Mirfat

BAGIAN BIOLOGI-ANATOMI FKUY

1
 Perkembangan biomolekuler
Penemuan rangkaian DNA sebagai dasar dari
gen
Sebelumnya, dunia kedokteran tidak mengetahui
persis wujud gen yang sebenarnya
Seseorang dengan kelainan tertentu hanya
dimengerti sebabnya sebagai bawaan dari nenek
moyangnya, tanpa diketahui bagaimana
penjelasan rasional dan ilmiah. Apalagi
kemungkinan mencari jalan keluarnya.

2
 Perkembangan biomolekuler
 Di Indonesia, perkembangan penelitian
biomolekuler menunjukkan kemajuan
 Berbagai penelitian biomolekuler LIPI
 produksi rekombinan erythroepoetin (hEPO),
semacam protein yang dimurnikan yang
bermanfaat meningkatkan jumlah sel darah
merah secara signifikan.

3
 Perkembangan biomolekuler
 Penelitian ini untuk menghasilkan obat anemia.
Percobaan sudah ditempuh dengan
menyuntikkan protein terekspresi pada sel
mencit atau sejenis tikus. Hasilnya,
menunjukkan kenaikan sel darah merah secara
signifikan.
 Program penelitian obat anemia ini sudah
dipaparkan ke beberapa perusahaan farmasi.

4
 Teknologi DNA

revolusi dalam bioteknologi

manipulasi organisme /
komponen organisme untuk
menghasilkan produk yang bermanfaat
5
 PCR

 Polymerase Chain Reaction: disusun 1983

oleh Kary Mullis Hadiah Nobel 1993
 Reaksi Rantai Polimerase
 Suatu teknik untuk memperbanyak
segmen DNA tertentu
 Setiap fragmen DNA dpt diperkuat
(diamplifikasi/disalin bbrp kali ) dengan cepat
tanpa menggunakan sel
6
 PCR
 DNA diinkubasi tabung reaksi DNA
polimerase, suatu pasokan nukleotida &
potongan pendek DNA untai tunggal
sintetik (primer sintesis DNA)
 DNA polimerase membutuhkan primer
polimerase ini dapat menambahkan
nukleotida hanya pada rantai nukleotida
yang telah ada sebelumnya

7
 PCR
 Secara otomatis PCR dpt membuat
miliaran salinan segmen DNA target dlm
beberapa jam
 Lebih cepat drpd pengklonan sepotong
DNA yg butuh berhari-hari dg membuat
plasmid rekombinan & membiarkannya
bereplikasi di dlm bakteri

8
 PCR
 Penguatan (amplifikasi) sampel DNA kecil
bermiliar kali beberapa keperluan

 Penyidikjarian DNA dlm percobaan

pembunuhan

9
 Manfaat
 Dalam kasus-kasus kejahatan
 pembunuhan, pemerkosaan, teror pengeboman,
untuk memastikan benar tidaknya tersangka sebagai
pelaku.
 Jika tersangka masih hidup pengujian dilakukan
dengan membandingkan DNA tersangka
dengan DNA objek yang tertinggal di tempat
kejadian, misalnya rambut atau sperma.
 Jika tersangka mati dan tubuhnya hancur, maka
DNA dari bagian-bagian tubuh tersangka
dicocokkan pola restriksinya dengan DNA kedua
orang tuanya atau saudara-saudaranya yang
masih hidup.
10
 Prosedur PCR
 DNA dipanasi sec singkat utk memisahkan
untainya
 Didinginkan utk membiarkan primer
berikatan dg ujung2 urutan target melalui
ikatan hidrogen, satu primer pada setiap
untai

11
 Prosedur PCR

 DNA polimerase menambahkan

nukleotida pada ujung 3’ primer, dg
menggunakan untai DNA yg lebih panjang
sbg cetakannya
 Dlm wkt + 5 menit urutan DNA target yg
panjangnya mencapai 100 pasangan basa
telah digandakan
 Larutan ini kemudian dipanaskan lagi,
memulai siklus pemisahan untai yg lain,
pengikatan primer & sintesis DNA
12
 Because both strands are copied during PCR, there is an exponential
increase of the number of copies of the gene.
e.g. if there is only one copy of the wanted gene before the cycling starts,
after one cycle, there will be 2 copies, after two cycles, there will be 4 copies,
three cycles will result in 8 copies and so on.

Reproduced from http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/principles/pcr.html

13
 PCR Machine Thermal Cycler
PCR Reaction Tubes

http://www.molecularstation.com/molecular-biology-images/509-pcr-pictures/74-pcr-reaction-tubes.html
14
 http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.gif

15
 PCR
Digunakan u/ memperkuat DNA dr berbagai
sumber:
 DNA dr sedikit darah, jaringan, / air mani
yg ditemukan di tempat kejadian perkara
kriminal
 DNA dr sel embrionik tunggal u/ diagnosis
kelainan genetik sblm kelahiran
 DNA gen virus dr sel yg diinfeksi o/ virus
yg sulit terdeteksi spt HIV
16
 The HIV PCR test
 salah satu alat diagnostik paling akurat
 mendeteksi keberadaan virus
immunodeficiency dalam darah manusia,
lebih dikenal sebagai HIV.
 Salah satu prosedur screening
 dapat digunakan untuk deteksi dini.
 Bahkan, tes ini berhasil dapat menunjukkan
virus dalam waktu tiga minggu setelah infeksi
terjadi.

http://www.wisegeek.com/what-is-a-hiv-pcr-test.htm
17
 http://www.google.co.id/imgres?imgurl=http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/Gel_electrophores
is_apparatus.JPG/288px-Gel_electrophoresis_apparatus.JPG&imgrefurl=http://hdtv2008.blogspot.com/2008/06/gel-
electrophoresis-
1.html&h=368&w=288&sz=20&tbnid=QjuyI6M1cwcJ::&tbnh=122&tbnw=95&prev=/images%3Fq%3Delectrophoresis%2B
pictures&hl=en&usg=__nUHyJ5-XZaVlUcVRahSwaZaFV7o=&sa=X&oi=image_result&resnum=3&ct=image&cd=1

18
 Elektroforesis Gel

 Memisahkan makromolekul-as nukleat atau

prot- berdasarkan ukuran, muatan listrik &
sifat2 fisis lainnya
 U/ molekul DNA linear, pemisahan yg
dilakukan terutama tergantung pd
ukurannya
 Memisahkan campuran molekul DNA mjd
pita2 yg msg2 tdd molekul DNA dg pj yg
sama
19
 Elektroforesis
•Proses bergeraknya molekul bermuatan pada
suatu medan listrik.
•Kecepatan molekul yang bergerak pada medan
listrik tergantung pada muatan, bentuk dan
ukuran.
•Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat
dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,
ataupun dilakukan kuantifikasi dengan
densitometer.

20
 Elektroforesis
 Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan
matriks penyangga untuk mencegah terjadinya
difusi karena timbulnya panas dari arus listrik
yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa
merupakan matriks penyangga yang banyak
dipakai untuk separasi protein dan asam
nukleat.
 Elektroforesis yang dibahas di bawah ini
menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida
(PAGE = poly-acrilamida gel electrophoresis)
untuk separasi sampel protein.

21
 Elektroforesis
 Banyak molekul biologi bermuatan listrik
yang besarnya tergantung pada pH dan
komposisi medium dimana molekul biologi
tersebut terlarut.
 Bila berada dalam suatu medan listrik,
molekul biologi yang bermuatan positif
akan bermigrasi ke elektroda negatif dan
sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai
dalam elektroforesis untuk memisahkan
molekul-molekul berdasarkan muatannya.
22
23 http://www.molecularstation.com/images/protein-gel-electrophoresis.jpg
 Manfaat elektroforesis
 Diagnosis kelainan genetik
 Diagnosis thalassemia dibuat berdasarkan
anamnesis mengenai gejala klinis, riwayat
keluarga/pola herediter, pemeriksaan fisik dan
pemeriksaan laboratorium.
 Pemeriksaan laboratorium yang diperlukan adalah
untuk analisa hemoglobin yaitu hematologi rutin,
hapusan darah tepi, dan elektroforesis.
 pemeriksaan Hb elektroforesis
 Elektroforesis hemoglobin
 mengidentifikasi hemoglobin abnormal
dan mengukur kadar hemoglobin normal

Hull.D & Johnston,D.I 2008.Dasar dasar pediatri ed.3

 Southern Blotting

 Suatu metode untuk memindahkan

fragmen-fragmen DNA yang telah
didenaturasi dan yang telah dipisahkan
dengan eletrophoresis, dari gel ke suatu
lembar penyerap
 Mendeteksi & menganalisis urutan DNA
tertentu
 Membandingkan DNA dr individu / spesies
yg berbeda
26
 Southern Blotting: Gel Transfer

Legend:

Detection of specific DNA fragments by gel-transfer hybridization (Southern blotting). (A) The
mixture of double-stranded DNA fragments generated by restriction nuclease treatment of DNA is
separated according to length by electrophoresis. (B) A sheet of either nitrocellulose paper or nylon
paper is laid over the gel, and the separated DNA fragments are transferred to the sheet by
blotting. The gel is supported on a layer of sponge in a bath of alkali solution, and the buffer is
sucked through the gel and the nitrocellulose paper by paper towels stacked on top of the
nitrocellulose. As the buffer is sucked through, it denatures the DNA and transfers the single-
stranded fragments from the gel to the surface of the nitrocellulose sheet, where they adhere
firmly. This transfer is necessary to keep the DNA firmly in place while the hybridization procedure
(D) is carrried out. (C) The nitrocellulose sheet is carefully peeled off the gel. (D) The sheet
containing the bound single-stranded DNA fragments is placed in a sealed plastic bag together with
buffer containing a radioactively labeled DNA probe specific for the required DNA sequence. The
sheet is exposed for a prolonged period to the probe under conditions favoring hybridization. (E)
The sheet is removed from the bag and washed thoroughly, so that only probe molecules that have
hybridized to the DNA on the paper remain attached. After autoradiography, the DNA that has
hybridized to the labeled probe will show up as bands on the autoradiograph. An adaptation of this
technique to detect specific sequences in RNA is called Northern blotting. In this case mRNA
molecules are electrophoresed through the gel and the probe is usually a single-stranded DNA
molecule.

27
 Southern, Northern, Westerns
Blotting

Southern, Northern, Westerns

Ekstrak DNA Ekstrak RNA dr Ekstrak Protein

dr sel sel dr sel

28
 DNA microarray

Merupakan suatu teknik untuk

menentukan gen-gen mana yang aktif dan
gen-gen mana yang ter-represi/tidak aktif
pada keadaan fisiologis tertentu

29
30