BAB 1

PENDAHULUAN

a. Latar Belakang
M i k r o o rg a n i s m e y a n g i n g i n k i t a t u m b u h k a n , y a n g
p e r t a m a h a r u s d i l a k u k a n adalah memahami kebutuhan dasarnya
kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan
digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal
sebagaikomponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien
ke dalam sel
. Kebanyakan analisis meliputi pengambilan
cuplikan, pemisahan s e n y a w a pengganggu, isolasi
senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu
sebelumidentifikasi dan pengukuran serta teknik pemisahan yang
digunakan, namun kromatografi m e r u p a k a n teknik paling
banyak digunakan. Pemisahan menggunakan
t e k n i k kromatografi relatif murah dengan peralatan yang relatif
sederhana.

. Dalam mendeteksi campuran bakteri yang berupa bercak pada KLT

ada 2 metodeyang dipakai untuk mendeteksi bercak atau
komponen yang aktif sebagai anti bakteri. Kedua metode tersebut
adalah:
1.Deteksi mikrobiologi (bioautografi)
2. Deteksi senyawa kimia dengan reaksi warna spesifik.
Bioautografi merupakan metode yang spesifik untuk
mendeteksi bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis
tipis atau kromatografi kertas yang mempunyai aktivitas sebagai
antibakteri, antibiotic, anti fungi dan anti viral. Bioautografi juga
dapat juga digunakan untuk mendeteksi senyawa antibitik yang
belum diketahui yang manadengan pereaksi warna spesifik

1
 digunakan sebagai pembanding bioautografi sehingga kedua
metode tersebut saling melengkapi.
Biautografi digunakan bertujuan untuk mendeteksi bercak atau komponen
zat aktif sebagai antibakteri.
Ada 3 metode bioautografi yaitu:
1. Bioautografi langsung/direct adalah Mikroorganisme tumbuh secara
langsung di atas lempeng KLT.
2. Bioautografi kontak/contact adalah Senyawa dipindahkan dari
lempeng KLT ke medium.
3. Bioautografi pencelupan/overlay

b. Rumusan masalah
1. Apa defenisi dari biautografi
2. Jenis- jenis biautografi
3. Keuntungan dan kelemahan metode biautografi
4. Skema kerja dalam biautografi
c. Tujuan
1. Untuk mengetahui defenisi dari biautografi
2. Untuk mengetahui jenis-jenis biautografi
3. Untuk mengetahui keuntungan dan kelemahan dari metode biautografi
4. Untuk mengetahui skema atau cara kerja dalam biautografi

BAB II
PEMBAHASAN

A. Pengertian Bioautografi
Menurut Betina (1972) bioautografi adalah suatu metode pendeteksian
untuk menemukan suatu senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi

2
dengan cara melokalisir aktivitas antimikroba tersebut pada suatu
kromatogram. Metode ini memanfaatkan pengerjaan Kromatografi Lapis
Tipis (KLT). Pada bioautogafi ini didasarkan atas efek biologi berupa
antibakteri, antiprotozoa, antitumor dan lain-lain dari substansi yang diteliti.
Ciri khas dari prosedur bioautografi adalah didasarkan atas teknik difusi agar,
dimana senyawa antimikrobanya dipindahkan dari lapisan KLT ke medium
agar yang telah diinokulasikan dengan merata bakteri uji yang peka. Dari
hasil inkubasi pada suhu dan waktu tertentu akan terlihat zona hambatan di
sekeliling spot dari KLT yang telah ditempelkan pada media nagar. Zona
hambatan ditampakkan oleh aktivitas senyawa aktif yang terdapat di dalam
bahan yang diperiksa terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji. Biautografi
dapat dipertimbangkan karena paling efisien untuk mendetekski komponen
antimikroba, sebab dapat melokalisir aktivitas meskipun dalam senyawa aktif
tersebut terdapat dalam bentuk senyawa kompleks dan dapat pula diisolasi
langsung dari komponen yang aktif.
Metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram
hasil kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kertas yang mempunyai
aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, antibiotik dan antiviral disebut
bioautografi. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu kromatografi
yang berdasarkan proses adsorpsi. Fase diam dapat menggunakan silika atau
alumina yang dilapiskan pada lempeng kaca atau aluminium. Fasa bergerak
(fase mobil) atau larutan pengembang biasanya digunakan pelarut campuran
organik atau bisa juga campuran pelarut organik-anorganik 5.
Kebanyakan analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan
senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih
dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran serta teknik pemisahan yang
digunakan, namun kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan.
Pemisahan menggunakan teknik kromatografi relatif murah dengan peralatan
yang relatif sederhana 5.
Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorpsi dan
adsorben (silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oxide), kieselguhr

3
 (diatomeous earth), dan selulosa) bertindak sebagai fase stasioner. Dalam
kromatografi lapis tipis, bahan penyalut yang digunakan beraneka macam.
Silika gel yang paling banyak dipakai

B. Macam-macam Metode KLT Bioautografi

1. Bioautografi Langsung
Bioautografi langsung, yaitu dimana mikroorganismenya tumbuh
secara langsung di atas lempeng Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Prinsip
kerja dari metode ini adalah suspensi mikroorganisme uji yang peka dalam
medium cair disemprotkan pada permukaan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) yang telah dihilangkan sisa-sisa eluen yang menempel pada
lempeng kromatogram. Setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu dan
waktu tertentu. Pengeringan Kromatogram dilakukan secara hati-hati
dengan menggunakan hair dryer untuk menghiangkan sisa eluen. Senyawa
alam lempeng kromatogram dideteksi dengan menggunakan sinar UV
pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Setelah diketahui letak dan
jumlah senyawa aktif yang terpisah atau terisolasi, dengan timbulnya noda
(spot) pada lempeng KLT, selanjutnya disemprotkan suspense bakteri uji
sebanyak 5-6 ml di atas permukaan lempeng KLT tadi secara merata.
Besarnya lempeng KLT yang sering digunakan adalah 20x20 cm dan
untuk meratakan suspensi bakteri yang telah disemprotkan dapat
menggunakan alat putar atau roller yang dilapisi dengan kertas
kromatogram (Whatman, Clipton). Lempeng KLT diinkubasi semalam
(1x24 jam) dalam box plastik dan dilapisi dengan kertas, kemudian
disemprot dengan 5 ml larutan TTC (20 mg/ml) atau INT (5 mg/ml), INTB
(5 mg/ml) serta MTT (2,5 mg/ml) dan selanjutnya diinkubasi kembali
selama 4 jam pada suhu 370C.

2. Bioautografi Kontak
Bioautografi kontak, dimana senyawa antimikroba dipindahkan
dari lempeng KLT ke medium agar yang telah diinokulasikan bakteri uji

4
 yang peka secara merata dan melakukan kontak langsung. Metode ini
didasarkan atas difusi dari senyawa yang telah dipisahkan dengan
Kromatogafi Lapis Tipis (KLT) atau kromatografi kertas. Lempeng
kromatografi tersebut ditempatkan di atas permukaan Nutrien Agar yang
telah diinokulasikan dengan mikroorganisme yang sensitif terhadap
senyawa antimikroba yang dianalisis. Setelah 15-30 menit, lempeng
kromatografi tersebut dipindahkan dari permukaan medium. Senyawa
antimikroba yang telah berdifusi dari lempeng kromatogram ke dalam
media agar akan menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi
pada waktu dan suhu yang tepat sampai noda yang menghambat
pertumbuhan mikroorganisme uji tampak pada permukaan membentuk
zona yang jernih. Untuk memperjelas digunakan indicator aktivitas
dehidrogenase.

3. Bioautografi pencelupan
Bioautografi pencelupan, dimana medium agar telah
diinokulasikan dengan suspensi bakteri dituang di atas lempeng
Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pada prakteknya metode ini dilakukan
sebagai berikut yaitu bahwa lempeng kromatografi yang telah dielusi
diletakkan dalam cawan petri, sehingga permukaan tertutup oleh medium
agar yang berfungsi sebagai base layer. Setelah base layernya memadat,
dituangkan medium yang telah disuspensikan mikroba uji yang berfungsi
sebagai seed layer. Kemudian diinkubasi pada suhu dan waktu yang
sesuai.

C. Keuntungan dan Kerugian Metode KLT Bioautografi

Metode bioautografi dalam mendeteksi komponen yang aktif sebagai
antibakteri memiliki beberapa keuntungan dan kerugian :
Keuntungan :
 Dapat mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT yang mempunyai
aktivitas sebaga antibakteri, antifungi, antibiotik, dan antiviral.

5
  Dapat digunakan untuk mendeteksi antibiotik yang belum diketahui
mekanismenya.
 Merupakan metode yang sederhana dan mudah dilakukan.
 Cepat dalam pengerjaannya 4.
Kerugian:
 Tidak bisa digunakan untuk senyawa yang tidak mempunyai aktivitas
membunuh ataupun menghambat mikroorganisme.
 Hasil tidak valid karena kemungkinan adanya kontaminan dari luar atau
karena zat yang diidentifikasikan tidak mengandung khasiat bakteri
antibakteri.
 Mempunyai faktor kesalahan yang besar 4.
Metode kromatografi lapis tipis mempunyai beberapa keuntungan
yaitu diperoleh waktu yang lebih cepat dan hasil pemisahan yang baik. Waktu
rata-rata untuk kromatografi lapisan tipis dengan panjang silica sekitar 10 cm
adalah sekitar 20-30 menit (tergantung sifat dari fase gerak). Dalam
kromatografi lapisan tipis hanya membutuhkan penyerap dan cuplikan dalam
jumlah yang sedikit dan noda-noda yang dipisahkan dilokalisir pada plat
seperti pada lembarab kertas. Setelah pemisahan mudah diperoleh senyawa-
senyawa yang terpisah secara individu yaitu dengan cara mengeruknya dan
mengumpulkan tiap-tiap lapisan di mana lapisan itu diserap. Identifikasi dari
senyawa-senyawa yang diserap pada lapisn tipis lebih baik digunakan atau
dikerjakan dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna, tetapi lazimnya
untuk identifikasi menggunakan harga Rf yang didefinisikan sebagai berikut:
Harga Rf = Jarak yang ditempuh senyawa
Jarak yang ditempuh pelarut
Harga Rf dari senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga Rf standard.
Perlu diperhatikan bahwa harga Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk
campuran tertentu dari pelarut dan penyarap yang digunakan, meskipun
demikian daftar dari harga Rf untuk berbagai pelarut dan penyerap dapat
diperoleh 7.

D. Skema Kerja Metode KLT Bioautografi

6
 Medium (NA) sebanyak 10 ml

Inokulasi dengan bakteri sebanyak 0,5 ml

Masukan

lempeng KLT yang telah dielusi diletakkan diatas permukaan medium agar

Setelah 30 menit, lempeng tersebut dipindahkan

Diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam

Amati zona hambat

BAB III
PENUTUP

A. Kesimpulan
Beberapa prosedur yang dikemukakan di atas masing-masing
memiliki kelebihan dan kekurangan. Menurut Horman dan Fuchs,
bioautografi kontak merupakan tipe yang paling sering digunakan. Masalah

7
 perbedaan difusi dari senyawa-senyawa dari kromatogram ke plat agar
dipermudah dengan deteksi bioautografi secara langsung, tetapi metode ini
membutuhkan peralatan mikrobiologi yang cukup rumit. Sedangkan Land
dan Lyon, menyatakan bioautografi secara langsung, untuk aktivitas
antibakteri sangat sensitif dan melokalisir senyawa-senyawa yang aktif, tetapi
mempunyai kekurangan karena keterbatasan mikroorganisme yang dapat
tumbuh secara langsung diatas lapisan kromatografi. Ketersebaran bakteri
pada lempeng dan memungkinkan terjadi kontaminasi. Sedang metode
bioautografi pencelupan merupakan metode yang paling tepat sebab tidak
dipengaruhi oleh kemungkinan adanya kontaminasi. Tetapi metode
bioautografi kontak adalah yang paling umum digunakan karena mudah dan
sederhana dalam pengerjaannya.

DAFTAR PUSTAKA

Djide, M. N. 2003. Mikrobiologi Farmasi. Jurusan Farmasi UNHAS,

Makassar.

Djide, Natsir dan Sartini.\2008. Analisis Mikrobiologi Farmasi. Jurusan

Farmasi UNHAS, Makassar

8
 Mulyaningsih, S., 2004, Analisis Mikrobiologi, Farmasi FMIPA UII,
Yogyakarta

Sastrohamidjojo, 2002, Kromatografi, UGM-press, Yogyakarta