MAKALAH INSTRUMEN FARMASI

“HPLC (High Performance Liquid Cromathography)”

OLEH :
KELOMPOK 5 : 1. SHAFA NATHASYA AKINA
2. SISI KURNIA LISA
3. SITI QURROTA AKYUNI
4. SRI ISMAWATI
5. SUCI INDAH LESTARI
6. THARISSA RIZKA RAMADHANI

KELAS : REGULER 2B
JURUSAN : D3 FARMASI
DOSEN PENGAMPU : VERA ASTUTI, S.FARM, APT, M.KES

POLITEKNIK KESEHATAN PALEMBANG

JURUSAN FARMASI
2019
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Allah SWT Tuhan semesta alam.Berkat rahmat dan hidayahnya
sehingga makalah ini dapat selesai tepat waktu tanpa kendala. Serta sholawat beriring salam
kepada Rasulullah SAW yang telah membawa manusia keluar dari alam kebodohan menuju
alam yang penuh ilmu pengetahuan.
Terima kasih saya berikan kepada dosen mata kuliah Instrumen Farmasi yang telah
memberikan ilmunya dan berkontribusi besar selama proses praktikum sampai penulisan
makalah ini.Dalam laporan praktikum ini memuat teori, konsep dasar, prinsip kerja,
komponen, kegunaan, dan cara kerja dari instrumen “HPLC (High Performance Liquid
Cromathography)”
Tentunya masih banyak kekurangan di dalam makalah ini.Oleh karena itu, kritik dan
saran yang bersifat membangun sangat diharapkan demi kesempurnaan dikemudian hari.

Palembang, 21 September 2019

Mahasiswa
 DAFTAR ISI

COVER i
KATA PENGANTAR ii
BAB 1 PENDAHULUAN 1
A. LATAR BELAKANG 1
B. RUMUSAN MASALAH 1
C. TUJUAN 2
BAB 2 TINJAUAN 3
A. PENGERTIAN 3
B. KONSEP DASAR 5
C. PRINSIP KERJA 5
D. KOMPONEN ALAT 7
E. KEGUNAAN ALAT 11
F. CARA KERJA ALAT 14
G. CONTOH PROSES PENELITIAN DI BIDANG FARMASI MENGGUNAKAN
HPLC (High Performance Liquid Cromathography)
15
BAB 3 DISKUSI 16
BAB 4 PENUTUP 17
A. KESIMPULAN 17
 BAB 1
PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG
Kromatograf adalah suatu istilah umum yangdigunakan untuk bermacam-
macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa
gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diamyang juga bisa berupa cairan
ataupun suatu padatan.Penemu kromatograf adalah Tswett yang pada tahun1903
mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom
yang berisi kapur (CaSo4).lstilah kromatograf diciptakan oleh Tswett untuk
melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak ke bawah kolom. Pada
waktu yang hampir bersamaan D.T. Day juga menggunakan kromatograf untuk
memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai
penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatograf.
Penyelidikan tentang kromatograf kendor untuk beberapa tahun sampai
digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatograf padatan cair (LSC). Kemudian
pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatograf mulai
berkembang. Dasar kromatograf lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938, oleh
izmailov dan schreiber, dan kemudian diperhalus oleh stahl pada tahun 1958.Hasil
karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka
memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatograf cair tetapi
seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatograf gas dan kromatograf
kertas.Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama
mengenai kromatograf gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun1960 an kromatograf
gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.
Sejarah kromatograf cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas
berdiameter besar, pada dasarya dibawah kondisi atmosfer.Waktu analisis lama dan
segala prosedur biasanya sangat membosankan.Pada akhir tahun 1960 an, semakin
banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatograf cair sebagai suatu teknik
mengimbangi kromatograf gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
atau Kromatograf Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau
Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah
berhasil dikembangkan dariusaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi
 danpengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehinggasulit untuk mempertahankan
suatu bentuk hasil keahlianmembuat instrumentasi dan pengepakan kolom
dalamkeadaan tertentu.Tentu saja, saat ini dengan teknik yangsudah matang dan
dengan cepat KCKT mencapai suatukeadaan yang sederajat dengan kromatograf gas.

B. RUMUSAN MASALAH
1. Apa pengertian HPLC (High Performance Liquid Cromathography) ?
2. Apa konsep dasar HPLC (High Performance Liquid Cromathography)?
3. Apa prinsip kerja HPLC (High Performance Liquid Cromathography)?
4. Apa saja komponen alat HPLC (High Performance Liquid Cromathography)?
5. Apa saja kegunaan alat HPLC (High Performance Liquid Cromathography)?
6. Bagaimana cara kerja HPLC (High Performance Liquid Cromathography)?
7. Apacontoh proses penelitian di bidang farmasi menggunakan HPLC (High
Performance Liquid Cromathography)?

C. TUJUAN
1. Mahasiswa mengetahui pengertian HPLC (High Performance Liquid
Cromathography)
2. Mahasiswa mengetahui konsep dasar HPLC (High Performance Liquid
Cromathography)
3. Mahasiswa mengetahui prinsip kerja HPLC (High Performance Liquid
Cromathography)
4. Mahasiswa mengetahui apa saja komponen HPLC (High Performance Liquid
Cromathography)
5. Mahasiswa mengetahui apa saja kegunaan HPLC (High Performance Liquid
Cromathography)
6. Mahasiswa mengetahui bagaimana cara kerja HPLC (High Performance Liquid
Cromathography)
7. Mahasiswa mengetahui apacontoh proses penelitian di bidang farmasi
menggunakan HPLC (High Performance Liquid Cromathography).
 BAB 2
TINJAUAN

A. PENGERTIAN
Kromatograf adalah suatu istilah umum yangdigunakan untuk bermacam-macam
teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa
berupa gas ataupun cair dan rasa diamyang juga bisa berupa cairan ataupun suatu
padatan.Penemu kromatograf adalah Tswett yang pada tahun1903 mencoba memisahkan
pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur
(CaSo4).lstilah kromatograf diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah
yang berwarna yang bergerak ke bawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan D.T.
Day juga menggunakan kromatograf untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun
Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses
kromatografi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada
teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam
bentuk cair atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan
beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.
Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair
sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas.KCKT adalah kromatografi
cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom
menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.
Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan
performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang
jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase
gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi.Di samping
itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi
dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat
digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi
diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat
dianalisis.Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah
pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan
memainkan peranan lebih besar dalam analisis.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi
lainnya, antara lain :
a) Cepat : waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu analisis
kurang dari 5 menit bisa dicapai.
b) Resolusi tinggi : berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT
karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.
c) Sensitivitas detektor : detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT
dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.
Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
picogram (10-12 gram).
d)kolom dapat digunakan kembali : berbeda dengan kolom kromatografi klasik,
kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan
kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai
jenis sampel.
e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah : zat-zat yang tidak bisa dianalisis
dengan KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat
dianalisis secara KCKT.
f) Mekanisme pemisahan lebih variatif : banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam
yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak
memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.
g) Mudah rekoveri sampel : umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen
sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.
Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT
memiliki beberapa kelemahan, yaitu :
1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus
2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam
analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan
 kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap
dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG.Banyak
senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai
senyawa organik makromolekul.Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat
campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu
menetukan rasemis dan isomer aktif.
Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat
mahal, namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan
obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu
analisis yang cepat.

B. KONSEP DASAR
Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid chromatography
HPLC)merupakan salah satu teknikkromatografi untukzat cair yang biasanya disertai
dengantekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya
untukmemisahkanmolekul berdasarkan perbedaanafinitasnya terhadap zatpadat
tertentu.Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan
fasa diam(stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa
sekaliguskarena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan
fasa geraktertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan
kromatogram.Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

C. PRINSIP KERJA
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai
fasa geraknya.Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah
padaHPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit
akanterpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor
(wakturetensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-
puncaknyaterpisah . Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon : golongan
hidrokarbon :senyawa terhalogenasi : golongan eter : golongan ester : golongan keton :
golonganalkohol : golongan asam.
 Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap
komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif
bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu
sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat
tersebut dalam sample (Riyadi, 2009).

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan
baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif.Analisis kuantitatif dengan
teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam
kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Pada prakteknya,
perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar,
oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva
kalibrasi
Saat ini, HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri
makanan. Kegunaan umum HPLC adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis
senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic,
maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang
strukturnya hamper sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace
elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry, HPLC
merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif maupun kuantitatif

D. KOMPONEN ALAT
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel.Untuk fase normal (fase diam lebih
polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya
polaritas pelarut.Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga
harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama
elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama
elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi
bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks
terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.Pemisahan dengan fase
normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,
Teflon, dan batu nilam.Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir
3 mL/menit.Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa
dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik
yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan
keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

4. Kolom dan Fase diam

 Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam
untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan

kolom konvensional, yakni:
a. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir
fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
b. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
c. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen.Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-
reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran
yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek
lagi lebih sesuai untuk solut yang polar.Silika-silika aminopropil dan
sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak
dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi
yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektor HPLC
 Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik,
dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,
detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil.
c. Stabil dalam pengopersiannya.
d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
e. yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas (kisaran dinamis linier).
f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan

karakteristik detektor seperti berikut :
Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik
(g/ml) linier
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus, paling sering
Spektrofotometer 5 x 10-10 105 digunakan, selektif terhadap
spektrometer photo- > 2 x 10-10 105 gugus-gugus dan struktur-struktur
diode array yang tidak jenuh.
Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus, selektif,
Tidak peka terhadap perubahan
suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal akan
tetapi sensitivitasnya sedang.
Sangat sensitif terhadap suhu, dan
tidak dapat digunakan pada elusi
bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan suhu
Amperometri 10-12 105 dan kecepatan alir fase gerak, tidak
dapat digunakan pada elusi
bergradien. Hanya mendeteksi
solut-solut ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi timbul
masalah dengan adanya
kontaminasi elektroda.
E. KEGUNAAN ALAT
Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang
non polar dibanding dengan fase geraknya).Berdasarkan pada kedua pemisahan ini,
sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase
diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC
sebagai berikut:

1.) Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis.Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan
alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada
silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat
sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2.) Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi
atau fase terikat.Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil.Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau
C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat
krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase
diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak
terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3.) Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak.Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan
pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat
ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan
juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak
dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.
Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus
penukar ion pada resin.

4.) Kromatografi Pasangan ion

 Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik
dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik
ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.2)

5.) Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase
diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut
dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul
solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu,
kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh
lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan
tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan
eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.

6.) Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik.Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap
sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan
antibodi).Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks.

F. CARA KERJA ALAT

1. PREPARASI SAMPEL
• Sampel harus dalam bentuk larutan.
• Untuk skala analisis sampel dalam μL, konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak
boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom. Konsentrasi maksimal adalah sekitar
40 ppm.

2. PREPARASI FASA GERAK

• Fasa gerak (eluen) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC.
Untuk air, digunakan akuabidest.
• Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan millipore kemudian diawagaskan
(didigest) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan udara terlarut.
• Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan, untuk
menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.
• Tabung eluen yang sudah diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang digunakan.

3. PENYALAAN ALAT
• Sebelum alat dinyalakan, pastikan dalam slang penghubung antara tabung eluen
dengan pompa tidak terdapat gelembung udara. Jika terdapat gelembung, buka penutup
pompa kemudian buka katup slang di ujung pompa dan sedot secepatnya gelembung
tersebut dari slang dengan alat penyedot gelembung yang tersedia kemudian tutup katup
dan tutup pompa kembali seperti semula.
• Hubungkan kabel alat ke sumber listrik (saklar).
• Nyalakan tombol paling bawah alat HPLC (tombol detektor).
• Nyalakan tombol tengah HPLC (kolom)
• Nyalakan tombol paling atas dari HPLC (pompa)
• Nyalakan tombol power CPU kemudian tombol power pada monitor.

4. MEMBUKA WINDOWS NT DAN AGILENT CHEMSTATION

• Setelah alat dan komputer menyala, pada layar komputer akan muncul tampilan :
Windows NT workstation version 4.00
Windows NT workstation version 4.00(VGA mode)

5. PENYETABILAN ALAT SEBELUM INJEKSI

Sebelum injeksi, alat yang baru saja dinyalakan harus distabilkan terlebih dahulu untuk
menjaga alat tersebut agar tetap awet, selain itu penyetabilan juga dimaksudkan agar alat
benar-benar siap injeksi sehingga kromatogram yang dihasilkan akan bagus.
Untuk menstabilkan alat, setelah masuk ke menu Online Agilent Chemstation, klik menu
Run Control.Kemudian :
• Klik pada gambar pompa, klik control, klik on.
• Klik menu Instrument, klik pada set up pump
>set gradient fasa gerak
>set laju alir
>set waktu run dan post run
catatan : dalam masa penyetabilan, setting laju alir cukup sekitar 0,1 uL/menit untuk
menghemat eluen.
• Klik pada kolom, klik control, klik on.
• Klik gambar DAD signals,klik control, klik on (pada UV atau Visible), tergantung
sample yang akan diinjeksikan.
• Klik menu Instrument, klik set up colomn untuk mengatur kondisi kolom yang
diinginkan.
• Klik menu Instrument, klik Set Up DAD Signals untuk mengatur panjang gelombang
detektor yang diinginkan. Masukkan panjang gelombang pilihan disertai dengan tanda X.
• Biarkan alat running dalam laju alir sekitar 0,1 uL/menit selama kurang lebih 45-60
menit untuk menstabilkan.
• Setelah waktu tersebut, naikkan perlahan laju alir sampai laju alir yang diinginkan
(jangan langsung pada laju alir yang diinginkan) INGAT ! Naikkan Perlahan....Agar
tekanan pompa stabil...!

6. PERSIAPAN INJEKSI
INGAT.....: TANDA MERAH = ALAT TIDAK SIAP
TANDA BIRU = ALAT SEDANG RUNNING
TANDA HIJAU = ALAT SIAP DIINJEKSI
• Nyalakan detektor DAD dan kolom (seperti tadi)
• Perbesar tampilan kromatogram di layar agar terlihat jelas
• Perhatikan kromatogram sampai terbentuk baseline. Untuk mendekatkan line dengan
jangkauan mata, tekan ADJUST, untuk membuat baseline pada skala nol tekan
BALANCE.
• Setelah baseline yang diinginkan terbentuk, klik menu RUNCONTROL, klik
SAMPLE INFO untuk memasukkan data file-folder berikut keterangan sampel.
• Lihat tanda warna, jika sudah hijau (READY) berarti siap injeksi.
• Sebaiknya kolom dicuci dulu dengan cara menginjeksikan fasa gerak utama ke kolom.
Begitu pula setiap setelah injek satu sampel dan akan ganti dengan sampel lain, kolom
harus dicuci dahulu (sekitar 20 menit), pencucian masukkan ke dalam file CUCI.

7. CARA INJEKSI
• Ambil alat injek (syringe).
• Bilas syringe dengan zat yang sama dengan fasa gerak utama (misalnya metanol)
• Kemudian bilas syringe dengan sampel
• Isi syringe dengan sampel, INGAT dalam syringe yang sudah diisi tersebut tidak
boleh ada ruang kosong oleh udara yang terperangkap atau gelembung udara
• Volume injeksi maksimum adalah 20 uL karena pada injektor standar terpasang loop
20 uL
• Masukkan jarum syringe ke injektor, buka injektor (load, putar ke atas), injek cepat,
tutup injektor (inject, putar ke bawah), baru tarik jarum syringe dari injektor. Di layar
segera akan ada tanda biru...Run in progress data aquasition.........
• Setelah waktu running yang diinginkan habis, tekan tombol F8 untuk menghentikan
runing. Maka komputer akan segera menghitung tinggi puncak-puncak yang keluar
berikut luas puncaknya. Pada proses ini di layar akan muncul tampilan biru dengan
tulisan...”Run in Progress Data Analysis”.
• Setelah di layar muncul kembali tampilan “Ready” (hijau), maka pekerjaan
selanjutnya dapat dilakukan. Untuk menginjeksikan kembali sampel lain sebaiknya
kolom dicuci terlebih dahulu. Masukkan running cuci kolom ke dalam file cuci.

8. PRINT OUT KROMATOGRAM

• Untuk melihat hasil analisis yang telah dilakukan komputer terhadap sampel yang
telah kita injeksikan, klik menu VIEW, Klik DATA ANALYSIS.
• Kemudian Klik menu FILE dan klik LOAD SIGNALS untuk memilih file mana yang
akan dibuka beserta panjang gelombang deteksi yang diinginkan. Segera akan keluar
tampilan kromatogram yang dipanggil.
• Untuk menampilkan waktu retensi setiap puncak pada kromatogram yang dipanggil
tersebut, Klik menu INTEGRATION lalu klik INTEGRATE. Maka segera akan muncul
nilai retensi dari setiap puncak. Karena detektor yang ada yaitu DAD (Diode Arays
Detector) sangat sensitif, maka setiap puncak yang muncul, sekecil apapun akan dapat
terintegrasi sehingga puncak-puncak ini harus dihapus retensinya, artinya yang kita
tampilkan waktu retensinya hanya puncak-puncak yang besar dan yang kita perlukan
saja. Untuk keperluan tersebut, klik menu FILE, klik DELETE PEAK sampai muncul
tanda X merah.Atau dapat langsung klik di menu X merah yang biasanya ada di
layar.Untuk menghapusnya, klik dengan X merah tersebut di tempat-tempat yang waktu
retensinya tidak ingin ditampilkan.
• Untuk mendapatkan print out kromatogram, Klik menu REPORT, klik SPECIFY
REPORT untuk mengatur tampilan kromatogram yang diinginkan. Setelah siap, klik
 PRINT REPORT lalu tunggu sebentar sampai komputer menampilkan print previewnya.
Kemudian klik pada icons PRINT yang ada di bawah print preview kromatogram.
• Untuk kembali ke RUN CONTROL (misal akan injek baru), klik menu VIEW, klik
METHOD AND RUN CONTROL.

Pilih menu yang pertama (Windows NT workstation version 4.00) secepatnya, kemudian
tekan ENTER.
• Kemudian akan muncul menu Begin Log On, tekan Ctrl-Alt-Del.
• Setelah itu akan muncul menu PassWord, pada password ini tidak perlu diisi apa-apa,
langsung klik OK. Perhatian...DILARANG MEMASANG PASSWORD PADA
PENGOLAH DATA !
• Kemudian akan muncul menu Server NT...., klik No
• Selanjutnya akan sampai di menu utama MS-Windows NT, double klik pada menu
Instrument 1 Online.
Catatan : Menu Instrument 1 Offline digunakan untuk keperluan pengolahan data tanpa
penyalaan alat (yang dinyalakan hanya perangkat komputernya saja). Menu ini misalnya
digunakan untuk print out kromatogram yang belum sempat dilakukan atau untuk
melakukan print ulang kromatogram yang sudah ada.
• Kemudian tunggu sampai masuk ke menu Online Agilent Chemstation.

G. CONTOH PROSES PENELITIAN DI BIDANG FARMASI MENGGUNAKAN

HPLC (High Performance Liquid Cromathography)
 BAB 3
DISKUSI
 BAB 4
PENUTUP
A. KESIMPULAN
Kromatograf adalah suatu istilah umum yangdigunakan untuk bermacam-
macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa
gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diamyang juga bisa berupa cairan
ataupun suatu padatan.Penemu kromatograf adalah Tswett yang pada tahun1903
mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom
yang berisi kapur (CaSo4).lstilah kromatograf diciptakan oleh Tswett untuk
melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak ke bawah kolom. Pada
waktu yang hampir bersamaan D.T. Day juga menggunakan kromatograf untuk
memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai
penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatograf.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:

1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)
 DAFTAR PUSTAKA

http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

http://duniachemistry.blogspot.com/2016/01/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-kckt_53.html

http://rasyidel.blogspot.com/2013/03/hplc-high-performance-liquid.html

https://www.academia.edu/24575160/MAKALAH_KIMIA_ANALISIS_KROMATOGRAFI_CAIR_KINERJA

_TINGGI_KCKT_