Ringkasan

TUGAS DASAR BIOTEKNOLOGI

Disusun Oleh:
Kelompok

Debby Pratiwi (1506103010054)

Barliana Utami (1506103010021)
Sri Devista (1506103010029)

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SYIAH KUALA
2018
1. Enterobacteria phage λ
1.1.Pengertian Enterobacteria phage λ ( lambda phage , coliphage λ )
adalah virus bakteri, atau bacteriophage , yang menginfeksi spesies
bakteri Escherichia coli ( E. coli ). Ditemukan oleh Esther Lederberg pada tahun
1950 ketika dia memperhatikan bahwa garis-garis campuran dari dua strain E. coli ,
salah satunya diperlakukan dengan sinar ultraviolet, " digigit dan dianyam ". Jenis
liar dari virus ini memiliki siklus hidup sedang yang memungkinkannya untuk
berada di dalam genom inangnya melalui lysogeny atau memasuki fase litik (di
mana ia membunuh dan melisiskan sel untuk menghasilkan keturunan); galur
mutan tidak mampu melisogenisasi sel - sebaliknya, mereka tumbuh dan memasuki
siklus litik setelah superinfeksi sel yang sudah terisogenisasi.
Partikel fag terdiri dari kepala (juga dikenal sebagai kapsid ), ekor, dan serat
ekor (lihat gambar virus di bawah). Kepala mengandung genom DNA double-
strand linear.Selama infeksi, partikel fag mengenali dan mengikat inangnya, E.
coli , menyebabkan DNA di kepala fag dikeluarkan melalui ekor ke dalam
sitoplasma sel bakteri. Biasanya, " siklus litik " terjadi, di mana DNA lambda
direplikasi dan partikel fag baru diproduksi di dalam sel. Ini diikuti oleh lisis sel,
melepaskan isi sel, termasuk virion yang telah berkumpul, ke lingkungan. Namun,
dalam kondisi tertentu, DNA fag dapat mengintegrasikan dirinya ke dalam
kromosom sel inang di jalur lisogenik . Dalam keadaan ini, DNA λ disebut
sebagai profag dan tetap tinggal di dalam genom inang tanpa membahayakan
host. Tuan rumah disebut lysogen ketika profag hadir. Profag ini dapat memasuki
siklus litik ketika lisogen memasuki kondisi stres.
1.2.Anatomi

Bacteriophage lambda virion

(skema).Nama protein dan nomor
salinannya dalam partikel virion
ditunjukkan. Kehadiran protein L dan M di
virion masih belum jelas.

Partikel virus terdiri dari kepala dan ekor yang dapat memiliki serat
ekor. Seluruh partikel terdiri dari 12-14 protein berbeda dengan lebih dari 1000
molekul protein total dan satu molekul DNA yang terletak di kepala fag. Namun,
masih belum sepenuhnya jelas apakah protein L dan M adalah bagian dari virion.
 Tata letak linier genom fag lambda dengan operon utama, daerah promotor, dan
gen pengkode capsid.

Genom berisi 48.490 pasangan basa dari DNA linier beruntai ganda, dengan
segmen beruntai tunggal 12-basis di kedua ujung 5 '. [5] Dua segmen beruntai tunggal
ini adalah "ujung lengket" dari apa yang disebut situs cos . Situs cos mengedarkan
DNA dalam sitoplasma inang. Oleh karena itu, dalam bentuknya yang bundar, genom
fag adalah 48.502 pasangan basa. [5] Genom lambda dapat dimasukkan ke dalam
kromosom E. coli dan kemudian disebut profag . Lihat bagian di bawah untuk
detailnya.

1.3.Daur hidup
Infeksi

Interaksi protein Lambda phage J dengan porin LamB

 Fag Lambda adalah fag berekor non-kontraktil, artinya selama kejadian infeksi
tidak dapat 'memaksa' DNA-nya melalui membran sel bakteri.Alih-alih itu harus
menggunakan jalur yang ada untuk menyerang sel inang, setelah berevolusi ujung
ekornya untuk berinteraksi dengan pori tertentu untuk memungkinkan masuknya DNA
ke host.

a. Bacteriophage Lambda berikatan dengan sel E. coli melalui protein J -nya di ujung
ekor. Protein J berinteraksi dengan porinmembran maltosa luar (produk dari gen lamB )
dari E. coli , molekul porin, yang merupakan bagian dari operon maltosa .
b. Genom fag linier disuntikkan melalui membran luar.
c. DNA melewati kompleks permease mannose di membran bagian dalam (7) (disandikan
oleh gen manXYZ) dan segera diedarkan menggunakan situs cos , kohesif kohesif 12-
basis yang kaya GC "ujung lengket". Ujung DNA virus untai tunggal diikat
oleh DNA host ligase .

Injeksi DNA fag Lambda ke membran sel menggunakan Mannose PTS

memungkinkan sistem pengangkutan gula sebagai mekanisme masuk ke dalam
sitoplasma.

a. Host DNA gyrase menempatkan supercoils negatif dalam kromosom sirkuler,

menyebabkan daerah kaya AT melepaskan dan mendorong transkripsi.
b. Transkripsi dimulai dari promotor P L , P R dan P 'konstitutif yang menghasilkan
transkrip' segera awal '.Pada awalnya, ini mengekspresikan gen N dan cro ,
menghasilkan N, Cro dan protein pendek yang tidak aktif.
 Peristiwa aktivasi awal yang melibatkan protein N

a. Cro mengikat OR3 , mencegah akses ke promotor P RM , mencegah ekspresi gen cI . N

mengikat ke dua situs Nut(pemanfaatan N), satu di gen N dalam bingkai membaca PL,
dan satu di gen cro dalam bingkai membaca P.
b. Protein N adalah antiterminator , dan berfungsi untuk memperpanjang bingkai
pembacaan yang terikat. Ketika RNA polimerase mentranskripsikan daerah ini, ia
merekrut N dan membentuk kompleks dengan beberapa protein inang Nus . Kompleks
ini melewati sebagian besar urutan terminasi. Transkrip yang diperluas (transkrip
'terlambat awal') mencakup gen Ndan cro bersama dengan gen cII dan cIII , dan
gen xis , int , O , P dan Q dibahas kemudian.
c. Protein cIII bertindak untuk melindungi protein cII dari proteolisis oleh FtsH(esensial
E. coli protease yang terikat membran) dengan bertindak sebagai inhibitor
kompetitif. Penghambatan ini dapat menginduksi keadaan bakteriostatik , yang
mendukung lysogeny. cIII juga secara langsung menstabilkan protein cII.

N antiterminasi

N Antiterminasi membutuhkan perakitan kompleks ribonukleoprotein besar

untuk secara efektif memperpanjang proses anti-terminasi, tanpa kompleks penuh RNA
polimerase hanya mampu mem-bypass hanya satu terminator.

Ini terjadi tanpa protein N berinteraksi dengan DNA; protein bukannya

mengikat mRNA yang baru ditranskripsi. Situs kacang mengandung 3 "kotak" yang
dikonservasi, dimana hanya BoxB yang penting.

- Urutan RNA boxB terletak dekat dengan ujung 5 'dari transkrip pL dan pR. Saat
ditranskripsi, setiap urutan membentuk struktur loop jepit rambut yang dapat diikat
oleh protein N.
- Protein N berikatan dengan boxB di setiap transkrip, dan menghubungi transkrip
RNA polimerase melalui perulangan RNA. Kompleks N-RNAP distabilkan
dengan pengikatan beberapa protein host (substansi pemanfaatan N) inang
berikutnya (yang meliputi faktor terminasi / antiterminasi transkripsi dan, anehnya,
subunit ribosom).
- Seluruh kompleks (termasuk situs Nut terikat pada mRNA) melanjutkan
transkripsi, dan dapat melewati urutan penghentian.

1.4.Siklus hidup litik

Ini adalah siklus hidup yang diikuti oleh fag setelah sebagian besar infeksi,
di mana protein cII tidak mencapai konsentrasi yang cukup tinggi karena degradasi,
sehingga tidak mengaktifkan promotornya.

- Transkrip 'terlambat awal' terus ditulis, termasuk xis , int , Q dan gen untuk
replikasi genome lambda ( OP ). Cro mendominasi situs represor (lihat bagian
"Represor" ), menekan sintesis dari promotor P RM (yang merupakan promotor
siklus lisogenik).
- Protein O dan P memulai replikasi kromosom fag (lihat "Replikasi Lytic").
- Q , antiterminator lain, mengikat ke situs Qut .
- Transkripsi dari promotor PR sekarang dapat diperluas untuk menghasilkan mRNA
untuk lisis dan protein kepala dan ekor.
- Protein struktural dan genom fag merakit diri menjadi partikel fag baru.
- Produk dari gen lisis S , R , Rz dan Rz1 menyebabkan lisis sel. S adalah holin ,
protein membran kecil yang, pada suatu waktu ditentukan oleh urutan protein, tiba-
tiba membuat lubang di membran. R adalah endolysin , enzim yang lolos melalui
lubang S dan membelah dinding sel. Rz dan Rz1 adalah protein membran yang
membentuk kompleks yang entah bagaimana menghancurkan membran luar,
setelah endolysin merusak dinding sel. Untuk lambda tipe liar, lisis terjadi sekitar
50 menit setelah dimulainya infeksi dan melepaskan sekitar 100 virion.

Transkripsi kanan
Transkripsi sebelah kanan mengekspresikan gen O , P dan Q. O dan P
bertanggung jawab untuk memulai replikasi, dan Q adalah antiterminator lain yang
memungkinkan ekspresi gen kepala, ekor, dan lisis dari PR.

Replikasi litik
- Untuk beberapa siklus replikasi pertama, genom lambda
mengalami replikasi ((lingkaran-ke-lingkaran).
- Ini dimulai pada situs ori yang terletak di gen O. Protein O mengikat situs ori , dan
protein P mengikat subunit DnaB dari mesin replikasi inang serta mengikat O. Ini
secara efektif memerintahkan DNA polimerase host.
- Segera, fag beralih ke replikasi lingkaran bergulir mirip dengan yang digunakan
oleh fag M13. DNA itu sobek dan ujung 3 'berfungsi sebagai primer. Perhatikan
bahwa ini tidak merilis salinan tunggal genom fag tetapi lebih dari satu molekul
panjang dengan banyak salinan genom: seorang juru bicara .
- Konser ini dibelah di situs cos mereka karena mereka dikemas. Pengemasan tidak
dapat terjadi dari DNA fag melingkar, hanya dari DNA concatomeric.

Q antiterminasi
 Transkripsi ke kiri

Transkripsi kiri mengekspresikan gen gam , merah , xis , dan int . Gam
dan protein merah terlibat dalam rekombinasi.
xis dan int regulasi penyisipan dan eksisi

- xis dan int ditemukan pada potongan mRNA yang sama, sehingga dihasilkan
konsentrasi protein xis dan int yangkurang lebih sama. Ini menghasilkan (awalnya)
dalam eksisi genom yang disisipkan dari genom inang.
- MRNA dari promotor L membentuk struktur sekunder yang stabil dengan loop-
batang di bagian sib dari mRNA. Ini menargetkan 3 '( sib ) akhir mRNA untuk
degradasi RNAaseIII, yang menghasilkan konsentrasi efektif int mRNA yang
lebih rendah daripada xis mRNA (karena int cistron lebih dekat ke
urutan sib daripada cistron xis ke urutan sib ) , sehingga konsentrasi xis yang lebih
tinggi dari int diamati.
- Konsentrasi xis yang lebih tinggi daripada int tidakmenghasilkan penyisipan atau
eksisi genom fag, tindakan yang disukai secara evolusioner - meninggalkan genom
fag pra-instertasi yang dimasukkan (sehingga mengurangi kompetisi) dan
mencegah penyisipan genom fag ke dalam genom inang yang terkutuk.

1.5.Daur hidup lisogenik (atau lisenogenik)

Siklus lisogenik dimulai setelah protein cI mencapai konsentrasi yang cukup
tinggi untuk mengaktifkan promotornya, setelah sejumlah kecil infeksi.

- Transkrip 'terlambat awal' terus ditulis, termasuk xis , int , Q dan gen untuk
replikasi genom lambda.
- CII yang distabilkan bertindak untuk mempromosikan transkripsi
dari P RE , P I dan P antiq promotor.
- Promotor antiq menghasilkan mRNA antisense pada pesan gen Q dari transkrip
promotor RR , sehingga mematikan produksi Q. Promotor P RE menghasilkan
mRNA antisense ke bagian cro dari transkrip promotor P , menolak produksi cro,
dan memiliki transkrip gen cI . Ini dinyatakan, menyalakan produksi represor
cI. Promotor P I mengekspresikan gen int , menghasilkan protein Int konsentrasi
tinggi. Protein int ini mengintegrasikan DNA fag ke dalam kromosom inang (lihat
"Integrasi Profil").
- Tidak ada Q yang menghasilkan perpanjangan kerangka baca promotor PR, jadi
tidak ada protein litik atau struktural yang dibuat. Peningkatan kadar int (jauh lebih
tinggi dari xis) menghasilkan penyisipan genome lambda ke dalam genome host
(lihat diagram). Produksi cI mengarah pada pengikatan cI ke situs OR1 dan OR2 di
promotor PR , mematikan cro dan ekspresi gen awal lainnya. cI juga mengikat
promotor P L , mematikan transkripsi di sana juga.
- Kurangnya cro membuat situs OR3 tidak terikat, sehingga transkripsi dari
promotor P RM dapat terjadi, mempertahankan level cI.
- Kurangnya transkripsi dari promotor P L dan P R menyebabkan tidak ada lagi
produksi cII dan cIII.
- Ketika konsentrasi cII dan cIII berkurang, transkripsi
dari P antiq , P RE dan P I berhenti dipromosikan karena tidak diperlukan lagi.
- Hanya promotor P RM dan P R yang dibiarkan aktif, yang pertama memproduksi
protein cI dan yang terakhir merupakan transkrip pendek tidak aktif. Genom tetap
dimasukkan ke dalam genom inang dalam keadaan tidak aktif.

1.6.Induksi
Keadaan transkripsi dari daerah
promotor P RM dan P R selama keadaan
lisogenik vs keadaan litik awal yang
diinduksi
Induksi klasik dari lysogen melibatkan penyinaran sel yang terinfeksi dengan
sinar UV.Setiap situasi di mana lysogen mengalami kerusakan DNA atau respons
SOS dari inang sebaliknya distimulasi mengarah pada induksi.
- Sel inang, yang mengandung genom fag aktif, mengalami kerusakan DNA karena
lingkungan stres tinggi, dan mulai menjalani respons SOS .
 - RecA (protein seluler) mendeteksi kerusakan DNA dan menjadi
diaktifkan.Sekarang adalah RecA *, co-protease yang sangat spesifik.
- Biasanya RecA * mengikat LexA (penekan transkripsi ), mengaktifkan aktivitas
auto-protease LexA, yang menghancurkan penekan LexA, memungkinkan
produksi protein perbaikan DNA . Dalam sel lisogenik, respons ini dibajak, dan
RecA * merangsang autocleavage cI. Ini karena cI meniru struktur LexA di situs
autocleavage.
- CI yang terpecah tidak dapat lagi dimerise, dan kehilangan afinitasnya terhadap
pengikatan DNA.
- Promotor P R dan P L tidak lagi ditekan dan diaktifkan, dan sel kembali ke urutan
litik peristiwa ekspresi (perhatikan bahwa cII tidak stabil dalam sel yang menjalani
respons SOS). Namun ada satu perbedaan penting.

1.7.Lambda sebagai alat genetik

Fag Lambda telah banyak digunakan sebagai model organisme , dan telah
menjadi sumber yang kaya untuk alat yang berguna dalam genetika mikroba , dan
kemudian dalam genetika molekuler . Penggunaannya termasuk penerapannya sebagai
vektor untuk kloning DNA rekombinan ; penggunaan rekombinase (int) khusus lokasi
untuk pengocokan DNA yang dikloning dengan metode gateway ; dan
penerapan operon Merahnya , termasuk protein Red alpha (juga disebut 'exo'), beta dan
gamma dalam metode rekayasa DNA yang disebut rekombinasi . Fragmen DNA
lambda fag 48 kb tidak penting untuk infeksi produktif dan dapat digantikan oleh DNA
asing. Lambda fage akan memasuki bakteri lebih mudah daripada plasmid sehingga
menjadi vektor yang berguna yang dapat menghancurkan atau menjadi bagian dari
DNA inang. Lambda fage dapat dimanipulasi dan digunakan sebagai vaksin anti-
kanker, nanopartikel, menargetkan aspartil manusia (asparaginil) β-hidroksilase
(HAAH). [21] Fag Lambda juga sangat penting dalam studi transduksi khusus .

2. Cosmid Vektor
2.1. Pengertian Cosmid Vektor
Kosmid adalah jenis plasmid hibrida yang mengandung urutan cos fag
Lambda . Kosmid (situs cos + plasmid = kosmid) Urutan DNA berasal dari fag
lambda . Mereka sering digunakan sebagai vektor kloning dalam rekayasa
genetika . Kosmid dapat digunakan untuk membangun perpustakaan
genom . Mereka pertama kali dijelaskan oleh Collins dan Hohn pada tahun 1978.
Kosmid dapat mengandung 37 hingga 52 (biasanya 45) kb DNA, batas berdasarkan
ukuran kemasan bakteriofag normal.Mereka dapat bereplikasi sebagai plasmid jika
mereka memiliki asal replikasi (ori) yang cocok: misalnya SV40 ori dalam sel
mamalia, ColE1 ori untuk replikasi DNA untai ganda, atau f1 ori untuk replikasi
DNA untai tunggal pada prokariota . Mereka sering juga mengandung gen untuk
seleksi seperti resistensi antibiotik , sehingga sel-sel yang ditransformasikan dapat
diidentifikasi dengan melapisi pada media yang mengandung antibiotik. Sel-sel
yang tidak mengambil kosmid tidak akan bisa tumbuh.
Tidak seperti plasmid, mereka juga dapat dikemas dalam kapsul fag , yang
memungkinkan gen asing ditransfer ke dalam atau di antara sel
dengan transduksi . Plasmid menjadi tidak stabil setelah sejumlah DNA
dimasukkan ke dalamnya, karena ukurannya yang meningkat lebih kondusif
untuk rekombinasi . Untuk menghindari ini, transduksi fag digunakan sebagai
gantinya. Ini dimungkinkan oleh ujung yang kohesif , juga dikenal sebagai
 situs cos . Dengan cara ini, mereka mirip dengan menggunakan fag lambda sebagai
vektor, kecuali semua gen lambda telah dihapus dengan pengecualian dari
urutan cos .
2.2. Urutan cos
Urutan cos panjang ~ 200 pasangan basa dan penting untuk
kemasan. Mereka mengandung situs cosN di mana DNA direkatkan pada setiap
untai, terpisah 12 bp, oleh terminase . Hal ini menyebabkan linierisasi kosmid
sirkular dengan dua "kohesif" atau "ujung lengket" sebesar 12bp. (DNA harus linier
agar sesuai dengan kepala fag.) Situs cosB memegang terminase saat sedang
memotong dan memisahkan untaian. Situs cosQ dari cosmid berikutnya
(karena replikasi lingkaran bergulir sering menghasilkan concatemers linier)
dipegang oleh terminase setelah cosmid sebelumnya telah dikemas, untuk
mencegah degradasi oleh DNase seluler.
2.3. Fitur dan penggunaan cosmid

Skema kloning DNA dalam vektor kosmid.

Kosmid sebagian besar adalah plasmid dengan oriVbakteri, penanda seleksi

antibiotik dan situs kloning, tetapi mereka membawa satu, atau lebih baru dua, situs cos
yang berasal dari bacteriophage lambda. Bergantung pada tujuan khusus percobaan
kosmid rentang inang luas, kosmid ulang-alik atau kosmid 'mamalia' (terkait dengan
SV40 oriV dan spidol seleksi mamalia) tersedia.Kapasitas pemuatan kosmid bervariasi
tergantung pada ukuran vektor itu sendiri tetapi biasanya terletak sekitar 40-45
kb. Prosedur kloning melibatkan generasi dua lengan vektor yang kemudian bergabung
dengan DNA asing. Seleksi terhadap DNA kosmid tipe liar hanya dilakukan melalui
pengecualian ukuran. Karena itu, cosmid selalu membentuk koloni dan bukan
plak.Densitas klon juga jauh lebih rendah dengan sekitar 10 5 - 10 6 CFU per µg DNA
yang diikat.
Setelah konstruksi lambda rekombinan atau pustaka kosmid, total DNA
ditransfer ke host E. coli yang tepat melalui teknik yang disebut kemasan in
vitro. Ekstrak kemasan yang diperlukan berasal dari lysogen E. coli cI857 (red-gam-
Sam dan Dam (perakitan kepala) dan Eam (perakitan ekor) masing-masing). Ekstrak
ini akan mengenali dan mengemas molekul rekombinan secara in vitro , menghasilkan
partikel fag matang (vektor berbasis lambda) atau plasmid rekombinan yang
terkandung dalam cangkang fag (kosmid). Perbedaan-perbedaan ini tercermin dalam
frekuensi infeksi yang berbeda yang terlihat mendukung vektor pengganti lambda. Ini
mengimbangi kapasitas muat yang sedikit lebih rendah. Pustaka phage juga disimpan
dan disaring lebih mudah daripada pustaka kosmid.
DNA target: DNA genom yang akan dikloning harus dipotong ke dalam kisaran
ukuran yang sesuai dari fragmen restriksi. Ini biasanya dilakukan dengan pembatasan
parsial diikuti oleh fraksinasi ukuran atau defosforilasi (menggunakan calf-intestine
phosphatase) untuk menghindari pengacakan kromosom, yaitu ligasi fragmen yang
tidak terhubung secara fisik.
2.4.sifat-sifat vektor kosmid
1. ini digabungkan bersama untuk mendapatkan vektor kosmid sekitar 200 bp
urutan lambda dikloning ke vektor kosmid
2. vektor kosmid dapat memiliki satu atau dua situs cos
3. vektor kosmid digunakan dalam pembangunan perpustakaan genom
4. vektor cosmid memiliki kapasitas kloning hingga 45 kbp

2.5.Manfaat cosmid
1. Memperkecil jumlah klon pustaka DNA yang harus dibuat
2. Memudahkan penyimpanan
3. Mempercepat proses seleksi transformant target
 3. Yeast Artificial Chromosomes
3.1. Pengertian
Kromosom buatan ragi (YAC) adalah vektor shuttle plasmid mampu mereplikasi dan dipilih
secara umum host bakteri seperti Escherichia coli, serta dalam ragi pemula Saccharomyces
cerevisiae. Mereka dari ukurannya relatif kecil (sekitar 12 kb) dan berbentuk lingkaran
terbentuk ketika mereka diperkuat atau dimanipulasi dalam E. coli, tetapi diberikan linear dan
ukurannya sangat besar, yaitu beberapa ratusan kilobase (kb), saat diperkenalkan sebagai
kloning vektor dalam ragi.

3.2. Mekanisme
YAC vektor memungkinkan kloning, dalam sel-sel ragi, fragmen DNA genom yang
memiliki panjang sekitar 500.000 pb. Vektor ini berisi beberapa elemen kromosom ragi khas,
maka YAC panjang. Vektor YAC mengandung sentromer ragi (CEN), telomeres ragi (TEL),
telomer adalah urutan tertentu yang hadir pada ujung kromosom dan yang diperlukan untuk
replikasi) dan ragi mandiri mereplikasi urutan (ARS) (Gaspar, HB. Dan Kinnon, C. 1991).
ARSes Ragi pada dasarnya asal-usul yang berfungsi dalam replikasi sel-sel ragi mandiri dari
replikasi asal replikasi kromosom ragi. vektor YAC juga mengandung gen, (URA3 misalnya,
sebuah gen yang terlibat dalam sintesis urasil) yang memungkinkan pemilihan sel ragi yang
telah diambil vektor. Dalam rangka untuk menyebarkan vektor dalam sel bakteri, sebelum
penyisipan DNA genom, vektor YAC mengandung asal replikasi bakteri dan penanda dipilih
bakteri seperti fro gen resistensi ampisilin (Gaspar, HB. Dan Kinnon, C. 1991). Dalam kloning
DNA genomik dalam vektor YAC khas, DNA genom sebagian dicerna dengan EcoRI dan
fragmen dalam kisaran 400-500 pasang kilobase (kbp) yang dimurnikan dengan gel
elektroforesis lapangan berdenyut, PFGE. Vektor YAC dicerna dengan EcoRI dan BamHI
yang menempatkan urutan telomer pada ujung vektor linierisasi. Fragmen BamHI kecil
dipisahkan dari sisa vektor YAC dengan elektroforesis gel standar. DNA genomik kemudian
diligasi ke vektor dan kemudian digunakan untuk mentransformasi sel-sel ragi (Mizuguchi, H
dan Kay, M.A. 1998).
 3.3. Kelebihan dan Kekurangan
YAC memiliki sekuen DNA yang mendasari komponen kromosom yang dihubungkan satu
sama lain dengan selectable markers dan daerah inisiasi serta daerah restriksi tempat DNA baru
disisipkan (Gambar 3). Seluruh komponen ini dapat dimasukan pada molekul DNA yang
berukuran 10-15 kb. Yeast alami memiliki kromosom pada kisaran 230 kb hingga 1700 kb.
Jadi YAC sangat berpotensi untuk mengklon fragmen DNA berukuran 600 kb, bahkan YAC
khusus dapat mengklon hingga ukuran 1400 kb. Saat ini YAC merupakan vektor yang memiliki
kapasitas terbesar dan beberapa proyek genom dapat dicapai dengan menggunakan YAC.
Sayangnya beberapa tipe YAC memiliki kelemahan dalam kestabilan penyisipan, klon DNA
jadi diurutkan lagi menjadi kombinasi sekuen DNA baru. Hal ini adalah alasan untuk
memusatkan perhatian pada tipe vektor lain. Vektor tersebut diantaranya:
– Vektor Bacteriophage P1 , hampir sama dengan vektor λ. Kapasitas vektor cloning
diurutkan berdasarkan ukuran delesi dan jarak dianatar partikel phage. Genom p1 lebih besar
dari genom λ dan partikel phage lebih besar. Jadi vektor P1 dapat mengklon lebih besar dari
fragmen DNA, vektor λ hingga 125 kb dengan menggunakan teknologi terkini.

– Bacterial Artificial Chromosomes (BACs), berdasarkan pada plasmid F dari E.coli.

Plasmid F relatif besar dan vektornya memiliki kapasitas lebih besar untuk disisipi DNA. BACs
dapat digunakan untuk mengklon fragmen DNA dari 300 kb atau lebih.

– P1-derived Artificial Chromosomes (PACs )b merupakan kombinasi antara P1 dan

BACs dengan memiliki kapasitas hingga 800 kb.

– Fosmid, mengandung ORI F plasmid dan λ cos site. Hampir sama dengan cosmid tetapi
memiliki salinan yang lebih sedikit pada E.coli, yang berarti lebih sedikit masalahnya dalam
ketidakstabilan penyisipan.

a. Vector cloning pYAC3

b. Mengklon dengan pYAC3, lingkaran vector harus dipotong dengan BamHI dan SnaBI.
BamHI memotong fragmen diantara 2 telomer pada lingkaran molekul. SnaBI memotong
sampai gen SUP4 dan menyediakan tempat untuk disisipi oelh DNA baru.

4. PACS dan BACS

PACS (P1-derivat Artificial Chromosomes) merupakan sistem koloning untuk isolasi

DNA genomik berdasarkan elemen dari klon bakteriofag F-factro plasmi. Mengandung
beberapa elemen dari klon bakteriofag P1 (recombination or packaging site). Dapat membawa
sekuens insersi hingga beratus Kapasitas 100-300 kbp, Berperan dalam perkembangbiakan
didalam sel E.coli. Vektor P1 berisi situs pengemasan (pac) yang diperlukan untuk pengemasan
in vitro molekul rekombinan menjadi partikel fag Vektor berisi dua situs loxP. Ini adalah situs-
situs yang dikenali oleh fage recombinase, produk dari gen creage phage, dan yang mengarah
pada sirkulasi DNA yang dikemas setelah disuntikkan ke dalam inang E. coli yang
mengekspresikan rekombinasi
Klon dipertahankan dalam E. coli sebagai plasmid dengan jumlah salinan rendah
dengan seleksi untuk vektor kanamycin-resistant marker s. Jumlah salinan yang tinggi dapat
diinduksi oleh eksploitasi P1 lytic replicon Sistem P1 ini memiliki telah digunakan untuk
membangun perpustakaan genomik tikus, huian, ragi fisi, dan Drosophil.
BACS (Bakterial Artificial Chromosomes). Sistem kloning untuk isolasi DNA
berdasarkan F-faktor plasmid dengan jumlah kopian rendah. Dapat diklon seperti plasmid
dalam sel bakteri dan dapat membawa sekuens insersi beberapa ratus kbp (300kbp). Lebih
sedikit mengandung khimera dan efesiensi transformasi 100x dibanding YAC. Bakteri
kromosom buatan (BAC) adalah konstruksi DNA, berdasarkan pada kesuburan fungsional
plasmid (atau F-plasmid), digunakan untuk mengubah dan mengkloning pada bakteri, biasanya
E. coli.
BAC sering digunakan untuk mengurutkan genom organisme dalam proyek genom,
misalnya Proyek Genom Manusia. Sepotong pendek DNA organisme diamplifikasi sebagai
sisipan dalam BAC, dan kemudian diurutkan. Akhirnya, bagian-bagian berurutan disusun
kembali dalam silico, menghasilkan urutan genom organisme. BAC digantikan dengan metode
sekuensing yang lebih cepat dan kurang melelahkan seperti sekuensing senapan genome
keseluruhan dan sekarang baru-baru ini sekuensing gen berikutnya.
Vektor Bakteri kromosom buatan (BAC) vektor dan P1-diturunkanbuatan
kromosom(PAC) vektor banyak digunakan untuk analisis struktural dan fungsional DNA
genom in vitro dan in vivo. Vektor dapat menyimpan fragmen hingga 300 kb dalam ukuran
dan menunjukkan stabilitas tinggi bahkan dengan pengulangan berulang alphoid. Untuk
analisis struktural, mereka memiliki keuntungan besar karena stabilitas dan chimerism rendah
dibandingkan dengan ragi krom buatan (YAC). Untuk analisis fungsional dalam sel mamalia,
BAC dan PAC sering perlu dimodifikasi untuk pemilihan dan pemantauan DNA dalam sel.
Ada beberapa vektor BAC halus yang tersedia untuk penggunaan mamalia, tetapi, untuk
menggunakannya, sisipan BAC dan PAC besar yang diisolasi dari perpustakaan utama harus
direklon ulang ke dalam vektor ini atau klon baru harus diisolasi dengan menyaring
perpustakaan baru.
Komponen gen yang umum pada BACS ialah
- Repe = untuk replikasi plasmid dan pengaturan nomor salinan.
- par dan parB = untuk mempartisi DNA plasmid F ke sel anak selama pembelahan dan
memastikan pemeliharaan BAC yang stabil.
- Marker yang dapat dipilih = untuk resistensi antibiotik; beberapa BAC juga memiliki
lacZ di situs kloning untuk seleksi biru / putih.
- T7 & Sp6 = promotor fag untuk transkripsi gen yang disisipkan.

Keunggulannya yaitu dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA dengan ukuran
sangat besar (100 – 2,000 kbp), penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa
nukleotida total genom. Kelemahannya yaitu tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan
ukuran sangat besar.
5. Retrovial Vektor
Vektor Retroviral digunakan untuk memperkenalkan gen baru atau diubah ke dalam
genom sel manusia dan hewan. • Retrovirus adalah virus RNA. • RNA virus diubah menjadi
DNA oleh reverse transcriptase virus dan kemudian diintegrasikan secara efisien ke dalam
genom inang • Gen asing atau bermutasi dimasukan ke dalam genom retroviral.
Virion Retrovirus berupa partikel sferis, dengan diameter antara 80-100 nm. Stuktur
virion dilapisi dengan lipid bilayer yang berasal dari membran plasma sel inang yang disisipi
oleh gen retroviral dan menghasilkan produk gen berupa protein selubung. Retrovirus
merupakan kelas virus berselubung dan genomnya berupa molekul RNA untai tunggal. Selama
infeksi, genom viral Retrovirus melangsungkan reverse transkripsi membentuk DNA untai
ganda., yang berintegrasi dengan genom inang dan diekspresikan sebagai protein viral.
DAFTAR PUSTAKA

https://en.m.wikipedia.org/wiki/Lambda_phage

https://en.m.wikipedia.org/wiki/Cosmid

https://www.slideshare.net/mobile/thea_thezhe/vektor-13421459

Burschi, V. Carlo. (2002). Yeast Artificial Chromosomes. ENCYCLOPEDIA OF LIFE

SCIENCES. Italy: Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group.

Chrast, R., HS Scott, dan SE An-tonarakis. 1999. Linearisasi dan pemurnian DNA BAC untuk
pengembangan tikus transgenik. ResTransgenik. 8: 147-150.

Mizuguchi, H dan Kay, M.A. 1998. Efficient Construction of Recombinant Adenovirus vector
by an improved in vitro ligation method. Tokyo: Mary Ann Liebert, Inc.