lebih dari 10 %
maka ditakutkan konsentrasi tersebut dapat berbahaya bagi
keselamatan peneliti. Kemudian dipanaskan dengan tujuan
mempercepat reaksi ataupun mempercepat kerja dari H2SO4.
43. Jelaskan mengapa biasa ditemukan noda dengan warna yang sama
tetapi mempunyai nilai Rf yang berbeda ?
Jawab:
- Terjadinya kesamaan warna dari dua warna pada lempeng KLT
bukan berarti kedua warna tersebut adalah berasal dari dua
senyawa aktif yang sama. Contoh misalnya dari flavonoid dan
dioksiantrakinon memberi warna yang sama yaitu warna merah.
Pengidentifikasian senyawa aktif pada lempeng KLT salah satu
yang perlu diamati adalah nilai RF-nya, karena senyawa dengan
nilai Rf yang berbeda artinya mempunyai tingkat kepolaran yang
berbeda pula, sehingga kedua senyawa aktif dari lempeng
tersebut adalah berbeda.