Fase diam
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena
strukturnya, ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa
diam yang digunakan TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk
kromatografi kolom, terutama karena ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase
diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu ukuran (diameter) dalam mesh atau
j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau kromatografi kolom).
Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran:
Silika gel
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam
perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40µm. Makin kecil
diameter akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian
mempengaruhi kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari
300-1000 m2/g. Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat
mengikat air 7-20%. Macam-macam silka gel yang dijual dipasaran:
Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan pengikat gypsum,
(CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan
pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai
pengikat mengganggu penggunaan asam sulfat sebagai pereaksi penentuan
bercak.
Silika gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini
sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa
dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator digunakan timah-
kadmium sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau
Silika gel GF254 (berflouresensi pada ג, 254nm).
Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan nama Silika gel H atau Silika gel
N.
Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator flouresensi.
Silika gel untuk keperluan pemisahan preparative
Alumina
Banyak digunakan setelah silika gel, alumina termasuk kelompok fase diam yang
beraktifitas tinggi. Alumina yang digunakan TLC bersifat sedikit basa (pH 9), ada
juga yang bersifat netral (pH 7) dan alumina yang bersifat asam (pH 4). Juga
digunakan CaSO4 sebagai pengikat yang dapat menurunkan bebasaan pada
tinggkat tertentu. Sepertihalnya Silica gel, alumina dikenal dengan atau tanpa
pengikat dan bahan indicator. Pemberian namapun identik dengan silika gel
dengan code G.H.P.F.
Selulosa
Menggunakan selulosa sebagai fase diam maka mekanisme pemisahannya
sama seperti mekanisme pemisahan pada kromatografi kertas. Perbedaannya
hanya serat selulosenya pada TLC/KLT lebih pendek dari pada serat selulosa
kromatografi kertas. Panjang serat bervariasi 2-20 µ. Serat lebih pendek
menyebabkan difusi rendah selama elusi dan menghasilkan bercak yang sempit
(lebih kecil). Selulosa untuk TLC terdapat dim bentuk selulosa serat asli
(contohnya MN 300) dan selulosa mikrokristal (contohnya Avicel). Fase diam
selulosa biasanya digunakan senyawa yang bersifat polar.
Fase gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik
(tabel 1). Dapat digunakan satu macam pelarut organic saja ataupun
campuran.
Bilamana fase gerak merupakan campuran pelarut organik dengan air maka
mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan pelarut organic ini sangat
penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatan
polaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar
akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase
gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh
fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar.
Tabel 2: Perbandingan berat fase diam dan cairan untuk pembuatan plat.
Plat TLC yang siap pakai tersedia dipasaran, diantaranya dengan ukuran
20X20 diatas lembaran gelas, aluminium, plastik. Plat-plat ini dapat dipotong
sesuai dengan luas plat yang diperlukan. Untuk lembaran plastik tidak dapat
dipanaskan pada waktu pengamatan bercak/spot.
Penyiapan dan penotolan sampel
Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir
pelarut organik dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air
digunakan hanya bila tidak dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk
keperluan analisis kuantitatif sample harus ditimbang demikian juga pelarut yang
digunakan. Kemudian larutan sample disimpan dalam wadah yang tertutup rapat
untuk menghindari penguapan. Pada umumnya ditotolkan 1-20 µl larutan yang
mengandung 50-100 µg sample tiap bercak untuk kromatografi absorbsi dan 5-
2Qµg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan dapat dilakukan dengan
gelas kapiler yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk keperluan
kuantitatif digunakan quantitative microsyringe. Kepada plat TLC konvensional
(20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2 mm) sample ditotolkan sebagai bercak bulat atau
garis, 1,5-2,0 cm dari tepi bawah. Untuk memudahkan penotolan dibuat garis
lemah dengan pensil, disebut garis awal. Pada garis awal ini biasanya ditotolkan
bercak-bercak dengan garis tengah 3-6 mm, bercak-bercak tadi diusahakan
diameternya seragam. Penotolan bercak pada plat TLC dapat dilakukan
berulang-ulang dan haras berhati-hati dijaga plat tidak rusak. Penotolan sample
yang terlalu banyak (over loaded) menyebabkan bercak hasil pengembangan
berbentuk tidak bulat (asimetri) dan perubahan harga Rf. Bila totolan sample
sample telah kering maka plat siap untuk dielusi / dikembangkan.
Pengembangan (Elusi)
Hampir semua TLC dikembangkan dengan cara menaik dalam bejana
(chamber) pengembang dari gelas. Di dalam bejana ini dimasukkan fase gerak
hingga kedalaman 0,5 cm, pada dinding sebelah dalam bejana ditempelkan
kertas saring setinggi 20 cm yang ujung bawahnya tercelup fase diam. Fase
diam akan merambat keatas membasahi kertas saring, dengan demikian
ruangan dalam bejana tertutup ini akan lebih cepat dijenuhi dengan uap pelarut.
Setelah ruangan dalam bejana jenuh dengan uap fase gerak (terjadi
kesetimbangan), plat TLC dimasukkan dimulai pengembangan atau elusi. Bercak
sample pada garis awal jangan sampai tercelup dalam fase gerak. Fase gerak
akan merambat naik membawa komponen sample. Kecepatan merambat tiap-
tiap komponen berbeda tergantung kekuatan persaingan ikatan hydrogen yang
terjadi antara fase diam-senyawa (komponen)-fase gerak. Komponen yang
membentuk ikatan hydrogen lebih kuat dengan fase gerak akan terelusi lebih
cepat atau merambat lebih cepat. Sebaliknya kalau ikatan hidrogennya lebih kuat
dengan fase diam, komponen akan lebih lama tertahan fase diam atau
merambat lambat. Pengembangan dihentikan pada saat fase gerak mencapai
jarak tertentu, biasanya 1 cm sebelum ujung akhir plat. Batas dicapainya fase
gerak segera ditandai dengan pensil sebagai garis akhir. Lebih baik batas akhir
ini dibuat dahulu sebelum pengembangan, bila pelarut mencapai garis akhir, plat
segera diangkat dan dikeluarkan dari bejana.
Cara-cara pengembangan yang lain adalah :
1. Pengembangan berulang
Yaitu plat yang baru saja dielusi dikeringkan kemudian dielusi kembali
dengan fase gerak yang sama.
2. Pengembangan dua dimensi
Yaitu plat dikembangkan seperti biasa, setelah itu dikeringkan dan pelat
diputar 90° kemudian dikembangkan dengan fase gerak berbeda
(pemisahan flavone "Harbone")
Pengembangan sirkular
3. Contoh cara pengembangan ini adalah pada kromatotorn, sebenarnya
termasuk kromatografi planar juga. Perbedaan dengan KLT adalah cara
pengembangannya yaitu kromatotorn dikembangkan dengan cara
dipusingkan pada kecepatan tertentu. Sampel ditotolkan pada daerah
dekat sumbu putar, kemudian sambil dipusingkan fase gerak diteteskan
dan diatur kecepatannya, fase gerak ini akan keluar menetes dibagian
tepi pelat yang dipusing tersebut.
7 T7 Analgetika narkotik
8 T8 Analgetika narkotik
9 T9 Alkaloid ergot
10 T10 Barbiturat Fase gerak :
Aseton 1
CHC13 9
Pengembangan : 10 cm +17
menit
Visualisasi :
- KMnO4warna yang
timbul kuning, coklat,
purple. Pereaksi
- Zwikkers warna yang
timbul Pink atau hijau
11 T11 Barbiturat
12 T12 Barbiturat Fase gerak :
Larutan amoniak pekat 5
Benzen 75
Dioksan 20
13 T13 Barbiturat
17 T17 Aspirin
22 T22 Golongan sulfa Sample dilarutkan dalam aseton
Fase gerak:
CHC13 1
Etanol 1
Heptana 1
Air 1,5%
Kesetimbangan 3 jam
Visualisasi : diazotasi dengan N-
l-naftiletilendiamin (spray)
Tabel: 5, Obat-obat Sulfa dan Nilai Rf pada T22
Fase gerak sistim T22 mengandung air, oleh karena itu mekanisme pemisahan
adalah partisi. Struktur molekul ketiga sulfa pada Tabel 5, berbeda pada R, R
pada sulfadiazin adalah gugus pirimidin tak tersubstitusi, oleh karena itu
sulfadizin lebih polar dari pada sulfamerazin yang gugus pirimidinnya
tersubstitusi satu metil. Sedangkan sulfadimidin lebih kurang polar karena gugus
pirimidinnya tersubstitusi dua metil. Rf ketiga senyawa ini membuktikan bahwa
sulfadimidin lebih cepat terelusi (Rf terbesar), sedangkan sulfadiazin lebih
senang melarut dengan fase diam atau dikatakan mempunyai affinitas yang lebih
kuat dengan fase diam dari pada sulfa yang lain itu, dan ini ditunjukkan
mempunyai Rf terkecil dari ketiga sulfa itu.
Tabel: 6, Senyawa Barbiturat dengan Nilai Rf pada TI
Fase gerak sistim TIO adalah campuran aseton dan chloroform. Pada Tabel 6
dipilihkan barbiturat yang mempunyai perbedaan pada R2. Bila dibandingkan
gugus R2 ini, maka sulfa yang mempunyai R2, alkil rantai pendek adalah yang
lebih polar dari pada sulfa yang mempunyai R2, alkil rantai lebih panjang.
berikatan rangkap.
Analisis Kuantitatif
Ketepatan dan ketelitian KLT untuk analisis kuantitatif lebih rendah bila
dibandingkan dengan kromatografi gas dan kromatografi kinerja tinggi. Namun
untuk keperluan tertentu sudah memadahi. Dibedakan dua cara:
1. Bercak langsung diukur
2. Bercak diambil (dikerok)
Ad 1.
Dengan dasar adanya hubungan antara luas bercak dengan banyaknya
senyawa terlarut maka senyawa dapat diukur kadarnya dengan mengukur luas
bercak. Cara dibedakan lagi:
a. Tanpa menggunakan kurva baku
Menurut Purdy & Truter: akar luas bercak berbanding lurus dengan
logaritma(lO) berat senyawa yang ada. Untuk menghitung dengan cara ini
maka perlu dibuat tetapan untuk senyawa pada sistem yang tertentu.
b. Menggunakan kurva baku
Dibuat kurva hubungan kadar dan luas bercak dari senyawa murni
pembanding.
Akan diperoleh persamaan garis lurus Y = bX + a. Selanjutnya luas bercak
sampel dapat dihitung. Adapun urutan kerja dapat disusun sbb :
1* Dibuat larutan mengandung senyawa murni yang akan dianalisis dengan 3
macam konsentrasi yang diketahui.
2* Dibuat larutan sample pada kadar tertentu sehingga setelah dielusi
memberikan
bercak yang bulat (ideal).
3* Ke 4 larutan ( 1 sampel, 3 lart baku) ditotolkan secara duplo pada lempeng
yang sama (20X20 cm).
Perlu diperhatikan:
- penotolan tegak lurus dengan alat suntik mikro, gelas kapiler.
- banyak larutan 5-10 pi.
- sekali penotolan saja dengan volume yang sama.
4* Lempeng dielusi / dikembangkan sampai jarak yang telah ditentukan (10-
20cm) didalam bejana yang dijenuhi fase gerak. Kemudian ditampakkan/
divisualisasikan degan cara yang sesuai.
5* Luas bercak diukur pada alat densitometer. Dibuat kurva hubungan kadar dan
luas kemudian dibuat persamaan garis lurus. Kadar senyawa dalam dapat
ditetapkan.
KLT preparatif
Cara ini ideal untuk memisahkan sample dalam jumlah kecil (50mg-1gram).
Larutan sample ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat. Dielusi seperti
cara-cara biasa yang telah dijelaskan didepan. Akan terjadi bercak berupa garis
atau pita. Visualisasi dipilih cara yang tidak merusak. Jika terpaksa digunakan
cara-cara merusak mis, disemprot dengan pereaaksi, maka pelat ditutup
sebagian dan bagian kecil lain yang disemprot. Sehingga dapat diperkirakan
letak bercak berbentuk pita/garis lurus. Pita yang diinginkan dikerok dan
dilarutkan dengan pelarut yang sesuai. Fase diam. Yang sering digunakan
adalah silikagel dengan atau tanpa indicator flouresensi 254 nm. Tersedia TLC
preparative dijual dengan kualitas lebih baik daripada lapisan fase diam yang
dibuat sendiri. Tebal optimum lapisan preparative berkisar antara 1-1,5 mm.
Lapisan yang terlalu tebal kurang memberikan pemisahan yang baik. Lapisan
preparative dapat dibuat dengan ketebalan yang diinginkan dengan alat dari
Desaga.