Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau high performance liquid

chromatography (HPLC) merupakan teknik pemisahan yang umum digunakan untuk

analisis bahan farmasetika serta berbagai cairan biologis. KCKT dapat digunakan untuk
analisis kualitatif maupun kuantitatif.1
KCKT merupakan suatu jenis kromatografi kolom. Sampel yang akan diuji dipompa
melalui kolom sehingga mengalami pemisahan senyawa-senyawa di dalamnya. Jika
kekuatan interaksi setiap senyawa berbeda maka berbagai senyawa tersebut akan terpisah
dan menghasilkan puncak tersendiri.2 Data hasil pemisahan kromatografi ini ditangkap oleh
suatu detektor yang terletak pada ujung kolom. Hasil yang diperoleh berbentuk suatu
kromatogram yang terdiri atas beberapa puncak untuk berbagai senyawa yang terpisah
terhadap waktu uji (Gambar 1).1

Gambar 1. Kromatogram

Pemisahan senyawa dalam KCKT

dipengaruhi oleh distribusi senyawa dalam fasa
gerak dan fasa diam. Penggunaan
kromatografi secara tepat perlu mempertimbangkan berbagai kondisi operasional seperti
jenis kolom, suhu kolom, panjang dan diameter kolom, fasa gerak, kecepatan alir fasa gerak,
dan ukuran sampel.3
Berdasarkan cara separasinya, KCKT dapat dibagi menjadi fasa normal (normal
phase HPLC) dan fasa terbalik (reverse phase HPLC). Pada KCKT fasa normal, fasa diam
yang terbuat dari silika (bersifat polar) dielusikan dengan pelarut non-polar sebagai fasa
geraknya. Sedangkan pada KCKT fasa terbalik, fasa diam terbuat dari bahan non-polar
(biasanya silika yang dilapisi oleh karbon C18 yang bersifat non-polar) dielusikan dengan
pelarut yang bersifat polar misalnya asetonitril, metanol, asam trifluoroasetat atau campuran
bahan-bahan tersebut dengan air.4

1. Instrumentasi
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas: wadah fasa gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fasa
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam (Gambar 2).2,4
 a. Wadah Fasa gerak. Alat KCKT modern dilengkapi dengan dengan satu
atau lebih wadah gelas yang berukuran 500mL atau lebih berisi fasa gerak. Wadah fasa gerak
harus bersih dan tidak bereaksi terhadap bahan lain. Proses penghilangan gas (degassing)
biasanya dilakukan terlebih dahulu pada fasa gerak untuk menghilangkan gas yang mungkin
terdapat di dalamnya karena dapat mengganggu fungsi detektor.
Fasa gerak sebaiknya menggunakan pelarut buffer, atau reagen dengan kemurnian
yang sangat tinggi. Kontaminan dalam reagen dapat menyebabkan terkumpulnya partikel
kecil dalam kolom atau tabung sehingga dapat mengakibatkan kekosongan pada kolom atau
tabung. Oleh karena itu, fasa gerak harus disaring terlebih dahulu sebelum digunakan.3

Gambar .
Diagram
sistem KCKT. (a)
wadah fasa gerak;
(b) pompa; (c)

autosampler atau injector; (d) kolom; (e) detektor; (f) sistem pendataan

b. Fasa gerak pada KCKT. Fasa gerak atau eluen biasanya merupakan campuran
pelarut yang berpengaruh pada daya elusi dan resolusi kromatogram. Terdapat dua jenis
proses elusi yaitu elusi isokratik dan gradien. Selama proses elusi isokratik, komposisi fasa
gerak konstan, sedangkan pada proses elusi gradien komposisi fasa gerak dapat diubah-
ubah. Pada KCKT fasa normal, pelarut non-polar digunakan sebagai fasa gerak, seperti
campuran 2-propanol dalam heksana. Sedangkan pada KCKT fasa terbalik, fasa gerak
menggunakan pelarut polar misalnya asetonitril, metanol atau asam trifluoroasetat.
Campuran larutan polar dengan air juga dapat digunakan sebagai fasa gerak pada KCKT
fasa terbalik.2
Konsentrasi larutan dalam fasa gerak merupakan faktor penting yang mempengaruhi
retensi bahan yang akan diperiksa dalam sistem KCKT. Pertimbangan dalam memilih fasa
gerak meliputi kompatibilitas antar pelarut, kelarutan sampel dalam eluen, polaritas,
transmisi cahaya, viskositas, stabilitas dan pH. Pelarut yang digunakan sebagai fasa gerak
harus dapat bercampur sehingga tidak menimbulkan presipitasi. Selain itu, sampel yang diuji
harus dapat terlarut dalam fasa gerak sehingga menghindari terjadinya presipitasi di dalam
kolom. Transmisi cahaya penting diperhatikan untuk masing-masing pelarut fasa gerak yang
digunakan. Pelarut yang memiliki nilai UV cutoff lebih tinggi dibandingkan dengan panjang
gelombang sampel yang dianalisis tidak dapat digunakan. Tabel II menunjukkan nilai UV
cutoff untuk beberapa pelarut yang sering digunakan. 5
Tabel II. Cuttoff Panjang Gelombang UV untuk Pelarut yang Sering Digunakan
Sebagai Fasa Gerak5
Pelarut Cutoff UV (nm)
Asetonitril 190
Air 190
Metanol 205
Asam trifluoroasetat 210
Buffer fosfat (pH 2-3) 210
Dietilamin 210
Asam format 210
TRIS 225
Asam asetat 230
Trietilamin 235
Buffer asetat (pH 3,5-5,5) 240
Buffer sitrat 250
DMF 268

c. Pompa. Pompa yang digunakan dalam KCKT harus bersifat inert atau tidak
bereaksi terhadap fasa gerak. Pompa yang digunakan biasanya dapat memberikan tekanan
hingga 5000 psi dan mampu mengalirkan fasa gerak dengan kecepatan alir mencapai 3
mL/menit. Pompa yang biasa digunakan umumnya memilki rentang kecepatan alir 0,001-10
mL/menit. Berdasarkan metode pencampuran KCKT dapat dibagi menjadi pencampuran
tekanan rendah atau tekanan tinggi.2

d. Tempat penyuntikan sampel. Sampel disuntikkan melalui alat penyuntik

secara langsung ke dalam fasa gerak yang mengalir menuju kolom.

e. Kolom. Kolom merupakan bagian KCKT yang di dalamnya terdapat fasa

diam. Fasa diam pada KCKT fasa normal berupa lapisan film cair yang terikat pada basis
 partikel silika yang bersifat polar. Tujuan terikatnya lapisan film ini adalah untuk mencegah
kemungkinan terjadinya kebocoran fasa diam dari kolom. Pada KCKT fasa terbalik, fasa
diam terbuat dari bahan non-polar yang biasanya merupakan silika yang dilapisi oleh karbon
C18 yang bersifat non-polar.3

f. Detektor. Detektor didasarkan pada adanya penyerapan radiasi ultraviolet

(UV) dan sinar tampak (Vis) pada kisaran panjang gelombang 190-800 nm oleh pelarut yang
mempunyai struktur atau gugus kromoforik. Sel detektor umumnya berupa tabung dengan
diameter 1 mm dengan panjang celah optik 10 mm. Dimensi dari sel detektor diatur
sedemikian rupa sehingga hasil pengukuran absorbsi sinar tidak terpengaruh oleh indeks
bias.2
2. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
Analisis kualitatif KCKT berupa pengamatan waktu retensi (t R) senyawa baku dan
senyawa yang tidak diketahui dibandingkan dengan parameter kromatograf secara berurutan
dalam kondisi alat yang stabil.
Untuk analisis hasil KCKT secara kuantitatif dapat dilakukan dengan luas puncak,
kemudian membandingkan luas puncak sampel yang diuji dengan luas puncak sampel
standar yang sudah diketahui konsentrasinya. Rumus untuk menghitung konsentrasi sampel
adalah sebagai berikut:

Parameter Validasi Metode Analisis

Validasi merupakan suatu proses dokumentasi atau pengujian suatu metode analisis
yang menghasilkan data analitik yang dapat diterima untuk tujuan penggunaannya. Metode
validasi dilakukan sesuai dengan parameter dan karakteristik yang tertera pada panduan
International Conference on Harmonization (ICH). Sesuai panduan dari ICH, proses validasi
biasanya meliputi pengujian beberapa parameter, antara lain spesifisitas, linearitas, akurasi,
presisi, rentang (range), limit of detection (LOD) dan limit of quantification (LOQ).2,6
1. Spesifisitas atau selektivitas
Spesifisitas atau selektivitas merupakan kemampuan dari metode yang diuji untuk
mendeteksi dan menganalisa bahan yang akan diperiksa dalam sebuah sediaan tanpa
gangguan dari komponen lain yang berada dalam sediaan tersebut. Spesifisitas dapat
ditunjukkan dengan waktu retensi yang sama dengan bahan yang akan diperiksa dalam
sampel yang diuji pada kromatogram dibandingkan dengan standar.
 2. Linearitas
Linearitas adalah kemampuan metode analisis untuk memberikan hasil yang
proporsional terhadap konsentrasi bahan yang akan diperiksa dalam sampel, baik secara
langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik.2,6
Linearitas dapat dinilai berdasarkan penilaian visual dari grafik antara respon atau
signal yang didapat dari metode pemeriksaan sebagai fungsi dari konsentrasi bahan yang
akan diperiksa. Jika terdapat hubungan yang linear, maka hasil uji dievaluasi menggunakan
uji statistik yang sesuai (misal, dengan regresi linear). Tujuan dari dibuatnya regresi adalah
untuk menentukan estimasi terbaik untuk gradien dan intersep y sehingga akan mengurangi
residual error, yaitu perbedaan nilai hasil percobaan dengan nilai yang diprediksi melalui
persamaan regresi linear. Menurut rekomendasi ICH, penetapan linearitas membutuhkan
pengujian pada minimal 5 konsentrasi yang berbeda.1,2,6
3. Akurasi
Akurasi sebuah metode analisis mencermikan kedekatan nilai yang diperoleh saat
penelitian dengan nilai yang sebenarnya (true value). Parameter ini diukur sebagai
persentase dari sampel yang dideteksi pada saat pemeriksaan. Sesuai dengan panduan ICH
Q2B, pemeriksaan akurasi dilakukan pada 3 tingkat konsentrasi yang meliputi batas yang
ditentukan, dan pada masing-masing konsentrasi dilakukan 3 kali pemeriksaan replika. FDA
merekomendasikan tingkat konsentrasi yang diperiksa adalah pada 80, 100 dan 120% dari
konsentrasi yang sebenarnya. Data hasil akurasi dilaporkan dalam persentase yang dideteksi
dari substrat yang diperiksa atau sebagai selisih antara rerata dengan nilai yang sebenarnya
(true value) dengan interval kepercayaan.

Akurasi untuk sediaan farmasi biasanya ditentukan menggunakan metode simulasi

(spiked-placebo recovery). Dalam metode simulasi, sejumlah bahan murni (senyawa
pembanding kimia) ditambahkan ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi
(plasebo) lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar bahan
yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya).1,2,6
4. Presisi
Presisi adalah besaran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil beberapa
seri pengujian terhadap satu sama lain untuk beberapa pengukuran dalam kondisi pengujian
yang sama. Presisi umumnya dilaporkan sebagai persentase standar deviasi relatif (% RSD)
dari beberapa pemeriksaan serial. ICH dan FDA merekomendasikan presisi untuk diukur
pada 3 tingkat konsentrasi yang berbeda.1,2,6
 5. Sensitivitas
Sensitivitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk membedakan dua
konsentrasi yang berbeda dan ditentukan melalui slope dari kurva kalibrasi.
6. Rentang (Range)
Rentang suatu metode biasanya didapatkan dari hasil linearitas dan bergantung dari
penerapan metode yang diujikan. Rentang ditetapkan dengan memastikan bahwa prosedur
yang diujikan menunjukkan linearitas, akurasi dan presisi ketika diterapkan pada sampel
yang mengandung jumlah bahan yang akan diperiksa di antara dan pada nilai-nilai ekstrim
batasan rentang yang spesifik sesuai jenis penerapan metode yang diujikan. ICH
merekomendasikan batasan rentang minimum untuk prosedur pemeriksaan substrat pada
sediaan farmasi umumnya antara 80 – 120% dari konsentrasi yang diujikan.1,2,6
7. Limit of detection (LOD) dan Limit of quantitation (LOQ)
LOD adalah jumlah terkecil bahan yang akan diperiksa dalam sampel yang dapat dideteksi
yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. LOQ merupakan
parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil bahan yang akan
diperiksa dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria akurasi dan presisi.2
8. Kesesuaian sistem
Keseuaian sistem merupakan parameter yang membantu untuk mengetahui apakah sistem
kromatografi yang digunakan berfungsi dengan optimal. Parameter dapat digunakan antara
lain keterpisahan antar dua puncak yang berdekatan (R), faktor ikutan (Tf), waktu retensi
keluarnya puncak, jumlah lempeng teoritis (N) dan nilai keterulangan (%RSD) untuk 5 atau 6
pengujian replika.6

1. Md Sabir A, Moloy M, S Bhasin P. HPLC method development and validation: a review.

International Research Journal of Pharmacy. 2015;4(4):39-46.
2. Hong DD, Shah M. Development and validation of HPLC stability-indicating assays. In:
Rhodes CT, Carstensen JT, editors. Drugs and the pharmaceutical sciences. 3rd ed., rev. and expanded
ed. New York: Marcel Dekker; 2000.
3. Prathap B, Dey A, Rao GHS, Johnson P, Arthanariswaran P. A Review - Importance of RP-
HPLC in Analytical Method Development. International Journal of Novel Trends in Pharmaceutical
Sciences. 2013;3(1).
4. Sanjay Kumar D DHK. Importance of RP-HPLC in analytical method development: a review.
International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. 2012;3(12):4626-33.
5. Taylor T. UV Detection for HPLC-Fundamental Principle, Practical Implications. The
Column. 2019:2-7.
6. International Conference of Harmonisation. Validation of analytical procedures: text and
methodology Q2(R1). Switzerland: ICH; 2005.