Nama : Innana Nadhifah

NIM : P07134215224

LAPORAN PRAKTIKUM VIROLOGI

Uji Hemaglutination (HA) dan Hemaglutination Inhibition (HI)

Hari, tanggal : Senin, 21 Mei 2018

Metode : Serologi metode HA dan HI

Tujuan : Untuk mendeteksi adanya antibodi di dalam serum, plasma, atau kuning
telur pada hewan yang terinfeksi oleh influenza tipe A

Prinsip :Terjadinya aglutinasi ketika hemagglutinin pada amplop virus berikatan

dengan reseptor permukaan sel darah merah.

DasarTeori

Newcastle disease (ND) merupakan penyakit menular yang sangat merugikan

peternak ayam. Di Indonesia penyakit ND dikenal pula dengan sebutan penyakit tetelo.
Kejadian penyakit bersifat akut sampai kronis, dapat menyerang semua jenis unggas
terutama ayam, baik ayam ras maupun ayam bukan ras (buras). Oleh karena itu kasus
ND merupakan ancaman serius bagi industri peternakan di Indonesia (Santhia, 2003;
Tabbu, 2000). Penyakit ND disebabkan oleh Avian Paramyxovirus type-1 (APMV-1),
genus Avulavirus famili Paramyxoviridae, merupakan virus RNA dengan genom serat
tunggal (single stranded/ss) dan berpolaritas negatif. Famili Paramyxoviridae berbentuk
pleomorfik, biasanya berbentuk bulat dengan diameter 100-500 nm, namun ada pula
yang berbentuk filamen, dan beramplop. Ada sembilan serotype dari avian
Paramyxovirus yaitu APMV-1 sampai APMV-9 (OIE, 2002).

Berdasarkan atas virulensinya, virus ND (VND) dikelompokkan menjadi tiga

patotype yaitu: lentogenik adalah strain virus yang kurang virulen, mesogenik
merupakan strain virus dengan virulensi sedang, dan velogenik adalah strain virus
ganas. Strain velogenik dibedakan lagi menjadi bentuk neurotrofik dengan gejala
gangguan saraf dan kelainan pada sistem pernafasan, dan bentuk viserotrofik yang
ditandai dengan kelainan pada sistem pencernaan (Aldous dan Alexander, 2001).

Penularan VND dapat terjadi secara langsung antar ayam dalam satu kelompok
ternak tertular. Sumber virus biasanya berasal dari ekskreta ayam terinfeksi baik melalui
pakan, air minum, lendir, feses, maupunudara yang tercemar virus, peralatan, dan
pekerja kandang. Patogenisitas VND dipengaruhi oleh galur virus, rute infeksi, umur
ayam, lingkungan, dan status kebal ayam saat terinfeksi virus. Selama sakit, ayam
mengeluarkan virus dalam jumlah besar melalui feses (Alexander, 2001).

Uji HA digunakan untuk mendeteksi virus yang memiliki hemaglutinin.

Hemaglutinin ini dapat mengaglutinasi eritrosit beberapa spesies hewan, salah satunya
adalah eritrosit unggas. Kegunaan lainnya dari uji HA adalah sebagai dasar untuk
menentukan titer virus ND (Darminto, 1996). Uji HA untuk menentukan titer virus ND
didasarkan pada prinsip kemampuan hemaglutinasi dari virus ND terhadap sel darah
merah (Grimes, 2002). Titer HA adalah pengenceran tertinggi yang masih dapat
mengaglutinasi eritrosit. HA sempurna ditandai dengan lapisan sel darah merah secara
merata pada dasar sumuran microplate dan penjernihan dari cairan di bagian atas tanpa
terjadinya pengendapan. Sedangkan hasil negative menunjukan sel darah merah
berbentuk titik di tengah sumuran (Ernawati dkk, 1996).

Beberapa virus mampu mengaglutinasikan sel darah merah. Kemampuan ini sebagai
contoh dari aktivitas biologik dan aktivitas ini dapat dihambat oleh antibodi tertentu.
Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada
sel darah merah dan permukaan sel lain. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat
aglutinasi sel darah merah menjadi tampak. Enzim virus neuraminidase memecah ikatan
antara virus dan sel, dan melepas keduanya ke dalam larutan. Antigen adalah bagian
virus yang mengandung ikatan dan antigen dari virus digunakan untuk uji
hemaglutinasi(Stephen, 1980)

Uji HA lambat digunakan untuk mengetahui titer virus, kemampuan virus dalam
menginfeksi yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi eritrosit. Titer virus dapat
diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada nomor tertinggi ( end point ) yang
menunjukkan adanya hemaglutinasi positif. Hal itu ditandai dengan adanya agregat-
agregat di dasar sumur (Stephen, 1980). Sedangkan, uji HA cepat biasanya dipakai
untuk mengidentifikasi virus yang mampu menghemaglutinasi eritrosit ayam.

A. Alat dan Reagensia

a. Alat
- Mikropipet dan tip
- Mikroplate 96 lubang dasar u dan tutup mikroplate
- Sentrifuge
- Gelas ukur
- Tabung sentrifuge
- Shaker mikroplate
- Rak tabung reaksi
- Tabung Erlenmeyer
b. Bahan : serum dari darah ayam
c. Reagensia
- Phosphate buffer salin (PBS) 0,01 M pH 7,2
- Larutan alsever
- Sel darah merah ayam
- Serum control positif H5 dan negative
- Antigen A1 H5 inaktif
B. Cara Kerja
 Persiapan reagen, prosedur control
1. Pencucian sel darah merah
Sel darah merah yang bercampur larutan alsever (3-6 ml) dimasukkan
dalam tabung sentrifuge ukuran 15 ml dan diputar dengan kecepatan
2500 rpm selama 5 menit. Larutan supernatant diambil kemudian
ditambahkan lagi 1 bagian PBS dan diputar selama 2500 rpm 10 menit
dan diulang 2 kali sampai mendapatkan sel darah merah yang bersih
 (100%). Sel darah merah yang sudah dicuci ini dapat disimpan pada
suhu 4°C selama 1 minggu.
2. Pembuatan sel darah merah 10%
Sel darah merah yang telah dicuci ditambahkan dengan PBS sebanyak 9
bagian.Sel darah merah ini dapat disimpan selama 1 minggu pada suhu
4°C.
3. Pembuatan sel darah merah 1%
Sel darah merah 10% dienccerkan 10 kali dengan menambahkan 9
bagian PBS. Sel darah merah ini dapat disimpan selama 1 minggu pada
suhu 4°C.
 Prosedur kerja pengujian hemagglutinasi
1. PBS sebanyak 25μl diisikan ke dalam semua lubang mikroplate (1-12).
2. Antigen A1 25μl dimasukkan ke dalam lubang pada kolom 1.
3. Diencerkan secara seri dari lubang 1 sampai dengan lubang 11.
4. PBS sebanyak 25μl diisikan kembali keseluruh lubang mikroplate (1-
12).
5. Sel darah merah 1% sebanyak 25μl diisikan ke semua lubang (1-12).
6. Diinkubasikan dalam suhu ruang selama 30 menit.
7. Dibaca hasilnya. Lubang terakhir yang tidak menunjukkan adanya darah
yang mengalir (teardrop) pada lubang mikroplate merupakan titer dari
antigen yang diuji. Titer HA adalahpengencerantertinggidari antigen
yang masih mampu mengagglutinasi sel darah merah.
 Prosedur kerja pengujian Hemagglutinasi – Inhibition
1. PBS sebanyak 25μl diisikan kedalam semua lubang mikroplate (1-12).
2. Serum sampel sebanyak 25 μl dimasukkan ke dalam lubang 1.
3. Diencerkan secara seri dari lubang 1 sampai lubang 11.
4. Antigen A1 4 HA unit sebanyak 25 μl diisikan ke dalam lubang 1
sampai dengan 11 kemudian dicampur dengan baik.
5. Diinkubasikan dalam suhu ruang selama 30 menit.
6. Sel darah merah 1% sebanyak 25 μl diisikan kedalam semua lubang (1-
12).
 7. Diinkubasikan dalam suhu ruang selama 30 menit.
8. Dibaca hasilnya.
Interpretasi hasil : serum/plasma/yolk sac dinyatakan positif jika
mempunyai titer ≥24. Nilai ini dibaca pada lubang terakhir yang tidak
ditemukan adanya lisis sel darah merah.

C. Hasil Pengamatan

HA HI

D. Pembahasan

Pembacaan dilakukan dengan cara sebagai berikut. Pada lubang yang menampakan
terjadinya endapan seperti pada lubang control negative dinyatakan negative HA,
sedangkan yang menunjukan terjadinya aglutinasi (penggumpalan RBC) dinyatakan
positif HA. Untuk memudahkan pembacaan, pelat mikro titer dimiringkan 45
derajat.Penghitungan HA unit dilakukan dengan cara menghitung lubang yang positif.

Uji hemaglutinasi dengan teknik mikrotiter juga bisa disebut dengan uji HA
lambat.Untuk uji HA lambat teramati reaksi hamaglutinasi pada pelat mikro rata – rata
sampai pelat yang ke-7. Titer virus yang diperoleh adalah 64 HA unit virus ( HA unit
adalah satuan penghitungan virus) artinya, antigen yang diencerkan hingga 64 kali
masih mampu mengaglutinasi eritrosit 0,5% . Interpretasi dari data adalah jika titer virus
tinggi maka prognosanya kurang baik karena infeksi yang berjalan dalam tubuh
berlangsung signifikan.Pada uji ini bisa jadi reaksi aglutinasi yang terjadi sudah tidak
akurat lagi karena pengamatan dilakukan sudah agak lama setelah terjadinya proses
reaksi aglutinasi sehingga bisa jadi tercampur dengan reaksi elusi karena virus juga
memiliki protein neuraminidase yang mampu mengelusi reaksi aglutinasi yang sudah
jadi.

Titer HA adalah pengenceran tertinggi yang masih dapat mengaglutinasi eritrosit. HA

sempurna ditandai dengan lapisan sel darah merah secara merata pada dasar sumuran
microplate dan penjernihan dari cairan di bagian atas tanpa terjadinya pengendapan.
Sedangkan hasil negative menunjukan sel darah merah berbentuk titik di tengah
sumuran.

Beberapa virus mampu mengaglutinasikan sel darah merah. Kemampuan ini sebagai
contoh dari aktivitas biologik dan aktivitas ini dapat dihambat oleh antibodi tertentu.
Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada
sel darah merah dan permukaan sel lain. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat
aglutinasi sel darah merah menjadi tampak. Enzim virus neuraminidase memecah ikatan
antara virus dan sel, dan melepas keduanya ke dalam larutan.

E. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan diperoleh hasil titer HA sebesar 128
dan titer HI 256.

Daftar Pustaka :
http://microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/ToolBox/elisa.html

Banjarbaru, 23 Mei 2018

Praktikan Dosen

Innana Nadhifah LekaLutpiatina, S.KM.,MSi