Makalah Kromatografi Cair

Diajukan sebagai Tugas Mata Kuliah Kimia Analisis 2

Disusun Oleh :

Ridhan ( 09220160002 )
Alda Titania Dewanti ( 09220160009 )
Nurussarirah M Abuhaji ( 09220160024 )
Aninditha Dzakiah ( 09220170094 )
Umar Mustafa Uba ( 09220130003 )

KELAS : C1

JURUSAN TEKNIK KIMIA

FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

MAKASSAR

2017
 KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum. Wr. Wb.

Kita panjatkan puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat-
NYA, sehingga kami penyusun dapat menyelesaikan penyusunan makalah ini. Tidak lupa
shalawat serta salam selalu kita curahkan kepada junjungan kita Nabi besar Muhammad
SAW yang telah membimbing umatnya di jalan yang benar.

Kami ucapkan terimakasih kepada pihak-pihak yang sudah membantu dalam

penyusunan makalah ini. Terima kasih secara Khusus Kepada Dosen Pembimbing Mata
Kuliah Kimia Analisis II Ibu Ir. Mustafiah,ST.,MT.,IPP . Makalah ini kami susun
berdasarkan tugas dari mata kuliah Kimia Analisis II yang berjudul “Kromatografi Cair” .

Akhir kata, semoga makalah ini dapat diterima dan bermanfaat bagi orang banyak.
Penyusun juga meminta maaf apabila banyak kesalahan dalam penyusunan makalah ini,
kritik dan saran sangat diharapkan oleh penyusun.

Wassalamu’alaikum. Wr. Wb.

Makassar, 3 Oktober 2017

Penyusun

ii
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR.............. .......................................................................................... ii

DAFTAR ISI...................................................................................................................... iii

BAB I PENDAHULUAN

1.1.LATAR BELAKANG ...................................................................................................1

1.2.RUMUSAN MASALAH ............................................................................................... 1
1.3.TUJUAN ........................................................................................................................ 2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI ............................................................ 3

2.2 KROMOTOGRAFI CAIR VAKUM ...........................................................................11
2.3 KROMOTOGRAFI CAIR PADAT ............................................................................13

BAB III PENUTUP

3.1 KESIMPULAN ............................................................................................................17

3.2 SARAN ........................................................................................................................ 17

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................18

iii
iv
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang
Alat Kromatografi adalah suatu alat umum yang digunakan untuk bermacam-macam
teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa
berupa gas ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu
padatan. Penemu Alat Kromatografi adalah Tswett pada tahun 1930, mencoba
memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang barisi
kapur (CaSO4). Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-
daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir
bersamaan, D.T. Day juga menggunakan alat kromatografi untuk memisahkan fraksi-
fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu alat dan yang
menjelaskan tentang proses kromatografi.
Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan
suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Pada tahap awal alat
kromatografi cair menggunakan kolom dari gelas dengan diameter 1 sampat 5 cm dengan
panjang 50 sampai 500 cm dan fase diam berdiameter 150-200 m. Laju alir sangat lambat,
sehingga pemisahan sering sampai berapa jam bahkan ½ hari. Hal ini jelas kurang
menguntungkan, maka diusahakan cara-cara mempercepat pemisahan. Usaha tersebut
adalah dengan menggunakan pompa untuk mengalirkan fase gerak, ternyata efisiensi
pemisahan menjadi turun dan hal ini dapat diatasi dengan memperkecil ukuran partikel
fase diam. Sejak tahun 1960, sudah ditemukan teknologi pembuatan partikel fase diam.
Dengan fase diam dengan diameter kecil sampai 10 partikel-partikelnya kecil
memerlukan tekanan yang tinggi agar laju alir menjadi besar.
1.2.Rumusan Masalah
Adapun rumusan masalah dari makalah ini adalah :
1. Apakah yang dimaksud dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ?
2. Apakah yang dimaksud dengan Kromatografi Cair Vakum ?
3. Apakah yang dimaksud dengan Kromatografi Cair Padat ?
4. Bagaimana bentuk dan cara kerja alat dari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi,
Kromatografi Cair Vakum dan Kromatografi Cair Padat ?
1.3.Tujuan
Tujuan dari penulisan makalah ini adalah untuk mengetahui :
1. Pengertian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
2. Pengertian Kromatografi Cair Vakum
3. Pengertian Kromatografi Cair Padat
4. Bentuk dan cara kerja alat dari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Kromatografi Cair
Vakum dan Kromatografi Cair Padat

2
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada
teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam
bentuk cair atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara
simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks. Pada akhir 1960-
an, semakin banyak usaha yang dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair
sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi
cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom
menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.
Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan
performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang
jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase
gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di
samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem
deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem
kromatografinya.
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya
dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila
derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi
dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT
adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi
akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.

2.1.1. Keuntungan dan Kelemahan Kromatografi Kinerja Tinggi

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode

kromatografi lainnya, antara lain :

3
 a) Cepat, waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu
analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.
b) Resolusi tinggi, berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada
KCKT karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.
c) Sensitivitas detektor, detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam
KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari
bermacam-macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat
mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).
d) Kolom dapat digunakan kembali, berbeda dengan kolom kromatografi klasik,
kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan
dengan kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali
untuk berbagai jenis sampel.
e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah, zat-zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah
dan dapat dianalisis secara KCKT.
f) Mekanisme pemisahan lebih variatif, banyaknya pilihan fase gerak dan fase
diam yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan
fase gerak memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.
g) Mudah recovery sampel, umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT
tidak menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa,
sehingga komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah
melewati detektor.
Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi,
KCKT memiliki beberapa kelemahan, yaitu:
a) Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus
b) Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

2.1.2. Jenis-Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada
kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal

4
 dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat
dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada
mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis.Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam
silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini
memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus
hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika
mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat
sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi
secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk
memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan
oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer
digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran
metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang
bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena jika pH
fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase
diam menjadi lebih lemah dibandingkan jika solut dalam bentuk spesies yang
tidak terionisasi, karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih
cepat.
3. Kromatografi penukar ion
HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation
atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di
pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren
resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan
menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal
digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik.
Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi
5
 oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan
kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk
gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada
metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai
muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan
dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat
molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau
polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat
diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang
mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian
molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh
lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati
porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam
pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut
dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul
yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait
dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana
dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat
digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat
kompleks.

2.1.3. Instrument Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase

gerak (Reservoir), pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi),

6
 kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer
atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi
cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

1. Wadah fase gerak (Reservoir)

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada
fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor
sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam
daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut.
Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau
pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran
campuran menuju detektor, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh

7
 karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu
keberhasilan proses pemisahan.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,
Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan
alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa
dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum
dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa
dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor.
Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston
mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya
ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut
yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.
b) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang
dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga
menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik
kolom dan viskositas pelarut.
c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa
jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan
kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir
bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.
8
 3. Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan
dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi.
Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel
volume (misalnya 20 – 500 μL).
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,
sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan
karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang
digunakan pada Kromatografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada
kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan
semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang
terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi
volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis
(dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat
diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam
loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan
masuk ke dalam kolom.
4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam
untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor
Tabung Stainless steel Stainless steel
kolom Panjang 3,10,15,20 dan Panjang 25 dan 50 cm
25 cm Diameter luar 0,25 inci
Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 1 atau 2
Diameter dalam 4,6 cm mm

9
 Fase diam Porous, silika ukuran Porous, silika ukuran kecil,
kecil, silika yang silika yang dimodofikasi
dimodofikasi secara secara kimiawi (bonded
kimiawi (bonded phase), atau polimer-
phase), atau polimer- polimer stiren/divinil
polimer stiren/divinil benzen. Rata-rata diameter
benzen. Rata-rata partikel 3,5 atau 10µm
diameter partikel 3,5 dengan kisaran sempit.
atau 10µm dengan
kisaran sempit.
Tekanan 500-3000 psi 1000-5000 psi
operasional (35-215 bar) (70-350 bar)

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut Hidrokarbon+pelarut

terklorinasi atau alkohol terklorinasi atau alkohol
untuk fase normal. untuk fase normal. Untuk
Untuk fase terbalik fase terbalik (reversed
(reversed phase) phase) digunakan metanol
digunakan metanol atau atau asetonitril + air atau
asetonitril + air atau bufer. Kecepatan alir 10-
bufer. Kecepatan alir : 100 µl/menit. Modifikasi
1-3 ml/menit instrumen
Sistem penghantaran
pelarut yang mampu
memberikan kontrol aliran
di bawah 10µl/menit. Katup
injeksi sampel bervolume
kecil; sel detektor
bervolume kecil.
Kinerja Efisiensi meningkat Sangat efisiensi dan
dengan berkurangnya sensitif, akan tetapi lambat,
ukuran partikel fase konsumsi fase gerak hanya
diam, akan tetapi umur ¼ dari kolom konvensional.

10
 kolom dengan ukuran
partikel 3 µm lebih
pendek.

5. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik,
dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor
fluoresensi, dan elektrokimia.
Karakteristik detector HPLC:
Dasar Jenis Maksimum Peka Sensitivitas
Pendeteksian sensitifitas terhadap suhu
kecepatan
alir
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C
Spektometri Umum 10-10 Tidak Tidak ada
massa
elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

2.2.Kromatografi Cair Vakum

Kromatografi Suction Column atau vacuum liquid chromatography (VLC) atau
kromatografi cair vakum (KCV) adalah bentuk kromatografi kolom khususnya berguna
untuk fraksinasi kasar yang cepat terhadap suatu ekstrak. Kondisi vakum adalah
alternatif untuk mempercepat aliran fase gerak dari atas ke bawah. Metode ini sering
digunakan untuk fraksinasi awal dari suatu ekstrak non polar atau ekstrak semipolar
(Raymond, 2006).

11
 Kromatografi kolom cair dapat dilakukan pada tekanan atmosfer atau pada
tekanan lebih besar dari atmosfer dengan menggunakan bantuan tekanan luar misalnya
gas nitrogen. Untuk keberhasilan praktikan di dalam bekerja dengan menggunakan
kromatografi kolom vakum cair, oleh karena itu syarat utama adalah mengetahui
gambaran pemisahan cuplikan pada kromatografi lapis tipis (Harris, 1982).
Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa
metabolit sekunder secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan
berbagai perbandingan pelarut n-heksana:etil dan asetat:metanol (elusi gradien) dengan
menggunakan pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen (Helfman, 1983).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen
campuran dimana cuplikan berkesetimbangan di antara dua fasa, fasa gerak yang
membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Bila fasa gerak
berupa gas, disebut kromatografi gas, dan sebaliknya kalau fasa gerak berupa zat cair,
disebut kromatografi cair (Hendayana, 1994).
Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas
kering (biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 μm) dalam keadaan vakum agar
diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya
rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai
kering dan sekarang siap dipakai (Hostettman, 1986).
Kromatografi ialah cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan zat-zat
terlarut yang bergerak bersama-sama dengan pelarutnya pada permukaan suatu benda
penyerap. Cara ini umum dilakukan pada pemisahan zat-zat berwarna (Kennedy, 1990).
Kromatografi vakum cair merupakan salah satu jenis dari kromatografi kolom.
Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan campuran larutan dengan
perbandingan pelarut dan kerapatan dengan menggunakan bahan kolom. Kromatografi
kolom lazim digunakan untuk pemisahan dan pemurnian senyawa (Schill, 1978).

2.3. Kromatografi Cair Padat

Kromatografi Cair Padat atau Liquid Solid Chromatography disebut juga
kromatografi penyerapan.
Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik
pemisahan yang masuk golongan ini.

12
2.3.1 Bagan Alat Kromatografi Cair Padat

Keterangan : (a) a solvent inlet filter ; (b) pump ; (c) inline solvent filter ;(d) injection
valve ;(e) precolumn filter ; (f) column ; (g) detector ; (h) recorder ; (i) backpressure
regulator ; and (j) waste reservoir.

2.3.2 Cara Kerja Alat

Pelarut inlet membawa fasa gerak yang kemudian dipompa melalui filter
pelarut inline dan akan melewati katup injeksi. Fasa gerak akan bercampur
dengan sampel yang telah diinjeksikan. Campuran tersebut akan melewati filter
lainnya dan melewati kolom sehingga komponen-komponen sampel akan
terpisah. Detektor akan mendeteksi pemisahan analat dan merekamnya, biasanya
komputer yang akan merekan informasi tersebut. Sampel akan akan ke
backpressure filter dan menjadi waste.

PEMISAHAN YANG TERJADI

13
 MEKANISME PEMISAHAN

Mekanisme pemisahan yang dapat digunakan pada kromatografi cair – padat

ini antara lain :
1. Adsorpsi

Terjadinya pemisahan ialah akibat gaya tarik fasa stasioner yang kuat
terhadap komponen – komponen yang harus dipisahkan. Gaya tarik yang
kuat ini disebabkan oleh interaksi kimiawi dan atau interaksi Van Der Walls.
2. Pertukaran Ion
Pertukaran kation (cation exchange). Pada pertukaran kation, fase
stasioner bermuatan negatif. Pertukaran anion (anion exchange). Pada
pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang
berada pada fase cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama
dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi. Namun jika muatan
pada molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan
membentuk ikatan ionik dengan kolom. Untuk mengelusi molekul yang
menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan pH dan
kekuatan ionik tertentu.
3. Saringan Molekula
4. Reaksi Selektif
Teknik yang dapat digunakan antara lain :
1) Kolom

14
 Digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa berdasarkan adsorpsi
dan partisi. Adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60,
kieselgur, dan Al2O3.
Cara pembuatannya yaitu cara kering dan cara basah.
2) Planar
Kromatografi planar mempunyai dua bentuk, yaitu:
a) Kromatografi kertas
b) Kromatografi lapis tipis

15
 Larutan cuplikan diteteskan pada suatu titik pada permukaan fasa
diam planar. Setelah pelarut menguap, kemudian dikembangkan dengan fasa
gerak melalui permukaan tersebut dalam ruang pengembang.

16
 BAB III

PENUTUP

3.1. Kesimpulan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada
teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam
bentuk cair atau padat.
Kromatografi Suction Column atau vacuum liquid chromatography (VLC) atau
kromatografi cair vakum (KCV) adalah bentuk kromatografi kolom khususnya berguna
untuk fraksinasi kasar yang cepat terhadap suatu ekstrak. Kondisi vakum adalah
alternatif untuk mempercepat aliran fase gerak dari atas ke bawah.
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) ,
pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah
penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam
Cara Kerja Kromatografi padat cair: pelarut inlet membawa fasa gerak yang
kemudian dipompa melalui filter pelarut inline dan akan melewati katup injeksi. Fasa
gerak akan bercampur dengan sampel yang telah diinjeksikan. Campuran tersebut akan
melewati filter lainnya dan melewati kolom sehingga komponen-komponen sampel
akan terpisah.

3.2. Saran

Melengkapi kekurangan-kekurangan di makalah dan memperdalam materi tentang

kromatografi cair.

17
 DAFTAR PUSTAKA

Analisis-kadar-kapsaisn-dari-ekstrak-bon-cabe-dengan-menggunakan-kromatografi-cair-
kierja-tinggi.pdf. Diakses pada 23 Oktober 2017.

[FDA] Food and Drug Administration. 1994. Reviewer Guidance: Validation of

Chromatographic Methods. Rockville: FDA.

Gritter, R. J., Bobbit, J. M., Schwarting, A. E. 1991. Pengantar Kromatografi. Edisi Kedua.
a.b. Kosasih Padmawinata. Universitas Teknologi Bandung: Bandung

Johnson, E. L. and Steven son, R (1978). Basic liquid chromatography. Varian, California

Kromatografi-vakum-cair.pdf. Diakses pada 22 Oktober 2017

Lindsay, S. 1992. High performance liquid chrotomagraphy.second edition, John Wiley

&Sons, Chischer: New York

Sastrohamidjojo,Harjono, 2005, Kromatografi, Universitas Gadjah Mada: Yogyakarta