BUKU PANDUAN PRAKTIKUM MAHASISWA (BPPM)

MIKROBIOLOGI
BLOK THEURAPEUTIK KEDOKTERAN GIGI (BLOK 3)

PENYUSUN

DRH. SANTI CHISMIRINA, M.Si

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER GIGI

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI
UNSYIAH
 LEMBAR PENGESAHAN

1. Judul Modul Praktikum : Mikrobiologi Blok Theurapeutik Kedokteran Gigi (Blok 3)

2. Penyusun Modul : drh. Santi Chismirina, M.Si

Menyetujui, Banda Aceh, 15 November 2019

Ketua Program Studi Kepala Bagian Biologi Oral

Pendidikan Dokter gigi

(drg. Sunnati, Sp.Perio) (drg. Ridha Andayani, M.Si)

NIP. 197907052006041002 NIP. 196809151999032001

Mengetahui,

Dekan Fakultas Kedokteran Gigi

(Dr. drg. Cut Soraya, Sp.KG, M.Pd)

NIP. 196612281993122001
 KATA PENGANTAR

Assalamualaikum Warahmatullahi Wabarakatu.

Puji syukur kepada Allah SWT, bahwa pada akhirnya penyusun dapat menyelesaikan
pembuatan Buku Panduan Praktikum Mahasiswa Mikrobiologi Blok Theurapeutik dan
Radiologi (Blok 3) untuk digunakan sebagai panduan praktikum Mikrobiologi mahasiswa
Program Studi Dokter Gigi FKG Unsyiah.

Buku Panduan Praktikum Mahasiswa ini disusun berdasarkan kompetensi tentang

Mikrobiologi Umum yang harus dimiliki oleh mahasiswa program S1 FKG Unsyiah yang
mengikuti Blok 3. Penyusun membuat buku ini sebagai sumbangsih penyusun sebagai
Kepala Lab dan staf pengajar di bagian Biologi Oral dengan harapan buku ini dapat
membawa manfaat walaupun sedikit bagi mahasiswa dan fakultas. Dengan adanya Buku
Panduan Praktikum Mahasiswa ini diharapkan mahasiswa dapat melaksanakan proses
praktikum dengan lancar sehingga pemahaman akan teori-teori yang dipelajari dapat tercapai
dengan baik. Buku ini hanya digunakan untuk lingkungan pendidikan Kedokteran Gigi di
FKG Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh serta tidak diperjualbelikan ataupun diperbanyak
tanpa izin penyusun.

Akhir kata, dengan tulus penyusun menyampaikan ucapan terimakasih yang sedalam
dalamnya kepada pihak pimpinan FKG Unsyiah dan teman teman staf pengajar di bagian
Biologi Oral FKG Unsyiah atas motivasi yang diberikan sehingga penyusun dapat
menyelesaikan penyusunan Buku Panduan Praktikum ini. Penyusun menyadari bahwa buku
panduan ini masih sangat banyak kekurangan, oleh karena itu dengan segala kerendahan hati
dan tangan terbuka penyusun mengharapkan saran dan masukan untuk dijadikan bahan
dalam menyempurnakan buku penuntun ini. Wassalam.

Penyusun

Santi Chismirina
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar
Daftar Isi
Tata Tertib Praktikum
Format Laporan Praktikum
Materi I. Pengenalan Alat Mikrobiologi
Materi II. Metode Aseptis dan Sterilisasi
Materi III. Penyiapan dan Pembuatan Medium
Materi IV. Kultur dan Transfer Kultur Mikroba
Materi V. Isolasi dan Enumerasi Mikroba, serta Preservasi Kultur Mikroba
Materi VI. Morfologi Jamur dan Bakteri
Materi VII. Uji Potensi Senyawa Antimikroba
Materi VIII. Teknik Dasar Biologi Molekuler
Daftar Pustaka
 TATA TERTIB PRAKTIKUM

A. Tata Tertib Praktikum

1. Praktikan (mahasiswa peserta praktikum) wajib hadir pada saat praktikum. Apabila
terlambat 15 menit tanpa alasan yang jelas, tidak diperkenankan mengikuti praktikum
pada hari itu.
2. Praktikan diharuskan memakai jas praktikum berwarna putih yang bersih
(sebelum memasuki laboratorium) untuk menghindari kontaminasi, nametag di dada
sebelah kiri dan dilarang memakai sandal.
3. Setiap praktikan harus mempelajari dan memahami teori dan prosedur kerja
sebelum praktikum berlangsung.
4. Responsi akan dilaksanakan sebelum memulai praktikum
5. Dilarang keras makan, merokok dan minum di laboratorium
6. Praktikan dilarang berbicara yang tidak perlu dan membuat gaduh
7. Sebelum dan sesudah bekerja, meja praktikum dibersihkan dengan desinfektan
8. Praktikan harus menggunakan alat pelindung berupa sarung tangan (handscoon) dan
masker pada saat pengambilan dan penimbangan media, inokulasi mikroba, isolasi
mikroba dan perlakuan yang berhubungan dengan mikroba
9. Setiap mahasiswa harus bertanggung jawab atas alat-alat yang dipinjam dari fakultas.
Kerusakan yang terjadi harus segera dilaporkan kepada instruktur yang bertugas.
Apabila kerusakan terjadi karena kesalahan mahasiswa, maka harus mengganti
dengan yang sejenis. Alat/bahan dipakai bersama yang hilang harus diganti oleh grup
yang bekerja pada waktu itu.
10. Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa disembarang
tempat. Bahan tersebut harus dibuang di tempat yang telah disediakan
11. Laporkan segera jika terjadi kecelakaan seperti kebakaran, biakan tumpah,
instruktur
12. Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk mencuci tangan dengan
seksama.
13. Untuk pelanggaran terhadap setiap butir tata tertib ini akan dikenakan sanksi sebagai
berikut :
1. Peringatan.
2. Tidak diperkenankan mengikuti praktikum pada hari itu.
3. Tidak diperkenankan mengikuti praktikum sampai waktu yang ditentukan.

B. Tata Tertib Ujian Praktikum : Setiap mahasiswa diwajibkan mengikuti semua ujian
pada waktu yang telah ditentukan.
 FORMAT LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
BLOK THERAPEUTIKDAN RADIOLOGI
(BLOK 3)

I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
1.2. Tujuan Praktikum
II. TINJAUAN PUSTAKA
III. PELAKSANAAN PRAKTIKUM
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
V. KESIMPULAN
VI. DAFTAR PUSTAKA (disesuaikan dengan pustaka yang digunakan pada latar
belakang)

Note : Laporan dibuat sesuai dengan materi yang dilaksanakan

 PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI BLOK THERAPEUTIK KEDOKTERAN GIGI
(BLOK 3)

A. DESKRIPSI
Mata kuliah ini mencakup prinsip analisis dasar mikrobiologi seperti metode aseptis
dan sterilisasi, teknik isolasi, kultivasi, dan preservasi kultur mikroba, teknik enumerasi
mikroba, teknik identifikasi mikroba, dan faktor pertumbuhan mikroba. Praktikum ini juga
mencakup prinsip penggunaan alat instrumen diantaranya mikroskop.

B. TUJUAN INSTRUKSIONAL UMUM

Setelah menyelesaikan praktikum mikrobiologi, mahasiswa mampu mengetahui dan
melakukan masing-masing prinsip dasar dan teknik dasar analisis mikrobiologi yang
meliputi metode aseptis dan sterilisasi, teknik isolasi, kultur, dan preservasi kultur mikroba,
teknik enumerasi mikroba, teknik identifikasi mikroba, serta kurva pertumbuhan mikroba.

C. MATERI PRAKTIKUM
1. Pengenalan alat mikrobiologi
2. Metode aseptis dan sterilisasi
3. Penyiapan dan Pembuatan Medium
4. Teknik kultur, isolasi, dan preservasi mikroba
5. Teknik enumerasi mikroba
6. Identifikasi dan karakterisasi mikroba

D. PENILAIAN HASIL BELAJAR

1. Pre Test / Post Test
2. Aktivitas Praktikum
3. Laporan
 MATERI I
PENGENALAN ALAT MIKROBIOLOGI

Kompetensi :
1. Mahasiswa mengenal dan mengetahui fungsi alat-alat yang umum digunakan pada
praktikum mikrobiologi
2. Mahasiswa mampun menggunakan alat-alat yang umum digunakan pada praktikum
mikrobiologi

Pendahuluan
Praktikum Mikrobiologi merupakan praktikum yang berhubungan dengan mikroba
sehingga memerlukan beberapa alat yang mendukung pelaksanaannya seperti autoclave,
mikroskop, dll. Berikut beberapa alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal :
mikroskop, autoclave, cawan petri, tabung reaksi, gelas Beaker, Erlenmeyer, gelas ukur,
mikropipet, lampu Bunsen, batang L, jarum inokulum, pinset, skalpel, pH indikator
universal.

Mikroskop

Keterangan :
1. Lensa okuler, untuk memperbesar bayangan yang
dibentuk lensa objektif
2. Revolving (pemutar lensa objektif), untuk
memutar lensa objektif sehingga mengubah
perbesaran
3. Ttabung pengamatan/tabung okuler
4. Stage (meja benda), spesimen diletakkan di sini
5. Condenser untuk mengumpulkan cahaya supaya
tertuju ke lensa objektif
6. Lensa objektif), untuk memperbesar spesimen
7. Brightness adjustment knob (pengatur
kekuatan lampu), untuk memperbesar dan
memperkecil cahaya lampu
8. Tombol on-off
9. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter)
Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan
kiri
10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur
jarak interpupillar
11. Specimen holder (penjepit spesimen)
12. Illuminator (sumber cahaya)
13. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal)
Untuk menaikkan atau menurunkan object glass
 14. Horizontal feed knob (sekrup pengatur
horizontal) Untuk menggeser ke kanan / kiri
objek glas
15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar)
Menaik turunkan meja benda (untuk mencari
fokus) secara kasar dan cepat
16. Fine focus knob (sekrup fokus halus)
Menaik turunkan meja benda secara halus dan
lambat
17. Observation tube securing knob (sekrup
pengencang tabung okuler)
18. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur
kondenser) untuk menaik-turunkan kondenser.

Autoclave

Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang
digunakan dalam mikrobiologi, menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang

digunakan pada umumnya 1,5 atm - 2 atm dengan suhu 121oC dan lama sterilisasi yang
dilakukan biasanya 15-20 menit.

Oven (hot air sterilizer)

 Oven adalah alat untuk mensterilkan alat-alat dari kaca yang digunakan dalam

mikrobiologi, menggunakan udara kering. Suhu 170-180oC dan lama sterilisasi yang
dilakukan biasanya 1,5-2 jam.
Cara Pemakaian :
1. Masukkan alat-alat yang telah siap ke dalam oven
2. Tutup oven dan tutup tombol pengatur tekanan dan nyalakan tombol
3. Atur suhu pada termometer dengan cara memutar pengatur suhu sesuai suhu oven
4. Hitung waktu sterilisasi selama 1,5-2 jam dan dimulai ketika suhu sudah
0
mencapai 170-180 C
5. Matikan tombol setelah 1,5-2 jam, tunggu sampai suhu turun dan oven
dingin selanjutnya alat-alat dapat dikeluarkan.

Timbangan/Neraca analitik
Alat untuk mengukur berat (terutama yang berukuran kecil) atau alat untuk
menimbang suatu zat. alat ini biasanya diletakkan di laboratorium sebagai alat ukur
dalam kegiatan penelitian. Alat penghitung satuan massa suatu benda dengan teknik digital
dan tingkat ketelitian yang cukup tinggi. Prinsip kerjanya yaitu dengan penggunaan sumber
tegangan listrik yaitu stavolt dan dilakukan peneraan terlebih dahulu sebelum digunakan
kemudian bahan diletakkan pada neraca lalu dilihat angka yang tertera pada layar, angka itu
merupakan berat dari bahan yang ditimbang.

Alat ini berfungsi untuk menimbang bahan yang akan digunakan pada pembuatan
media untuk bakteri, jamur atau media tanam kultur jaringan dan mikrobiologi dalam
praktikum dengan tingkat ketelitian yang tinggi. Komposisi penyusun media yang tidak tepat
akan berpengaruh terhadap konsentrasi zat dalam media sehingga dapat menyebabkan
terjadinya kekeliruan dalam hasil praktikum.
Kekurangan neraca analitik : Alat ini memiliki batas maksimal yaitu 1 mg, jika melewati
batas tersebut maka ketelitian perhitungan akan berkurang, tidak dapat menggunakan
sumber tegangan listrik yang besar, sehingga harus menggunakan stavolt. Jika tidak, maka
benang di bawah pan akan putus.

Kelebihan neraca analitik : Memiliki tingkat ketelitian yang cukup tinggi dan dapat
menimbang zat atau benda sampai batas 0,0001 g atau 0,1 mg, penggunaannya tidak begitu
rumit jika dibandingkan dengan timbangan manual.

Cawan Petri (Petri Dish) dan Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube)
a b

a. Cawan Petri; berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroba. Medium dapat dituang
ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia
dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat
menampung media sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira
cukup diisi media sebanyak 10 ml.

b. Tabung reaksi; dalam Mikrobiologi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan

menumbuhkan mikroba.Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup
tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil. Media
padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut
fungsinya, yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring (slants agar). Untuk
membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas
permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan
hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko
kontaminasi.
Lampu Bunsen (Pembakar Spiritus)

Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah
pembakar Bunsen. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen
dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran
udara tersebut. Untuk sterilisasi jarum Ose atau yang lain, bagian api yang paling
cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas). Lampu
Bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas, alkohol, spiritus.

pH Meter Digital

Berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan. Hal ini sangat penting

dalam pembuatan media karena pH pada medium berpengaruh terhadap petumbuhan
mikroba. pH meter harus dikalibrasi setiap akan dan telah digunakan untuk setiap larutan
yang diukur pH.
Cara Kalibrasi pH meter digital :
1. Langkah pertama sebelum melakukan proses kalibrasi, siapkan terlebih dahulu alat dan
bahan berikut ini:
- Akuades (air suling)
- 3 buah gelas kimia kapasitas minimal 250 ml
 - Botol semprot/handsprayer
- Tissue
- Gelas ukur (beaker)
- Buffer/larutan penyangga pH 4, dan 7 (6.86)
- Sendok
2. Tandai masing-masing gelas, misalnya gelas A untuk pH 6 (Mixed phosphate, pH
6,86), gelas B untuk pH 4 (Potassium Hydrogen Phthlate, pH 4,00) dan gelas C untuk
cairan pembilas
3. Selanjutnya 3 buah gelas kimia (gelas A, B dan C) diisi akuades dengan temperatur suhu
ruangan
4. Larutkan pH buffer Mixed phosphate (pH = 6,86) pada gelas A, dan Potassium
Hydrogen Phthlate (pH = 4,00) pada gelas B
5. Rendam beberapa saat bagian elektroda pH meter pada gelas C, kemudian keringkan
dengan tissue.

Gambar : Skrew/baut pemutar pada pH Meter

6. Nyalakan pH meter (tekan tombol “on“) dan celupkan bagian elektrodanya pada gelas
A (larutan Mixed phosphate, pH = 6,86). Diamkan beberapa saat sampai angka yang
terbaca di layar stabil. Jika angka pada layar tidak sama dengan 6.86, gunakan obeng
kecil untuk mengatur angka dengan memutar kekiri atau kekanan skrew yang ada
dibagian belakang pH meter sampai layar menunjukkan angka 6.86. (Lihat gambar di
atas)
7. Selanjutnya matikan pH meter (tekan tombol “off) kemudian elektroda pH meter dibilas
dengan mencelupkan ke gelas C selama beberapa saat. Kemudian elektroda pH meter
dikeringkan menggunakan tissue sampai benar-benar kering.
8. Berikutnya, nyalakan kembali pH meter dan aduk larutan buffer pada gelas B
(larutan Potassium Hydrogen Phthlate, pH = 4,00), rendam selama beberapa saat
 elektroda pH meter. Diamkan beberapa saat sampai angka di layar stabil, jika angka
yang terbaca dilayar tidak sama dengan 4,00. Gunakan kembali obeng kecil dengan cara
yang sama pada langkah (6).
9. Langkah terakhir adalah membilas elektroda pH meter dengan mencelupkan pada gelas
C. Keringkan menggunakan tissue sampai benar-benar kering, proses kalibrasi sudah
selesai dan pH meter siap digunakan.

Cara Merawat dan Pemeliharaan pH Meter Agar Tahan Lama

Bagian paling penting pada sebuah pH meter adalah bagian elektroda, untuk itu
pemeliharaan dan perawatan elektroda harus dilakukan dengan benar agar pH meter selalu
dalam kondisi baik dan layak untuk digunakan. Jika tidak dilakukan pemeliharaan dengan
benar, dapat dipastikan usia pH meter tidak akan lama. Berikut ini cara merawat pH meter
digital :
1. Sebelum dan sesudah digunakan cucilah elektroda pH meter menggunakan cairan
khusus yang memiliki pH 0 yaitu elektrolit (KCL 3 M)
2. Pastikan elektroda benar-benar kering jika tidak digunakan (selama dalam
penyimpanan)
3. Simpan pH meter didalam box pada tempat yang bersih dan aman
4. pH meter disimpan pada suhu ruangan dan tidak lebih dari 50C
5. Lakukan kalibrasi secara berkala, jika pH meter digunakan selama 24 jam non stop,
minimal kalibrasi dilakukan setiap 8 jam.
6. Pastikan pH meter dalam kondisi “off” jika tidak digunakan.
7. Buka baterai jika pH meter akan disimpan dalam jangka waktu yang lama.
8. Penutup elektroda harus terpasang dengan baik dan benar.

Pinset dan Skalpel

a b
a. Pinset; memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk mengambil benda dengan
menjepit, menjepit bahan yang akan diisolasi mikrobanya.
b. Skalpel; berfungsi untuk mengiris, memotong, menyayat inang, bagian inang yang akan
diisolasi mikrobanya.

Jarum Inokulum dan Batang L (L Rod)

a b

a. Batang L; bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan agar supaya bakteri yang
tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata. Alat ini juga disebut spreader.
b. Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan yang akan
ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat
nikrom atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum
dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop, dan
yang berbentuk lurus disebut inokulating needle/Transfer needle. Inokulating loop cocok
untuk melakukan streak di permukaan agar, sedangkan inoculating needle cocok
digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating).

Inkubator

Alat ini digunakan untuk inkubasi media yang telah ditanami mikrobaa dan untuk
menyimpan bahan pemeriksaan di mana mikroba yang terkandung akan mati bila disimpan dalam
lemari es.
Lemari Pendingin/Refrigerator
Digunakan untuk menyimpan media steril yang siap pakai agar isi dan mutu media tersebut
tidak berubah, menyimpan untuk sementara waktu bahan/spesimen yang belum sempat
diperiksa agar tidak mengalami perubahan dan menyimpan cakram antibiotik/antibiotic disk
yang belum dipakai agar tidak mengalami perubahan.

Erlenmeyer, gelas Beaker dan gelas ukur

a b c d

a. Erlenmeyer; berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan yang. Erlenmeyer
dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan komposisi media,
menampung akuades, kultivasi mikroba dalam kultur cair, dll.
b. Gelas Beaker; merupakan alat yang memiliki banyak fungsi, pada mikrobiologi, dapat
digunakan untuk preparasi media, menampung akuades dll.
c. Gelas ukur; berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer,
gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. Pada saat mengukur
volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung
larutan (d).

Mikropipet dan Tip

Mikropipet adalah alat untuk memindahkan/mengambil cairan yang bervolume
cukup kecil, biasanya kurang dari 1000 μl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet,
misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette)
antara 1μl sampai 20 μl, atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya, hanya tersedia
satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 μl. dalam penggunaannya,
mikropipet memerlukan tip
Cara Pemakaian :
1. Sebelum digunakan, thumb knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan
lancarnya mikropipet.
2. Masukkan/Pasang tip bersih ke dalam nozzle / ujung mikropipet .
3. Tekan thumb knob sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan lebih ke
dalam lagi dapat menyebabkan cairan yang diambil masuk ke tabung pipet yang
menyebabkan keakuratan pipet berkurang dan bahkan rusak.
4. Tahan pipet dalam posisi vertikal masukkan tip ke dalam wadah yang berisi larutan yang
akan dipipet sampai ujung tip terbenam dalam cairan.
5. Kemudian lepaskan tekanan dari thumb knob maka cairan akan masuk ke dalam tip.
6. Pindahkan pipet yang ujung tipnya telah berisi cairan ke tempat penampung (tube
sentrifuge 1,5 μl) .
7. Tekan thumb knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan semaksimal
mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip.
8. Jika ingin melepas tip maka tekan ke bawah tombol di depan thumb knob sampai tip
terdorong terlepas dari pipet.

Vortex

Digunakan untuk menghomogenkan sampel

Praktikum 1. Lakukan praktek tentang:
a. Cara memegang dan membuka petridisc
b. Cara membuka dan menutup tabung reaksi
c. Cara mengukur volume larutan dengan menggunakan gelas ukur

Praktikum 2 : Lakukan praktek tentang

a. Cara menggunakan dan kalibrasi pH meter
b. Cara menggunakan timbangan digital
c. Cara menggunakan pipet mikro
 MATERI II

METODE ASEPTIS DAN STERILISASI

Kompetensi :
1. Mahasiswa mengetahui dan memahami prinsip kerja steriilisasi alat-alat mikrobiologi
2. Mahasiswa dapat melakukan melakukan kerja aseptis
3. Mahasiswa mampu mempersiapkan alat dan bahan yang akan disterilisasi dengan autokaf
4. Mahasiswa mampu melakukan sterilisasi alat, media mikroorganisme, dan bahan yang
digunakan dalam uji mikrobiologi dengan menggunakan autokaf
5. Mahasiswa mampu melakukan sterilisasi dengan sonar UV, nyala api langsung, alkohol,
sabun.

2.1. Metode Aseptis

Di laboratorium mikrobiologi terdapat banyak mikoorganisme pathogen, karena itu
setiap pekerjaan yang dilakukan di lab harus aseptik untuk mencegah kontaminasi ruangan
personil dan mikroba murni dengan mikroorganisme. Teknik aseptik adalah suatu metoda
atau teknik di dalam memindahkan atau menstranfer kultur bakteria dari satu tempat ke
tempat lain secara aseptis (steril) agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba. Teknik
transfer aseptis ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur microbial yang harus
diketahui oleh seorang yang hendak melakukan analisis mikrobiologi.
Sebelum memulai praktikum mikrobiologi terlebih dahulu harus diketahui cara
memindahkan mikroba secara aseptis. Beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah :
1. Seluruh material dan media yang akan digunakan berhubungan langsung dengan
mikroba harus disterilkan terlebih dahulu
2. Area tempat bekerja harus dijaga agar tidak terkontaminasi dengan mikroba yang
digunakan.
3. Jangan menggunakan ose yang belum steril untuk menyentuh atau mengambil mikroba
untuk atau dari kultur. Hal ini bertujuan untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Ose
yang telah selesai digunakan harus disterilkan.
4. Mulut tabung harus dipanasi baik pada saat ose dimasukkan atau saat dikeluarkan
dari tabung. Pemanasan pertama ditujukan untuk mencegah masuknya udara luar
yang membawa partikel debu masuk ke dalam tabung, sedang pemanasan kedua
 ditujukan untuk membakar sel-sel yang jatuh atau menempel pada mulut tabung saat
ose dimasukkan atau ditarik.
5. Diusahakan tabung dalam kondisi terbuka dalam waktu yang sesingkat-singkatnya.
6. Dihindari menempatkan tutup tabung pada permukaan area pekerjaan atau
menyentuhnya.
7. Diusahakan agar tutup tabung tidak bersinggungan dengan sumber kontaminan.

2.2. Sterilisasi
Alat dan bahan yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus
disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari
semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua
organisme yang terdapat pada suatu benda. Hal tersebut dilakukan untuk menghilangkan
mikroba dari kontaminan, sehingga bahan dan semua alat laboratorium steril.
Ada beberapa macam sterilisasi yang dapat dipilih dan disesuaikan dengan sifat
bahan yang akan disterilkan. Secara umum sterilisasi dibedakan menjadi 3 t e k n i k yaitu:
a. Secara mekanik (filtrasi); sterilisasi dengan menggunakan suatu saringan (filter) yang
berpori sangat kecil (0.22 µ atau 0.45 µ) sehingga mikroba tertahan pada saringan
tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan
enzim dan antibiotik.
b. Secara fisik; sterilisasi dengan menggunakan pemanasan, penggunaan sinar UV, sinar
X dan sinar-sinar yang panjang gelombangnya pendek.
c. Secara kimiawi; sterilisasi dengan menggunakan bahan-bahan kimia, seperti alkohol,
desinfektan, larutan formalin, dan lain-lain.

2.2.1. Sterilisasi Mekanik : Sterilisasi Dengan Membrane Filter

Bahan-bahan yang tidak boleh dipanaskan, seperti serum dan beberapa macam gula
tertentu dapat disterilkan dengan menggunakan membran filter. Dalam bidang
mikrobiologi, alat penyaring yang paling banyak dipergunakan adalah filter berkerfield,
filter chamberland, filter seilz, dan lain-lain. Filter-filter ini terbuat dari polimer khusus
dengan diameter 0,45 mikron, sehingga dapat menahan bakteri yang terkandung dalam
sampel.
Alat dan bahan :
a. Polisulfon membran dengan diameter 0,22 mikron (hidrofilik)
b. Satu set alat percobaan membran lengkap dengan regulator gas.
c. Cawan petri
d. Botol McCartney
e. Gun pipet lengkap dengan tipsnya
f. Medium NA tegak
g. Saliva

Cara kerja :
a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan biarkan pada temperatur 40 oC.
b. Saringlah sejumlah saliva dengan menggunakan membran polisulfon.
c. Pipet sebanyak 1 ml. Saliva hasil saringan ini dan tempatkan ke dalam cawan petri
d. Sebagai kontrol, pipet 1 ml saliva yang tidak disaring dan tempatkan pada
cawan petri kedua.
e. Tuangkan masing-masing satu tabung medium NA (suhu 40 oC) ke dalam
masing-masing cawan petri yang sudah berisi sampel saliva.
f. Goyang kedua cawan sedemikian rupa sehingga sampel menjadi homogen
dengan medium, dan biarkan membeku.
g. Inkubasi kedua cawan petri tersebut pada suhu 20-30 oC selama 24-48 jam.
h. Amati kedua cawan petri !!. Kesimpulan apa yang dapat anda ambil dari
percobaan ini

2.2.2. Sterilisasi Fisik

2.2.2.1. Sterilisasi dengan pemanasan

a. Pemanasan dengan udara kering atau udara basah
Cara ini sangat cocok untuk mensterilkan alat-alat atau bahan-bahan yang tahan panas.
Dalam cara ini, temperatur yang dipakai adalah 170 oC dan dilakukan selama 1 jam.
b. Tindalisasi
Cara ini dipakai untuk mensterilkan bahan-bahan yang tidak tahan suhu tinggi. Dalam
cara ini, bahan dan alat dipanaskan selama 30 menit pada suhu 100 oC, dan diulang
sebanyak 3 kali berturut-turut, dengan selang waktu 1 hari. Bahan dan alat disimpan
pada suhu kamar pada saat tidak dipanaskan.
c. Pasteurisasi
Cara ini dipakai untuk mensterilkan bahan makanan yang akan mengalami denaturasi
pada suhu tinggi. Dengan cara ini, alat dan bahan dipanaskan pada suhu 60 - 80 oC
selama satu jam sebanyak 3 kali berturut-turut, dengan selang waktu 1 hari.
d. Sterilisasi dengan nyala api langsung.
Cara ini sangat cocok untuk mensterilkan jarum inokulasi (ose). Cara kerja:
- Nyalakan lampu spiritus
- Ambil ose dan bakar ujung ose dengan api lampu spiritus sampai berpijar (warna
biru)
e. Sterilisasi dengan uap panas yang bertekanan
Cara ini umum dipakai untuk mensterilkan alat dan bahan yang tahan panas tinggi dan
tekanan. Alat yang dipakai adalah autoclave yang dapat mencapai suhu 121 oC dan
tekanan 15 lbs.

2.2.2.2. Sterilisasi dengan radiasi

A. Sterilisasi dengan Autoclave Elektrik
Dalam praktikum ini akan dilakukan sterilisasi alat terbuat dari kaca dan medium
padat dengan menggunakan autoclave elektrik. Pada praktikum ini mahasiswa
mempersiapkan alat-alat dan bahan yang akan disterilkan dengan cara membungkus alat-
alat tersebut dengan menggunakan alumium foil atau kertas bekas setelah alat-alat tersebut
dicuci terlebih dahulu dan dikering anginkan.
Alat :
- Autoklaf listrik
- Glass ware (cawan petri, tabung reaksi, erlemayer)
Bahan :
- Akuabides
- Kapas
- Kertas
- Plastik PE
- Karet
Cara Kerja :
a. Persiapan peralatan dari gelas (glass ware) yang akan disterilisasi
1. Siapkan alat gelas (tabung reaksi, erlenmeyer, cawan petri) yang sudah dicuci bersih dan
dikeringkan
2. Buatlah penutup dari kapas steril untuk tabung reaksi dan erlenmeyer. Pastikan kapas penutup
tergulung sempurna dan tidak mudah rusak saat penutup dibuka. Kapas penutup harus bisa
menutup alat gelas hingga tidak ada udara yang bisa masuk. Bungkus kapas penutup dengan
kertas kedap air.
3. Bungkus cawan petri dengan kertas kedap air dan pastikan posisinya dibalik agar tidak ada uap
air yang masuk selama sterilisasi.
4. Bungkus semua alat dengan plastik PE dan pastikan tidak ada udara yang ada dalam platik
kemudian ikatlah plastik dengan karet dan masukkan ke dalam keranjang autoklaf.

b. Cara Penggunaan Autoklaf Listrik

A. Persiapan
1. Letakkan Autoclave Hirayama HVE 50 pada permukaan yang stabil dan rata dan
hindarkan dari sinar matahari secara langsung.
2. Hubungkan stop kontak dengan sumber tenaga listrik.
3. Tekan tombol “ON” yang ada di sisi kanan.
B. Pengoperasian
1. Tekan POWER ON/OFF untuk menghidupkan dan mematikan mesin autoclave
2. Sebelum melakukan sterilisasi, cek dahulu banyaknya air ( A k u a b i d e s ) dalam
autoclave (2 liter) dengan cara menggeser tuas yang ada pada autoclave ke arah open.
Jika air dari batas yang ditentukan kurang, maka dapat ditambah air sampai batas
tersebut. Gunakan air hasil destilasi/steril untuk menghindari terbentuknya kerak dan
karat.
3. Masukkan alat yang telah dibungkus dengan aluminium foil (boleh kertas bekas) dan
bahan yang akan disterilkan ke dalam chamber
4. Tekan bagian depan-tengah tutupnya sampai magnet catch tertarik ke magnet. Sambil
menekan tutup, geser tuas open/close ke sisi LOCK.
5. Pilih Mode (Process). Mode Aplikasi :
- LIQ Sterilisasi medium agar (dihangatkan untuk pencegahan koagulasi setelah
sterilisasi).
- LIQ Sterilisasi cairan, seperti air, media, reagen, dan obat-obatan cair, yang bertahan
pada suhu tinggi, uap bertekanan tinggi.
 - SOLID Sterilisasi alat dari kaca, logam keramik, atau karet yang tahan terhadap suhu
tinggi, uap tekanan tinggi dan penurunan tekanan uap secara tiba-tiba selama proses
pembuangan.
6. Ubah Nilai Set.
a. Tekan tombol SET/ENT.
b. Tekan tombol NEXT untuk memilih item untuk mengubah.
c. Ubah nilai ditampilkan menggunakan tombol increase/decrese (↑,↓).
d. Tekan tombol SET/ENT.
Untuk membatalkan perubahan pengaturan selama perubahan operasi, tekan
tombol MODE. Nilai-nilai yang berubah tidak akan disimpan dan peralatan akan
kembali ke keadaan standby.
7. Untuk memulai operasi tekan tombol START/STOP.
8. Tunggu sampai proses sterilisasi selesai, Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu
tekanan turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure
gauge/penunjuk tekanan menunjuk ke angka 0). Kemudian tutup dibuka dan keluarkan
isinya dengan hati-hati, tutup kembali setelah semua barang dikeluarkan.
9. Matikan mesin autoclave dengan cara menekan tombol “OFF” yang ada di sisi kanan,
cabut kabel stop kontak dan simpan mesin autoclave di tempat yang kering.

B. Sterilisasi dengan Sinar UV

Alat dan bahan :
a. Cawan petri
b. Medium Agar tegak.
c. Lampu UV
d. Lampu Bunsen

Cara kerja:
a. Cairkan 3 tabung medium Agar tegak dalam penangas air.
b. Tuangkan ke dalam 3 cawan petri steril dan biarkan membeku.
c. Sinari cawan petri pertama dengan UV selama 1 menit, cawan kedua selama 3 menit,
dan cawan ketiga tidak disinari (dalam keadaan terbuka).
d. Inkubasi cawan petri selama 24 - 48 jam pada suhu 37 oC, dalam keadaan terbalik.
e. Amati pertumbuhan mikroba pada ketiga cawan petri tersebut.
2.2.3. Sterilisasi Dengan Zat Kimia
Zat-zat kimia seperti alkohol, formalin, karbol, lisol, sabun, dan lain-lain dapat dipakai
untuk mensterilkan alat-alat. Pada praktikum ini akan dilakukan sterilisasi dengan
menggunakan beberapa zat kimia.
2.2.3.1. Sterilisasi dengan Alkohol
Alat dan bahan:
a. Cawan petri steril
b. Medium NA tegak
c. Jarum pentul/Paku kecil.
d. Alkohol dengan konsentrasi 40 %, 70 %, dan 100 %
e. Air steril (Akuades)
f. Pinset
Prosedur Kerja:
A. Persiapan :
Buat pengenceran alcohol dengan menggunakan rumus :
C1.V1=C2.V2
Ket :
C1 = Konsentrasi bahan awal (alcohol 100%)
V1 = Volume bahan awal yang harus diambil
C2 = Konsentrasi bahan yang ingin dibuat/diencerkan
V2 = Volume bahan yang ingin dibuat/diencerkan

Contoh : Untuk membuat konsentrasi alcohol 40%

100%.V1=40%.250 ml
V1 = 10000:9100
V1 = 100 ml
Jumlah Pelarut (Akuades) yang harus ditambahkan : V2-V1
250 ml – 100 ml = 150 ml
Ambil Alkohol 96% sebanyak 100 ml, lalu tambahkan akuades sebanyak 150 ml,
sehingga diperoleh Alkohol 40%.

B. Cara Kerja:
a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan tuangkan kedalam cawan petri. Biarkan
membeku pada suku kamar.
 b. Rendam jarum pentul atau paku dalam larutan alkohol diatas selama 10 menit.
c. Cuci jarum pentul dengan air steril dan letakkan pada permukaan medium dalam
cawan petri.
d. Inkubasi pada suhu 28 - 30 oC selama 24-48 jam.
e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada sekitar jarum pentul. Konsentrasi alkohol
mana yang paling efektif untuk sterilisasi.

2.2.3.2. Sterilisasi dengan Sabun

Alat dan bahan:
a. Cawan petri steril
b. Medium NA tegak
c. Sabun dengan berbagai Merek dagang.
Cara kerja:
a. Cairkan 2 tabung medium NA tegak dalam penangas air dan tuangkan ke dalam dua
cawan petri steril
b. Apuskan jari tangan saudara yang belum dicuci pada permukaan medium pada cawan
petri pertama.
c. Cuci jari tangan saudara dengan sabun merk tertentu sebersih mungkin dan biarkan
kering dengan sendirinya (jangan di keringkan dengan lap). Setelah kering, apuskan
jari saudara pada permukaan medium dalam cawan petri kedua.
d. Inkubasi kedua cawan petri tersebut selama 24-48 jam pada suhu 28-30 oC.
e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada kedua cawan petri tersebut.

Praktikum 3 : Lakukan :

1. Praktek kerja aseptis: Bersihkan area kerja dari kontaminasi mikroba dengan cara
menyemprot meja (area kerja) dengan alkohol.
2. Praktek sterilisasi dengan radiasi menggunakan autoclave elektrik dan sinar UV

Praktikum 4 : Lakukan :
3. Praktek sterilisasi dengan nyala api langsung
4. Praktek sterilisasi dengan alkohol
5. Praktek sterilisasi dengan sabun
 MATERI III

PENYIAPAN DAN PEMBUATAN MEDIUM

Kompetensi :
1. Mahasiswa memahami macam-macam medium dan fungsi dalam mikrobiologi
2. Mahasiswa dapat melakukan pembuatan medium dalam bentuk cair dan padat untuk
kultur mikroba.
3. Mahasiswa dapat melakukan pembuatan medium racik

3.1 Fungsi Media

Media merupakan substrat yang diperlukan untuk menumbuhkan dan mengembang-
biakkan mikroorganisme. Sebelum dipakai dalam percobaan, media ini perlu disterilkan
terlebih dahulu, supaya tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme yang tidak dikehendaki
(kontaminan). Agar mikroba yang kita kultur dapat tumbuh dengan baik, maka persyarat-
an yang harus dipenuhi oleh suatu media adalah :
a. Didalamnya harus terkandung bahan-bahan yang diperlukan oleh mikroba yang akan
ditumbuhkan. Bahan-bahan ini meliputi unsur-unsur makro, unsur mikro, dan trace
elemen serta zat pengatur tumbuh.
b. Media tersebut harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang
sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan dikultur.
c. Media harus dalam keadaan steril sebelum dipakai untuk menumbuhkan mikroba yang
diperlukan.

3.2. Jenis Media

3.2.1. Menurut bahan yang dipakai dalam pembuatannya, media dapat
digolongkan menjadi :
a. Media alami : Media yang komponen pembentuknya terdiri dari bahan-bahan alam,
seperti kentang, tauge, daging, nasi, dan lain sebagainya.
b. Media semi sintetik : Media yang bahan pembentuknya terdiri dari campuran bahan-
bahan alami dan bahan sintetik. Contoh : Agar Tauge, Agar Kentang Dextrosa, dll.
c. Media sintetik : Media yang bahan pembentuknya secara keseluruhan terbuat dari bahan-
bahan sintetik. Contoh : Agar Sabouraud, Endo Agar, dll.
3.2.2. Menurut bentuknya, media dapat digolongkan menjadi:
a. Media cair : Media yang tidak ditambahkan zat pemadat (agar), sehingga media ini dalam
keadaan encer (cair). Contoh : Nutrient Broth, Brain Heart Infusion Broth
b. Media semi padat : Media yang mengandung bahan yang sama dengan media cair,
tetapi ditambah sedikit agar (setengah konsentrasi agar), sehingga menjadi agak padat.
Media ini dipakai untuk menumbuhkan mikroba yang banyak memerlukan air dan hidup
dalam lingkungan yang anaerob atau anaerob fakultatif. Media ini juga dipakai untuk
uji motilitas suatu bakteri.
c. Media padat : Media cair yang ditambahkan dengan agar-agar sehingga menjadi padat.
Contoh : Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), dll.

3.2.3. Menurut kegunaanya, Media digolongkan menjadi:

a. Media umum: Media yang digunakan untuk menumbuhkan satu atau lebih kelompok
mikroba secara umum. Contoh : Nutrient Agar (media untuk menumbuhkan kelompok
bakteri, Potato Dextrose Agar (media yang dipakai untuk menumbuhkan kelompok
jamur, dll).
b. Media pengaya (enriched medium): Media yang dipakai untuk menyuburkan mikroba
tertentu sebelum ditumbuhkan pada media yang dipakai dalam penelitian. Contoh:
Selenit Broth (untuk menyuburkan pertumbuhan bakteri Salmonella.
c. Media selektif (selektive medium): Media yang dipakai untuk menumbuhkan species
tertentu dari mikroba, dengan menghambat pertumbuhan species lain yang tidak
dikehendaki. Contoh: Media SS Agar( Salmonella dan Shigella Agar) untuk bakteri
Salmonella dan Shigella; Trypticase Soy with Sucrose and Bacitracin (TYS20B) untuk
bakteri Streptococcus mutans.
d. Media penghitungan : Media yang dipakai untuk menghitung jumlah mikroba suatu
bahan. Media ini dapat berupa media media umum dan media selektif.
e. Medium diferensial (differensial medium) : medium yang ditambah reagensia atau zat
kimia tertentu yang menyebabkan suatu mikroba membentuk pertumbuhan atau
mengadakan perubahan tertentu sehingga dapat untuk membedakan bakteri himolitik
dan non himolitik.
f. Medium penguji (assay medium): medium dengan susunan tertentu yang digunakan
untuk pengujian vitamin- vitamin, asam-asam amino, antibiotik dan lain-lain.
 Untuk membuat medium yang tersusun atas beberapa bahan dapat dilakukan cara
berikut ini :
1. Mencampur bahan – bahan
Garam-garam dan bahan-bahan lain dilarutkan dalam aquadest kemudian dipanaskan
dalam pemanas air agar larutannya homogen.
2. Menyaring medium
Beberapa jenis medium kadang-kadang perlu disaring, sebagai penyaring dapat
digunakan kertas filter, kapas atau kain. Untuk medium agar atau gelatin
penyaringannya dilakukan sewaktu medium panas.
3. Menentukan dan mengatur pH
Penentuan pH suatu medium cair dapat dilakukan menggunakan kertas indikator
universal ataupun pH meter. pH diatur sesuai dengan yang diharapkan.
4. Memasukkan medium ke dalam tempat tertentu
Sebelum disterilkan medium dimasukkan ke dalam tabung steril atau tempat – tempat
lain yang steril kemudian ditutup kapas dan bagian kapasnya dibungkus kertas sampul
(kertas perkamen) agar tidak basah sewaktu disterilkan.
5. Sterilisasi medium
Sterilisasi tergantung macam mediumnya, umumnya dilakukan sterilisasi cara basah.

3.3. Pembuatan Media

Alat dan Bahan :
Dalam praktikum ini, saudara akan membuat beberapa macam media yaitu media jadi
seperti Nutrient Agar, Brain Heart Infsusion Broth (BHIB), Muller Hinton Agar (MHA),
dan Sodeum Dextrose Agar (SDA), juga media racik seperti Trypticase Soy with Sucrose
and Bacitracin (TYS20B). Semua media tersebut merupakan media sintetik yang banyak
dijual dalam bentuk instant, sehingga dalam pembuatannya, saudara cukup memperhatikan
petunjuk yang tertera pada setiap media. Alat-alat yang dibutuhkan pada praktikum ini
adalah:
- Timbangan Digital
- Erlenmayer
- Gelas Ukur
- Batang Pengaduk
- Kapas
- Petri disc steril
 - Tabung reaksi steril
- Rak Tabung
- Bunsen
- Kertas
- Kapas
- Aluminium foil &/Plastic wrap
- Sendok takar kecil
- Autoklaf
- Pipet
- Hot plate stirrer + magnetic stirrer

Pembuatan Media Agar Miring, Agar Tegak dan Agar Cawan

Media Agar Miring :
1. Campurkan bahan/media yang telah dilarutkan dengan akuades (sesuai ketentuan
masing-masing media)
2. Panaskan dalam beaker glass atau erlemayer, kemudian tuangkan pada tabung reaksi
sebanyak 5 mL – 7 mL
3. Tutup dengan kapas dan aluminium foil atau plastic wrap, dan disterilisasi dalam
autoklaf.
4. Setelah selesai disterilisasi, letakkan tabung reaksi dalam posisi miring (kemiringan
45°C) hingga benar-benar memadat dan agar miring siap untuk digunakan.

Media Agar Tegak :

1. Campurkan bahan/media yang digunakan dengan akuades (sesuai ketentuan
masing-masing media)
2. Panaskan dalam beaker glass, kemudian tuangkan pada tabung reaksi sebanyak 5
mL – 7 mL
3. Tutup dengan kapas dan aluminium foil atau plastic wrap, dan disterilisasi dalam
autoklaf.
4. Setelah selesai disterilisasi, letakkan dalam posisi tegak (pada rak tabung reaksi)
hingga benar-benar memadat dan agar tegak siap untuk digunakan.
Media Agar Cawan :
1. Campurkan bahan/media yang digunakan dengan akuades (sesuai ketentuan
masing-masing media)
2. Panaskan dalam erlenmeyer, dan tutup dengan kapas dan aluminium foil atau plastic
wrap.
3. Setelah itu, media dalam erlenmeyer tersebut disterilisasi dalam autoklaf.
4. Setelah sterilisasi, tuangkan media dalam cawan petri secara aseptis sebanyak 10
mL sampai 15 mL, tutup, dan biarkan hingga memadat dan siap digunakan.

3.3.1. Pembuatan medium Brain Heart Infusion Broth (BHIB)

Untuk membuat satu liter medium ini, lakukan prosedur berikut ini :
a. Timbang sebanyak gram medium instant Sesuai kebutuhan dengan mengacu pada
petunjuk pada kemasan)
b. Suspensikan dalam akuadest dan volume akhir dibuat menjadi 1000 ml.
c. Masukkan ke dalam tabung reaksi kecil atau tube sentrifuge 1,5 ml.

d. Sterilkan dengan autoclave pada temperatur 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama
15 menit.
e. Simpan di tempat yang sejuk dan kering (kulkas).

3.3.2. Pembuatan Medium Nutrient Agar

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukanlah prosedur berikut ini :
a. Timbang sebanyak 23,5 gram medium instant (Sesuai kebutuhan dengan mengacu pada
petunjuk pada kemasan)
b. Suspensikan dalam akuadest dan volume akhir dibuat 1000 ml.
c. Panaskan suspensi ini sampai agar-agar menjadi matang.
d. Masukkan ke dalam tabung reaksi (5 ml untuk media miring dan tegak) dan masukkan
10 ml-15 ml untuk media cawan.

e. Sterilkan dengan autoclave pada temperatur 121 oC dan tekanan 15 lbs. Selama 15 menit.
f. Simpan pada tempat yang dingin dan kering (dalam kulkas).
3.3.3. Pembuatan medium Muller Hinton Agar
Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukanlah prosedur berikut:
a. Timbang sebanyak gram medium instant Sesuai kebutuhan dengan mengacu pada
petunjuk pada kemasan)
b. Suspensikan dalam akuades dan buat volume akhir menjadi 1000 ml.
c. Panaskan sampai semua komponen larut.
d. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama 15 menit.
e. Simpan ditempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas).

3.3.4. Pembuatan medium Trypticase Soy with Sucrose and Bacitracin (TYS20B)
1. TYS20B merupakan media racik yang dibuat dengan mencampur beberapa media. Timbang
bahan-bahan yang menjadi campuran media TYS20B:
- Sukrosa 200 gram/liter
- Yeast Extract 10 gram/liter
- Trypticase Soy Agar 40 gram/liter
- Bakto Agar 5 gram/liter
- Basitrasin 200 UI/liter
2. Suspensikan dalam akuades dan volume akhir dibuat 1000 ml dalam erlemayer.
3. Panaskan suspensi ini sampai agar-agar menjadi matang.
4. Masukkan ke dalam tabung reaksi (5 ml untuk media miring dan tegak) dan tutup
rapat dengan kapas padat yang dibungkus dengan aluminium foil atau plastic wrap dan
masukkan 10 ml-15 ml untuk media cawan.

5. Sterilkan dengan autoclave pada temperatur 121 oC dan tekanan 15 lbs. Selama 15 menit.
6. Media bisa dituang ke dalam cawan petri yang sudah di autoclave (lihat gambar di
bawah). Untuk satu cawan petri diameter 9,9 mm, ketebalan 1,5 cm, maka volume agar
yang diperkukan sebanyak 17,5-20 ml untuk ketebalan media agar yang baik. Agar di

tulang ke dalam cawan petri pada kondisi suhu media + 65-75oC. Pada suhu dibawah
itu agar akan membeku.
7. Biarkan agar dalam cawan petri membeku, tutup cawan di buka sampai agar
membeku (20-30 menit dalam laminar flow).
8. Simpan ditempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas) dalam keadaan dibungkus
kantong plastik dan agar diletakkan terbalik (bagian tutup cawan petri di bawah dan agar
di atas).
 Media umumnya dibuat dalam bentuk media agar (agar plate) yang mana media
dituangkan dalam cawan petri, media agar miring/agar tegak yang disiapkan dalam
tabung reaksi umunya digunakan untuk menyimpan kultur. Kultur aerob biasanya disimpan
dalam agar miring, sementara kultur anaerob umumnya disimpan dalam agar tusuk (stab)
pada media tegak.

A. Media agar B. Agar tegak C. Agar miring

Gambar. Menyiapkan media agar yang telah disterilkan di tuang ke dalam cawan petri. (A).
Perhatikan bahwa mulut erlenmeyer harus dibakar pada api bunsen terlebih dahulu. Pada
media tegak dan miring, tutup kapas harus dibuat dalam keadaan padat dan ketat sehingga tidak
mudah lepas.

Pengujian Sterilitas Pembuatan Media :

1. Simpanlah selama 3 hari – 1 minggu pada suhu kamar, satu cawan agar padat atau
satu tabung reaksi untuk media cair dan larutan pengencer yang sudah disterilisasi.
2. Amati apakah terdapat kontaminan atau tidak. Hal ini dilakukan untuk menguji
kondisi sterilisasi media yang telah saudara lakukan apakah sudah dilakukan
dengan benar, dilakukan secara aseptis (terutama pada pembuatan media agar cawan)
dan terhindar kontaminasi pada saat penyimpanan.
Praktikum 5. Pembuatan Media Agar Padat dan Cair (Agar padat cawan, tegak, dan miring)

Hasil Pengamatan :

Keadaan
No Media Pengamatan Tidak
Hari ke Kontaminasi Kontaminasi
1 BHIB 1
2
3
2 NA 1
2
3
3 MHA 1
2
3
4 SDA 1
2
3
5 TYS20B 1
2
3
 MATERI IV

KULTUR DAN TRANSFER KULTUR MIKROBA

Kompetensi :
1. Mahasiswa memahami dan mampu melakukan berbagai teknik kultur mikroba secara
aseptis
2. Mahasiswa mampu melakukan teknik transfer kultur secara aseptis
3. Mahasiswa dapat melakukan teknik isolasi kultur dengan metode goresan kuadran
sehingga didapatkan biakan murni

4.1. Kultur Mikroba

Kultur mikroba dilakukan dengan cara menginokulasikan mikroba pada agar cawan,
dimana penyebaran kultur dilakukan dengan goresan di atas agar. Tujuan penyebaran
kultur adalah untuk memisahkan sel-sel mikroba satu dengan yang lain, sehingga
setelah inkubasi masing-masing sel akan tumbuh dan berkembang biak membentuk
kumpulan sel atau koloni yang terpisah dan dapat terlihat oleh mata (Sumbali dan
Mehrotra, 2009). Koloni yang tumbuh pada agar cawan dapat dibedakan dalam
besarnya, warna, penampakan (keruh atau bening). Bentuk penyebarannya dan bentuk
permukaannya. Berikut adalah beberapa teknik isolasi yang dapat dilakukan pada agar
cawan.
a. Metode gores (Streak plate)
Prinsip dari teknik isolasi ini adalah menggoreskan satu ose kultur pada media agar
padat. Ada beberapa cara untuk menggoreskan kultur pada agar cawan (Streak
Plate) yaitu:
a. goresan langsung
b. goresan kuadran
c. goresan radian
b. Metode Tuang (Pour Plate)
Pada metode ini, bahan pangan yang diperkirakan mengandung mikroba dan telah
diencerkan, dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian dituangkan ke dalamnya
medium agar cair steril yang bersuhu 47 - 50°C. Selanjutnya diinkubasi.
c. Metode Permukaan (Spread Plate)
Pada metode ini, agar steril terlebih dahulu dituangkan ke dalam cawan petri dan
dibiarkan beku. Setelah membeku sempurna, sampel yang telah diencerkan dipipet
pada permukaan tersebut dan diinkubasikan.

Gambar. Teknik Isolasi Mikroba Dengan Metode Sebar (Spread plate) dan
Metode Tuang (Pour plate)
Alat dan Bahan :

- Media BHIB
- Media NA (cawan dan miring)
- Tabung reaksi
- Pi pet
- Cott on bud st eri l
- Akuades
- Jarum ose
- Bunsen/Lampu Spiritus
- Inkubator

Cara Kerja Ku l tu r :
1. Swab mukosa bibir dengan menggunakan cotton bud steril, lalu masukkan cotton bud
tersebut ke dalam tube sentrifuge yang berisi BHIB.
2. Homogenkan tube centrifuge dengan vortex.
3. Ambil ose yang telah disterilkan dengan cara dibakar sampai berpijar dan masukkan ke
dalam tube untuk mengambil bakteri yang ada di dalamnya
4. Inokulasikan bakteri pada media NA secara aseptis dengan menggunakan :
- metode gores langsung pada agar cawan dan miring
- gores T pada agar cawan
- kuadran pada agar cawan
5. Beri label dan inkubasikan selama 3 x 24 jam pada suhu 370C dan amati
pertumbuhannya.

4.2. Transfer Kultur

Mikroorganisme dipindahkan dari satu media ke media lainnya dengan cara sub
kultur. Teknik ini merupakan suatu teknik dasar yang penting dan selalu digunakan dalam
menyiapkan ataupun mempertahankan stok kultur. Mikroorganisme selalu ada baik di
udara, di laboratorium, dan di peralatan. Mereka dapat berperan sebagai sumber
kontaminasi eksternal dan hal ini dapat mempengaruhi hasil eksperimen, kecuali jika
menggunakan teknik yang benar dalam sub kultur.
Berikut ini adalah langkah-langkah penting yang harus diperhatikan dalam transfer
aseptis mikroorganisme (Cappuccino dan Sherman, 1983).
1. Loop atau ose harus selalu disterilisasi dengan cara memijarkan pada api bunsen
sampai ujungnya berwarna kemerahan. Setelah dibakar loop atau ose tidak boleh
diletakkan, tetapi harus dipegang tangan dan biarkan selama 10-20 detik hingga agak
dingin. Tabung tempat stok kultur dan tabung kosong tempat inokulasi dipegang pada
ujung jari telunjuk tangan lainnya dan ditahan dengan ibu jari. Kedua tabung
dipegang berdekatan dan dipisahkan dengan ibu jari sehingga membentuk huruf V.
2. Tutup tabung dibuka dengan cara memegang tutup pertama menggunakan jari
kelingking dan tutup kedua dengan jari manis, kemudian tarik tutup tabung sampai
terlepas. Setelah dibuka, tutup tabung harus tetap dipegang oleh tangan yang
memegang loop atau ose. Setelah dibuka, secara perlahan-lahan lewatkan leher
tabung reaksi pada api bunsen. Setelah itu, dinginkan ose atau loop dengan cara
menempelkan pada dinding bagian dalam tabung yang telah disterilisasi sebelum
memindahkan sampel inokulum.
3. Loop atau ose digunakan tergantung dari jenis medium kulturnya. Loop digunakan
untuk kultur yang berasal dari broth kultur. Sedangkan ose digunakan untuk
memindahkan kultur dari agar miring dengan cara perlahan-lahan goreskan ujung ose
pada permukaan media padat yang berisi kultur, sehingga tidak merusak agar.
4. Loop atau ose kemudian dimasukkan kedalam tabung sub kultur. Pada media cair, loop
atau ose digoyang perlahan untuk mencampurkan mikroorganisme. Sedangkan untuk
media agar miring, goreskan ose perlahan pada permukaan agar secara lurus ataupun
zigzag. Untuk inokulasi agar tegak, masukkan ose atau loop secara tegak lurus
kedalam agar sampai bagian bawah tabung, kemudian tarik kembali ose seperti pada
saat memasukkan ose.
5. Langkah selanjutnya, setelah loop atau ose dikeluarkan dari tabung reaksi,
panaskan kembali leher tabung reaksi melalui api bunsen, dan tutup kembali
dengan kapas semula.
6. Pijarkan loop atau ose pada api bunsen sampai ujungnya berwarna kemerahan,
untuk mematikan mikroorganisme yang mungkin masih ada pada ujung ose.

Bahan dan Alat

Alat : tabung reaksi, erlenmeyer, cawan petri, ose, rak tabung, bunsen, korek api,
gelas beaker.
Bahan :
- Media: NA miring dan tegak, BHIB
 - Kimia: alkohol 70 %, spirtus, akuades
- Kultur : Streptococcus mutans

Prosedur Kerja
Langkah-langkah aseptis yang harus dilakukan pada saat transfer/pemindahan kultur
adalah:
1. Semprot area meja kerja dengan alkohol 70% dan lap dengan tisu
2. Siapkan media steril yang digunakan untuk inokulasi dan kultur Streptococcus mutans
3. Lakukan aseptis diri dengan cara menyemprotkan alkohol 70% ke telapak tangan
dan mengeringkannya dengan tisu.
4. Nyalakan api bunsen selama bekerja memindahkan kultur.

a. Transfer Kultur Dari Tabung Reaksi Ke Tabung Reaksi

1. Siapkan tabung reaksi dan ose yang akan digunakan pada rak.
2. Pegang tabung reaksi yang berisi kultur stok dan tabung reaksi yang akan
diinokulasidengan tangan kiri secara berdampingan (Gambar 1 a)
3. Pegang ose dengan tangan kanan seperti saat memegang pensil.
4. Pijarkan ose di atas api spirtus sampai merah membara (Gambar 1 b)
5. Biarkan ose dingin (10 sampai 20 detik) sebelum menyentuh kultur yang akan
dipindahkan.
6. Buka tutup kapas pada tabung reaksi yang berisi kultur stok dengan menjapitnya
diantara jari kelingking dengan jari manis dan pada tabung reaksi tempat kultur yang
akan dipindah dengan jari manis dan jari tengah, kemudian bakar mulut tabung
dengan api spiritus (Gambar 1 c, d)
7. Broth ke agar miring/tegak
- Masukkan ose ke dalam tabung yang berisi media cair dan dan ambil satu ose
kultur dan pastikan terlihat ada media yang terambil pada loop ose (Gambar 2 e
1).
- Masukkan ose yang mengandung media ke dalam tabung yang berisi agar miring.
- Letakkan loop ose pada permukaan agar bagian bawah dan goreskan secara zig zag
dari bawah ke atas dan keluarkan ose dari tabung.
 - Sedangkan pada media agar tegak, ose yang mengandung mikroba ditusukkan
pada media agar tepat pada bagian tengah hingga ¼ dasar media, lalu tariklah ose
dari media agar secara tegak ke atas.
8. Agar miring ke broth
- Masukkan ose ke dalam tabung yang agar miring, letakkan ose pada permukaan
agar yang ditumbuhi mikroba dan ambil satu ose kultur dengan menarik loop
ose dari bawah ke atas dan pastikan terlihat ada kultur yang terambil pada loop
ose (Gambar 2 e 2).
- Masukkan ose yang mengandung mikroba ke dalam tabung yang berisi agar cair
dan campurkan pada media dengan meduk ose secara perlahan hingga kultur
terlepas daro ose.
- Keluarkan ose dari tabung.
9. Bakar mulut tabung sekali lagi dan tutup dengan kapas (Gambar 3 f, g), selanjutnya
diletakkan kembali pada rak.
10. Panaskan ose setelah selesai dipakai atau sebelum diletakkan kembali (Gambar 3 h).
11. Jika belum mahir, tabung reaksi bisa dipegang secara bergantian.
12. Inkubasikan tabung reaksi yang sudah diinokulasi pada inkubator, suhu 370C selama
3 x 24 jam.
 Gambar . Cara transfer kultur dari tabung reaksi ke tabung reaksi secara aseptis

b. Transfer Kultur Dari Tabung Reaksi Ke Cawan Petri

1. Pijarkan ose di atas api spirtus sampai merah membara.
2. Biarkan ose dingin sebelum menyentuh kultur yang akan dipindahkan.
3. Bakar mulut tabung reaksi dengan api spirtus, kemudian masukkan ose dan
ambil satu ose kultur yang tumbuh dalam tabung reaksi.
4. Bakar mulut tabung reaksi sekali lagi dan tutup dengan kapas, selanjutnya
diletakkan kembali pada rak.
5. Buka cawan Petri tempat kultur yang akan dipindahkan dengan tangan kiri.
6. Goreskan ose pada media agar dan tutup kembali cawan Petri.
7. Inkubasikan cawan Petri pada inkubator.
 Gambar. Cara transfer kultur dari tabung reaksi ke cawan petri secara aseptis

Setelah selesai melakukan kegiatan transfer kultur, api bunsen dimatikan

dengan cara menututup api dengan penutup bunsen dan dilarang mematikannya
dengan meniup api tersebut dengan mulut. Meja kerja dibersihkan kembali
dengan alkohol 70 % dan dikeringkan dengan tisu.

c. Tranfer Kultur Pada Cawan Petri Dengan Goresan Kuadran

1. Buatlah pembagian sektor dengan menggunakan spidol permanen pada
dasar cawan petri yang mengandung media (seperti pada gambar dibawah
ini).

III II
0
I

2. Pijarkan ose kemudian gunakan untuk mengambil suspensi sampel, buka sedikit
tutup cawan, goreskan ose dipermukaan agar sektor 0 dengan cara bolak-balik
(zig zag) dan rata.
 3. Pijarkan ose dan biarkan dingin, ose yang masih panas akan menghasilkan bunyi
mendesis bila mengenai permukaan agar-agar. Segera setelah ose dingin, buat
goresan ose dari sektor 0 menuju tepi sektor I, dan buatlah goresan bolak-balik tidak
bertumpang tindih sampai sektor I terisi penuh.
4. Putar cawan petri sehingga sektor I berada disebelah kiri anda, ulangi langkah ke-
3 untuk mengencerkan biakan dari sektor 1 ke sektor II, demikian pula cara yang
sama dari sektor II ke sektor III. Perhatikan langkah-langkah pada Gambar 1.
5. Berilah label pada dasar cawan petri, yaitu nama, kelompok, media yang
digunakan, dan tanggal praktikum.

6. Letakkan cawan petri dengan posisi terbalik, inkubasi pada suhu 30oC selama 2-3
hari.
7. Lakukan pengamatan morfologi pertumbuhan koloni pada media agar cawan yang
meliputi penampakan fisiologis seperti pada gambar di bawah.

i. ii.

iii iv.

Gambar. Langkah-langkah dalam metode cawan gores kuadran

Praktikum 6 :
1. Lakukan kultur dengan metode gores langsung dan kuadran secara aseptis
2. Lakukan teknik transfer kultur secara aseptis
 MATERI V
ISOLASI DAN ENUMIRASI MIKROBA SERTA PRESERVASI KULTUR

Kompetensi :
1. Mahasiswa dapat melakukan teknik isolasi kultur dengan metode goresan T
sehingga didapatkan biakan murni
2. Mahasiswa dapat melakukan penghitungan mikroba dengan teknik pengenceran.
3. Mahasiswa dapat melakukan preservasi untuk menyimpan kultur murni yang telah
didapatkan dari hasil teknik isolasi.

5.1. Isolasi Mikroba

Berbagai jenis mikroba terdapat dalam makanan, tanah, air, udara, sampah, limbah
dan sebagainya. Untuk mempelajari sifat pertumbuhan, morfologi dan sifat fisiologinya,
masing-masing mikroba tersebut harus dipisahkan satu dengan yang lainnya, sehingga
terbentuk suatu kultur murni yaitu suatu biakan yang terdiri dari sel-sel dari satu
spesies atau satu galur mikroba (Cappuccino dan Sherman, 1983). Proses pemisahan
mikroba dari kultur mikroba campuran sehingga diperoleh kultur murni disebut isolasi.
Isolasi mikroba merupakan langkah awal yang harus dilakukan dalam mempelajari
karakteristik mikroorganisme.
Untuk mengisolasi mikroba menjadi kultur murni diperlukan medium
pertumbuhan mikroba berupa agar padat dan peralatan dasar laboratorium, yaitu alat
transfer (jarum ose dan pipet) serta ruang penumbuhan (inkubator). Bahan yang
diinokulasikan pada medium disebut inokulum. Salah satu cara mengisolasi
mikroorganisme dari campuran mikroorganisme adalah dengan teknik penggoresan
(streak plate techniques).

Alat dan Bahan

Alat : Inkubator, Pipet mikro, Korek api
Bahan : Media BHIB, Cawan Petri yang berisi Media TYS20B, Tabung reaksi berisi
TYS20B miring, C ot ton bud st eri l, Tusuk gi gi st eril , Akuades

Cara kerja
a. Ambil sampel saliva dan plak secara aseptik masing-masing dengan menggunakan
cotton bud dan plak gigi steril, lalu masukkan dalam tube sentrifuge yang telah berisi
 BHIB. Tandai tube yang berisi saliva dan plak. (Saliva dan plak diambil dari masing-
masing rongga mulut praktikan).
b. Homogenkan tube centrifuge dengan vortex.
c. Ambil ose yang telah disterilkan dengan cara dibakar sampai berpijar dan masukkan ke
dalam tube untuk mengambil bakteri yang ada di dalamnya
d. Inokulasikan bakteri pada media NA secara aseptis dengan menggunakan :
- metode gores langsung pada agar miring
- gores T pada agar cawan
e. Beri label dan inkubasikan selama 3 x 24 jam pada suhu 370C
f. Amati morfologi koloni yang tumbuh dan catat

5.2. Enumerasi Mikroba

Kandungan mikroba pada suatu bahan tergantung dari mana bahan tersebut
berasal, bagaimana proses produksi, dan bagaimana cara menanganinya. Sebelum suatu
bahan dianalisa mikrobiologinya, diperlukan tahap pengenceran sehingga perhitungan
jumlah mikroba dapat diperoleh dalam jumlah yang akurat dan masuk akal (Yousef and
Carlstrom, 2003). Berikut adalah tahapan dalam melakukan pengenceran sampel sebelum
dilakukan inokulasi pada media pertumbuhan.

Gambar. Prosedur Pengenceran Sampel Atau Kultur Mikroba

Perhitungan jumlah mikroba (enumerasi) yang terkandung di dalam sampel dapat

dilakukan dengan berbagai cara, antara lain: metode pengenceran, metoda perhitungan
langsung dalam ruang hitung (hemasitometer), Metode membran filter, metode berat
kering dan volume sel, metode MPN, dll. Pada praktikum ini, saudara akan belajar
menentukan jumlah sel yang terdapat dalam suatu sample dengan menggunakan metoda
pengenceran dan metoda penghitungan langsung dengan menggunakan alat
haemasitometer (Improved New Bauwer).
5.2.1. Metoda Pengenceran
Metoda pengenceran ini menggunakan suatu seri pengenceran dari sampel yang
kemudian ditanam pada medium. Setelah diinkubasi, koloni yang tumbuh dapat dihitung
dengan asumsi bahwa satu koloni yang tumbuh berasal dari satu sel. Dengan demikian,
maka jumlah sel pada sample asal dapat dihitung dengan cara mengalikan jumlah koloni
yang tumbuh dengan faktor pengencernya. Pengenceran biasanya dinyatakan dengan

pangkat negatif, misalnya 10-5 untuk pengenceran 1 : 100.000. Dengan menggunakan

metoda ini kita dapat menghitung jumlah total mikroba yang terdapat dalam sampel saliva,
plak, .

Alat dan bahan

- Saliva
- Media NA
- Media BHIB
- Cawan petri
- Tabung reaksi
- Pi pet
- Cott on bud st eri l
- Akuades

Cara Kerja
a. Ambil sampel saliva secara aseptik dengan menggunakan cotton bud, lalu masukkan
dalam tube sentrifuge yang telah berisi BHIB.

b. Cairkan medium NA dalam penangas air dan dinginkan sampai suhu 45 oC.

c. Tandai 6 tabung reaksi dan cawan petri dengan 10-1, 10-2,…10-6.

d. Vortex tube sentrifuge yang telah berisi campuran BHIB dan sampel sampai homogen
e. Ambil secara aseptik sebanyak 1 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang

telah berisi 9 ml akuades untuk mendapatkan faktor pengenceran sebesar 10 kali (10-1).
f. Homogenkan tabung reaksi dengan vortex, dan ambil larutan di dalamnya secara

aseptik sebanyak 1 ml dan masukkan ke dalam cawan petri yang bertanda 10-1.

g. Tuangkan medium NA ke dalam cawan petri yang bertanda 10-1 yang telah berisi 1 ml
campuran akuades dan sampel, lalu digoyang sampai homogen.
h. Dari tabung reaksi 10-1, ambil l a g i sebanyak 1 ml sampel dan masukkan ke dalam
tabung reaksi kedua yang telah berisi 9 ml akuades untuk memperoleh faktor

pengenceran sebesar 100 kali (10-2).

f. Ambil sebanyak 1 ml sampel dari tabung reaksi kedua dan masukkan kedalam cawan

petri kedua (10-2). Dari tabung ini juga, ambil 1 ml sampel dan masukkan ke dalam
tabung reaksi ketiga yang telah berisi 9 ml. air steril untuk memperoleh faktor

pengenceran sebesar 1000 kali (10-3).

h. Ulangi pekerjaan ini sampai pada faktor pengenceran 1.000.000 kali (10-6).
i. Inkubasi semua cawan yang telah ditanami dengan sample yang berisi mikroba pada

temperature 37oC selama 24 sampai 72 jam.

k. Lakukan penghitungan koloni yang tumbuh pada semua cawan Petri yang jumlah
koloninya berkisar antara 30 – 300 koloni.
l. Jumlah sel mikroba yang terdapat pada sample dihitung dengan cara mengalikan
jumlah koloni yang tumbuh pada medium dengan factor pengenceran.

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Contoh Sampel : 9 ml 9 ml 9 ml
9 ml
Saliva
(10-1) (10-2) (10-3) (10-4)
 Gambar.Cara menyebarkan (spreading) sample di cawan petri

5.2.2. Penghitungan Total Mikroba Secara Langsung Dengan Mikroskop

Keunggulan metoda ini adalah dapat menghitung total sel, baik yang masih
hidup maupun yang telah mati. Disamping itu, waktu yang diperlukan jauh lebih singkat.
Salah satu cara yang umum dilakukan adalah perhitungan langsung dibawah mikroskop
dimana volume tertentu dari suatu suspensi sampel disebarkan pada suatu area pada kaca
objek. Dengan menghitung jumlah mikroba pada luas tertentu yang diketahui
dan mengalikannya dengan faktor tertentu, maka bisa dihitung jumlah mikroba yang
terdapat dalam sample asal. Pada perhitungan langsung ini kita dapat menggunakan ruang
hitung (counting chamber), seperti haemacytometer dengan kedalaman 0,1 mm.
Alat dan bahan
a. saliva dalam BHIB
b. haemacytometer
c. mikroskop
Cara kerja
a. Tutup ruang hitung dengan kaca penutup, dan ambil saliva dalam BHIB dengan pipet.
b. Teteskan pada pinggir kaca penutup, sehingga akan mengalir kebawah kaca penutup
dan mengisi ruang hitung.
c. Amati dibawah mikroskop dan hitung jumlah sel di dalam 5 kotak besar (dengan
masing masing kotak terdiri atas 16 kotak kecil).
d. Tentukan jumlah sel/ml sampel dengan menggunakan rumus berikut :

X = n x 25 x 10 x 103, dimana n adalah rata-rata sel yang terhitung pada setiap kotak
Catatan:

Luas 25 kotak besar pada alat hemasitometer adalah 1 mm2

Kedalaman ruang hitung adalah 0.1 mm
Jumlah sel per mm3 dalam alat hitung tersebut adalah n x 25 x 10, dimana n adalah rata-
rata jumlah sel dalam setiap kotak dari 25 kotak yang terdapat pada ruang hitung.
Bila sample diencerkan sebelum dilakukan penghitungan, maka fator pengenceran ini
juga harus diperhitungkan.

Sebagai contoh, bila sample diencerkan sebesar 10-2 atau 100 kali, maka hasil yang

diperoleh dari rumus diatas harus dikalikan dengan 102 atau 100.

5.3. Teknik Preservasi Kultur

Tujuan utama preservasi yaitu mereduksi atau mengurangi laju metabolisme dan
mikroorganisme hingga sekecil mungkin dengan mempertahankan viabilitasnya dan
memelihara sebaikmungkin biakan sehingga diperoleh angka perolehan (recovery) dan
kehidupan (survival) yang tinggi. Preservasi kultur dapat dilakukan dalam jangka
pendek dan jangka panjang.

5.3.1. Preservasi jangka pendek

Preservasi jangka pendek mikroba dilakukan untuk keperluan rutin penelitian yaitu
dengan cara memindahkan mikroba ke medium baru secara berkala misalnya sebulan
sekali. Cara ini banyak dilakukan di laboratorium untuk pemeliharaan isolat mikroba.
Teknik ini mempunyai kendala diantaranya kemungkinan terjadi perubahan genetik
melalui seleksi varian dan peluang terjadinya kontaminasi. Beberapa teknik yang umum
dilakukan dalam preservasi jangka pendek antara lain:
a. Biakan Agar Miring
Agar miring merupakan suatu bentuk medium yang digunakan untuk membiakan
mikroba terutama yang bersifat aerobik atau anaerobik fakultatif. Ciri-ciri kultur termasuk
pembentukan warna dan bentuk pertumbuhannya dapat segera diamati pada agar miring.
Inokulasi mikroba pada agar miring dapat dilakukan dengan cara menggoreskan (streak)
secara zig zag pada permukaan agar miring menggunakan jarum ose yang bagian
atasnya dilengkungkan.
b. Biakan Agar Tegak
Agar tegak sering dipakai untuk uji motilitas suatu mikroba. Inokulasi mikroba
pada agar tegak dapat dilakukan dengan menusukkan (stab) loop pada medium agar tegak
untuk menstimulir pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen atau
anaerobik.
 Gambar. Teknik Preservasi dengan Metode Gores pada Agar Miring dan Agar Tegak

5.3.2. Preservasi Jangka Panjang

Preservasi jangka panjang dilakukan dalam kaitannya dengan koleksi dan
konservasi plasma nutfah mikroba. Metode preservasi jangka panjang yang paling efektif
dan banyak dilakukan adalah metode liofilisasi (liophylization/freeze drying) dan
kriopreservasi (cryopreservation/cryogenic preservation).
a. Liofilisasi
Liofilisasi merupakan dua teknik penyimpanan jangka panjang yang paling baik yaitu
meliputi pembekuan dan pengeringan. Secara garis besar tahapan proses ini meliputi
pembuangan uap air dengan cara sublimasi vakum dari status beku. Sebelum proses
pengeringan, perlu dilakukan proses pembekuan. Pada tahap pembekuan, suspensi sel
mikroba dapat dibekukan dengan menambahkan campuran pendingin seperti es kering
dalam etanol. Alternatif lain adalah pembekuan dengan cara sentrifugal dimana
suspensi suspensi sel dibekukan dengan cara pendinginan dan penguapan pada kondisi
vakum sementara ampulnya diputar dengan kecepatan rendah untuk menghindari
timbulnya buih. Selanjutnya suspensi beku mikroba di dalam ampul dikeringkan dalam
kondisi vakum. Selanjutnya ampul kering dapat disimpan pada suhu ruang di tempat
gelap. Kemampuan bertahan hidup jangka panjang mikroba dapat ditingkatkan dengan
penyimpanan dalam kulkas.
Hal yang perlu diperhatikan adalah cairan pengawet/preservatif yang digunakan
untuk pembuatan suspensi sel untuk mencegah kerusakan sel hidup pada tahap
pembekuan dan pengeringan. Fungsi preservatif adalah menstabilkan protein,
mencegah kerusakan akibat pembekuan dan melindungi dari kekeringan yang
berlebihan. Pemilihan preservatif terhantung pada mikroba yang akan disimpan. Salah
satu senyawa preservatif yang terbaik dan telah digunakan untuk penyimpanan jangka
panjang adalah mist dessicants yang merupakan cairan dengan komposisi pepton difco
 12 g dan glukosa 30 g dalam 100 ml akuades. Beberapa cairan preservatif lain yang
sering digunakan adalah larutan pepton 1%, larutan susu skim 1%, larutan Na-
glutamat 1% dan larutan campuran serum kuda dengan pepton 10%.
b. Kriogenik
Preservasi mikroba pada suhu sangat rendah yaitu dengan cara pembekuan dalam
nitrogen cair yang bersuhu -196 C dimaksudkan untuk menjaga viabilitas dan stabilitas
genetik. Berbagai jenis bakteri dapat dibekukan langsung dalam mediumnya tetapi
penambahan senyawa krioprotektan seperti gliserol atau dimethylsulfoxide (DMSO)
dapat mengurangi dampak negatif (stres) dari pembekuan. Penyimpanan mikroba
dilakukan pada suhu -80 C untuk mereduksi kecepatan metabolismenya. Semakin
rendah suhu penyimpanan maka semakin kecil peluang kehilangan viabilitasnya.

Alat dan Bahan :

Alat : tube steril, pipet mikro, tip steril, bunsen
Bahan :
- Kimia : larutan gliserol 60%, alkohol 70 %, spirtus, akuades
- Kultur: Isolat terpisah (biakan murni) dari sampel saliva dan plak
- Media yang sesuai sifat/jenis mikroba yang akan di preservasi

Prosedur Kerja:
1. Buat larutan stok gliserol konsentrasi 60% dan disterilisasi
2. Masukkan 0,5 ml kultur dan 0,5 ml gliserol ke dalam tube steril dengan perbandingan
50%: 50% (konsentrasi akhir gliserol 30% v/v)
3. Vortex agar gliserol terdispersi
4. Beri label pada tube sesuai nama mikroba, hari dan tanggal pembuatan
5. Bekukan dalam freezer suhu -200C

Praktikum 7 :
1. Lakukan isolasi kultur dengan metode goresan T untuk mendapatkan biakan murni
2. Lakukan penghitungan mikroba dengan teknik pengenceran.
3. Lakukan preservasi untuk menyimpan kultur murni yang telah didapatkan dari hasil
teknik isolasi.
 MATERI VI
PEWARNAAN SEL BAKTERI

Kompetensi :
1. Mahasiswa dapat melakukan pewarnaan dengan metode pewarnaan langsung dengan
pewarna basa
2. Mahasiswa dapat melakukan pewarnaan negatif atau pewarnaan tak langsung
3. Mahasiswa dapat melakukan pewarnaan Gram

6.1. Pendahuluan
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan
pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Tujuan pewarnaan adalah:
1. Mempermudah pengamatan bentuk sel mikroorganisme (khususnya bakteri).
2. Memperjelas ukuran sel mikroorganisme
3. Dapat mengamati struktur luar dan struktur dalam dari sel mikroba.
4. Melihat reaksi mikroorganisme terhadap pewarna yang diberikan, sehingga sifat fisik,
kimia dari mikroorganisme dapat diketahui.
Dengan demikian, kita dapat menggunakan pewarnaan sebagai salah satu cara untuk
klasifikasi bakteria. Berhasil atau tidaknya pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu
pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (Umur biakan yang baik adalah 24 jam).

6.2. Berbagai Macam Metoda Pewarnaan

6.2.1. Pewarnaan Langsung Dengan Pewarna Basa
Umumnya zat pewarna merupakan garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang
bermuatan positif atau negatif, dimana salah satu ion-ion tersebut berwarna. Kalau suatu sel
bakteri yang dinding selnya bermuatan relatif negatif bersatu dengan ion yang bermuatan
positif dari suatu pewarna, maka menyebabkan sel bakteri tersebut terwarnai.
Zat pewarna dapat dikelompokkan menjadi dua group yaitu zat pewarna yang bersifat
basa dan zat pewarna yang bersifat asam. Kalau ion positif dari zat pewarna yang
mengandung warna tersebut, maka pewarna tersebut adalah pewarna basa. Dan bila warna
tersebut berada pada ion yang bermuatan negatif, maka pewarna tersebut adalah pewarna
asam.
Alat dan bahan
a. Kultur bakteri yang diiolasi dalam praktikum sebelumnya dan beberapa biakan murni.
b. Pewarna Metilene blue
c. Pewarna kristal violet.
d. Karbol fuhsin
e. Kaca objek bersih dan kaca penutup.
f. Mikroskop

Cara kerja.
a. Letakkan sebuah kaca objek yang bebas lemak (bersihkan dengan alcohol) diatas meja
kerja.
b. Teteskan setetes akuades ditengah-tengah kaca objek tersebut.
c. Dengan menggunakan jarum Ose yang telah dipijarkan, ambil sedikit biakan bakteri yang
saudara isolasi pada praktikum sebelumnya atau dari biakan murni bakteri yang
disediakan.
d. Buat apusan bakteri pada akuades yang diletakkan pada kaca objek dengan cara
menggesek- gesekan jarum ose yang berisi biakan bakteri, sehingga didapatkan suatu
campuran yang tipis dan merata.
e. Fiksasi diatas api bunsen dengan jarak sekitar 30 Cm. Dari nyala api. Dalam
memfiksasi ini jangan terlalu panas karena dapat merusak bentuk sel.
f. Teteskan salah satu larutan pewarna yang disediakan pada sediaan yang telah difiksasi.
Pewarna Metilene blue akan mewarnai sel dalam 30 - 60 detik, Kristal violet dalam 10
detik, dan Karbol fuhsin dalam 5 detik.
g. Cuci dengan air mengalir.
h. Keringkan sediaan dengan meletakkannya diantara kertas saring (tissue).
i. Amati dengan mikroskop dengan menggunakan lensa objektive dengan perbesaran 100
kali, dan minyak imersi.
j. Catat dan gambar bentuk sel dan warna sel mikroorganisme yang saudara lihat.
6.2.2. Pewarnaan Negatif Atau Pewarnaan Tak Langsung
Salah satu pewarna asam adalah nigrosin atau tinta cina. Karena daya mewarnai pada
zat ini berada pada ion negatif dan tidak bereaksi dengan ion negatif lainnya dari sel bakteri,
maka pewarna ini tidak mewarnai sel. Dalam hal ini, yang terwarnai adalah lingkungan
sekitar sel. Dengan cara ini saudara sudah dapat mengamati bentuk-bentuk sel bakteri dan
juga ukurannya dengan jelas.

Alat dan bahan

a. Kultur bakteri hasil isolasi atau kultur yang disediakan
b. Cairan nigrosin atau tinta cina
c. Kaca objek bebas lemak.

Cara kerja
a. Teteskan sati tetes cairan nigosin atau tinta cina pada pinggir ujung kaca objek.
b. Dengan menggunakan jarum Ose yang telah dipijarkan, ambil sedikit biakan bakteri
dan suspensikan pada tetesan nigrosin pada permukaan kaca objek.
c. Ratakan suspensi bakteri dalam nigrosin pada permukaan kaca objek ini dengan
menggunakan kaca objek lain.
d. Biarkan kering pada suhu kamar, dan amati dengan mikroskop (perbesaran lensa
objektif 100 x), dan pakai minyak imersi.
e. Gambar bentuk bakteri yang saudara lihat.

Cara-cara pewarnaan berikut merupakan teknik pewarnaan diferensial, sebagai salah satu
cara dalam mengklasifikasi bakteri.

6.2.3. Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan yang sangat umum dalam
bidang bakteriologi. Dengan pewarnaan ini, kelompok bakteri dapat dibedakan menjadi
dua yaitu kelompok bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif . Ada banyak modifikasi
dari teknik pewarnaan ini, namun semua teknik tersebut berdasarkan pada prinsip yang sama,
yaitu :
1. Mewarnai mikroorganisme dengan pewarna dasar yaitu dengan kristal violet atau gentian
violet.
2. Fiksasi warna yaitu untuk menguatkan perlekatan warna dasar, misalnya dilakukan dengan
garam iodin (modifikasi larutan lugol).
3. Pencucian atau penghapusan warna dasar dengan alkohol atau aseton atau campuran
alkohol dengan aseton.
4. Pewarnaan kembali dengan pewarna pembanding atau kontras yang berbeda dengan
pewarna dasar yaitu untuk mewarnai sel-sel yang telah hilang warnanya oleh
penghapusan warna. Misalnya dalam hal ini dipakai safranin atau karbol fuhsin..

Bakeri yang setelah diwarnai dengan pewarna dasar warnanya tidak terhapus oleh
alkohol akan berwarna violet karena terwarnai oleh kristal violet, dan tidak lagi menyerap
pewarna kontras. Kelompok bakteri yang mempunyai sifat ini dikelompokkan menjadi
bakteri Gram positif. Sedangkan, kelompok bakteri yang telah diwarnai dengan pewarna
dasar dan warnanya terhapus setelah diperlakukan dengan alkohol, akan menyerap pewarna
safranin atau karbol fuhsin yang dipakai sebagai pewarna kontras, sehingga dalam
preparat akan terlihat warna merah(warna safranin atau karbol fuhsin). Kelompok bakteri
yang demikian disebut dengan bakteri Gram negatif.

Alat dan bahan

a. Kultur muda bakteri yang diisolasi atau yang disediakan
b. Larutan kristal violet (Kit Pewarnaan Gram A)
c. Larutan garam iodin (Kit Pewarnaan Gram B)
d. Alkohol 95 % ((Kit Pewarnaan Gram C)
e. Larutan safranin (Kit Pewarnaan Gram D)
f. Kaca objek

Cara kerja
a. Buat apusan bakteri pada kaca objek kering dan bersih.
b. Fiksasi diatas nyala api bunsen atau di udara.
c. Warnai dengan larutan kristal violet selama 1 - 1,5 menit.
d. Cuci dengan air suling.
e. Tetesi dengan larutan garam iodin, dan biarkan selama 1 menit.
f. Cuci dengan larutan alkohol 95 % sampai warnanya terhapus, biasanya selama 0,5 menit
(30 detik) dan cuci dengan air.
g. Warnai dengan safranin atau karbol fuhsin selama 2 menit.
h. Cuci dengan air, dan buang kelebihan air dengan menggunakan kertas hisap, tanpa
menggosok sediaan.
i. Keringkan diudara atau diatas nyala api bunsen.
j. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. (ingat pakai minyak imersi),
catat pengamatan saudara.

Langkah kerja
Langkah Lama Keterangan
1. Krital violet 60 detik Zat warna utama
2. Cuci dengan air Cuci sedikit saja
3. Lar Mordan 60 detik Sebagai Mordant, membantu zat warna membentuk
(Lar. Yod) kompleks (terikat kuat) dengan bagian bermuatan dalam
didinding sel, plasma membran dan sitoplasma.

4. Cuci dengan air Cuci

dengan
saksama
5. Alkohol 95% 10 detik Pencuci zat warna, kompleks yod-kristal violet
kompleks. Karena bakteri Gram negatif mempunyai
didning sel lebih tipis dari Gram positif maka kompleks
yod-kristal violet akan tercuci dnegan cepat

6. Cuci dengan air Cuci dengan

saksama
7. Safranin 60 detik Zat warna sekunder. Fungsi safranin adalah sebagai
zat warna pengkonter dari warna vbakteri Gram, negatif
yang tercuci karena penambahan alkohol. Bakteri Gram
positif hanya sedikit mengikat safranin karena bagian
bermuatan sudah diikat oleh kristal violet.

8. Cuci dengan air Bilas sebentar

saja
9. Keringkan Dengan tissue
kering
6.4. Pewarnan tahan asam
Pewarnaan tahan asam adalah pewarnaan yang dapat mengukur ketahanan sel yang telah
diwarnai terhadap pencucian dengan asam. Ketahan-asaman dari bakteri dan
aktinomicetes tertentu berhubungan dengan banyaknya lapisan lemak. Sebagai pewarna dasar
adalah karbol fuhsin panas, dan pencucinya adalah alkohol asam. Setelah itu, sediaan
diberi warna pembanding. Pewarnaan ini terutama digunakan untuk diagnosa dan studi
penyakit-penyakit yang disebabkan oleh species-species tahan asam seperti penyebab TBC
dan lepra.
Alat dan bahan
a. Biakan Mycobacterium dan E. coli
b. Larutan karbol fuhsin.
c. Larutan alkohol asam (64 ml HCl dalam 1000 ml larutan ethanol 95 %)
d. Larutan metilen blue.
e. Penangas air dengan platform
f. Kaca objek

Cara kerja
a. Buat apusan dari mycobacterium dan E. coli pada kaca objek dan fiksasi.
b. Tempatkan sediaan pada plat kawat diatas penangas air.
c. Letakkan sepotong kertas isap pada apusan dan basahi dengan pewarna karbol fuhsin, dan
jaga jangan sampai apusan menjadi kering dengan terus memberi pewarna. Hindari
pemberian zar warna berlebih. Lakukan hal ini selama 5 - 10 menit.
d. Cuci dengan air.
e. Cuci dengan alkohol asam selama 10 - 30 detik.
f. Warnai dengan metilen blue selama 30 detik tanpa pemanasan.
g. Cuci dengan air dan keringkan.
h. Amati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. (ingat minyak imersi). Bakteri
yang tahan asam akan berwarna merah dan yang tidak tahan asam akan terwarna biru.

6.4.1. Pewarnaan struktur

Untuk mewarnai bagian-bagian dari sel, maka diperlukan teknik pewarnaan
khusus, antara lain : pewarnaan endospora dan pewarnaan kapsula.

6.4.1.1. Pewarnaan endospora

Species-species Bacillus dan Clostridium dapat menghasilkan endospora yang
bersifat resistan, yang bisa hidup dalam waktu lama meskipun dalam keadaan lingkungan
yang kurang baik, seperti panas dan adanya zat kimia yang toksik.Endospora tahan terhadap
pewarnaan, dan sekali terwarnai akan tahan cuci. Ada beberapa metoda yang dapat dipakai
untuk mewarnai endospora, yaitu metoda Dorner dan metoda Schaefer dan Fulton.

A. Metoda Dorner
Alat dan bahan
a. Air suling.
b. Bakteri Bacillus cereus dan Clostridium sporogenes.
c. Karbol fuhsin
d. Nigrosin

Cara kerja
a. Letakkan 5 tetes air suling dalam masing-masing 1 tabung reaksi dan buat suspensi yang
pekat dari B. cereus dan Cl. Sporogenes.
b. Berikan dalam jumlah yang sama karbol fuhsin dalam suspensi-suspensi tersebut.
c. Letakkan dalam penangas air selama 10 menit.
d. Buat pewarnaan nigrosin.
e. Amati dengan mikroskop dan catat hasilnya.

B. Metoda Schaeffer dan Fulton

Alat dan bahan
a. Biakan B. cereus dan Cl. sporogenes
b. Malakit hijau
c. Larutan safranin.

Cara kerja
a. Buat apusan bakteri B. cereus dan Cl. sporogenes dan fiksasi.
b. Warnai dengan malakit hijau diatas ram kawat diatas penangas air selama 5 menit. (dilapisi
dengan kertas hisap).
c. Cuci dengan air suling.
d. Warnai dengan safranin selama 30 detik.
e. Cuci dengan air dan keringkan.
f. Amati dengan mikroskop, catat dan gambar hasilnya. Endospora akan terwarna hijau dan
bagian lain dari sel akan berwarna merah muda.

6.4.1.2. Pewarnaan kapsula

Fungsi pewarnaan ini adalah untuk melihat apakah bakteri yang diamati berkapsul atau
tidak.
Alat dan bahan
a. Biakan bakteri Alkaligenes viscous, atau Aerobacter aerogenes pada susu atau agar
b. Asam asetet glacial
c. Karbol fuhsin
d. CuSO4 20 %
e. Larutan kristal violet 1 %
f. Larutan garam fisiologis
g. Gelas tutup

Cara kerja (Metoda Welch)

a. Letakkan 5-6 loop biakan dalam susu pada kaca objek.
b. Tutup dengan asam asetat glacial, dan biarkan tidak lebih dari 10 detik.
c. Cuci dengan menuangkan karbol fuhsin, dan biarkan pewarna mengalir.
d. Cuci karbol fuhsin dengan larutan garam fisiologis ; jangan gunakan air.
e. Tutup dengan kaca penutup, dan amati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 kali
(ingat memakai minyak imersi). Kapsula akan berwarna merah muda dan sel berwarna
merah tua.

Cara kerja (Metoda Anthony)

a. Buat apusan sebagai berikut : Kalau digunakan kultur susu, sebarkan satu loop pada kaca
objek dan biarkan kering. Kalau digunakan kaldu dextrosa, atau kultur agar, letakkan
setetes serum pada kaca objek dan suspensikan kultur ke dalamnya, dan sebarkan
sehingga membentuk lapisan tipis dan biarkan kering diudara.
 b. Warnai dengan kristal violet 1 % selama 2 menit dan jangan dipanaskan.
c. Cuci dengan larutan CuSO4 20 %.
d. Keringkan dan amati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 kali dengan minyak
imersi.
e. Foto hasil pewarnaan Gram

Praktikum 8 :
1. Lakukan pewarnaan dengan metode pewarnaan langsung dengan pewarna basa
2. Lakukan pewarnaan negatif atau pewarnaan tak langsung
3. Lakukan pewarnaan Gram terhadap Streptococcus mutans (Bakteri Gram Positif) yang telah
diisolasi pada praktikum sebelumnya dengan menggunakan TYS20B dan Bakteri Gram
Negatif dari saliva yang ditumbuhkan pada media NA
 MATERI VII
UJI POTENSI SENYAWA ANTIMIKROBA

Kompetensi :
1. Mahasiswa dapat melakukan uji potensi antibakteri dari suatu senyawa antimikroba,
misalnya antibiotik dengan teknik sumuran
2. Mahasiswa dapat melakukan uji potensi antibakteri dari suatu senyawa antimikroba,
misalnya antibiotik dengan teknik dilusi
3. Mahasiswa dapat melakukan uji potensi antibakteri dari suatu senyawa antimikroba,
misalnya antibiotik dengan teknik difusi paper disk.

Cara pengujian potensi (daya atau kekuatan) senyawa antimikroba tergantung pada
sifat dan bentuk sediaan senyawa antimikroba. Uji potensi antimikroba dapat dilakukan
dengan 2 macam metode yaitu :
1. Metode Difusi
Prinsip kerja metode difusi adalah terdifusinya senyawa antimikroba (misalnya
antibiotik) ke dalam media padat di mana mikroba uji (misalnya bakteri patogen)
telah diinokulasikan. Metode difusi ada 2 yaitu:
- Metode difusi dapat dilakukan secara paper disk (paper disk diffusion method)
Pada metode difusi secara paper disk, kertas disk yang mengandung antibiotik
diletakkan di atas permukaan media agar yang telah ditanam mikroba uji,
setelah itu hasilnya dibaca. Penghambatan pertumbuhan mikroba oleh antibiotik
terlihat sebagai zona jernih di sekitar pertumbuhan mikroba.
- Metode difusi dapat dilakukan secara sumuran (cylinder diffusion plate method)
Metode difusi secara sumuran dilakukan dengan membuat sumuran dengan
diameter tertentu pada media agar yang telah ditanami mikroba uji. Sumuran
dibuat tegak lurus terhadap permukaan media. Antibiotik diinokulasikan ke
dalam sumuran ini dan diinkubasikan, setelah itu hasilnya dibaca seperti pada
difusi secara paper disk. Luasnya zona jernih merupakan petunjuk kepekaan
mikroba terhadap antibiotik. Selain itu, luasnya zona jernih juga berkaitan
dengan kecepatan berdifusi antibiotik dalam media (Lay, 1994; Jawetz dkk,
1986).

Prosedur Kerja :
1. Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Difusi Sumuran
Alat dan Bahan :
- Alat : petridish steril, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet mikro, pipet tetes, gelas
ukur, pelobang gabus no. 4 (boleh pipet/sedotan yang sedang), jangka
sorong / penggaris, jarum ose, spidol, kertas label, vortex mixer, spreader.
- Senyawa uji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilllin sirup kering) dengan variasi
konsentrasi : 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml
- Kultur murni bakteri uji dalam media NB/BHBI umur 24 jam
- Media nutrien agar (NA)
- Deret larutan standar Mac Farland
- Nutrient Broth (NB) /BHBI untuk pembuatan suspensi bakteri uji
- Akuadest steril sebagai pelarut senyawa uji
- Alkohol 70 %

Cara kerja :
a. Preparasi Senyawa Uji
Preparasi senyawa uji dilakukan sesuai petunjuk dalam kemasan, kemudian buatlah
berbagai variasi konsentrasi senyawa uji. Pada praktikum ini dibuat 4 variasi konsentrasi
senyawa uji (konsentrasi 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml (Perhatikan cara pembuatan
konsentrasi senyawa uji!)
b. Preparasi Mikroba Uji
1. Siapkan kultur murni bakteri uji
2. Siapkan deret larutan standard Mac Farland
3. Buat sebanyak 2 tabung @10 ml suspensi bakteri uji menggunakan media BPW
dan setarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland II (konsentrasi

mikroba 6. 108 CFU/ml).

c. Pengujian potensi antibiotik secara difusi sumuran
1) Siapkan beberapa petri berisi 20 ml media nutrient agar (NA), 15 ml NA dan 5 ml
NA steril
2) Pembuatan kontrol kontaminasi media
a) Buka petri berisi 20 ml media NA, secara aseptis buatlah sumuran pada petri 1)
dengan pelobang gabus no. 4. Ambil bulatan NA pada sumur yang dibuat dengan
 jarum ose secara hati-hati sehingga NA di sekelilingnya tidak tergores/rusak.
Masukkan bulatan NA tersebut dalam beaker glass berisi alkohol.
b) Beri label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan

3) Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji secara double layer

a) Tuang 5 ml NA steril ke dalam cawan petri steril, biarkan memadat sebagai
base layer agar.
b) Ambil 1 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke dalam 15 ml media NA
secara pour plate, kemudian tuangkan secara merata sebagai seed layer agar
di atas base layer agar, biarkan memadat.
c) Buat 1 sumuran dengan menggunakan pelubang gabus No. 4. Pembuatan
sumuran dilakukan sampai dasar seed layer agar dan tidak menembus base layer
agar yang berfungsi sebagai dasar sumuran.
d) Beri label pada dasar petri: kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uji
4) Pembuatan kontrol negatif dan pengujian potensi antibiotik secara difusi sumuran
a) Buatlah media base layer agar dan seed layer agar seperti pada tahan 3). Bagian
dasar petri dibuat garis dengan spidol untuk membaginya menjadi 4 bagian.
b) Buat sumuran pada bagian tengah ke-4 bidang petri tersebut dengan cara yang
sama dengan no. 3
c) Dengan menggunakan mikropipet, pada masing- masing sumuran tersebut
diinokulasikan 50 µ l senyawa uji dengan kontrol negatif/pelarut dan 4 variasi
konsentrasi senyawa uji
d) Beri label pada dasar petri secara benar
e) Inkubasikan selama 24 jam. Perhatian : inkubasi tidak dilakukan secara
terbalik! Amati zona keruh dan jernih di setiap petri.
f) Amati, gambar pertumbuhannya. Ukur diameter zona jernih di sekitar sumuran
dengan jangka sorong/penggaris. Hitung diameter zona hambat yang terbentuk

2. Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Difusi Paper Disk

Alat dan Bahan :
a. Alat-alat : petridish , pinset, pipet volume steril

b. Kultur murni bakteri uji dalam media NB/BHBI umur 24 jam

c. Disk antibiotik (paper disk yang mengandung antibiotik penisilin/ampisilin)
sebagai kontrol positif

d. Disk blank
e. Senyawauji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilllin sirup kering) dengan variasi
konsentrasi : 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml

f. Media nutrien agar (NA)

g. Deret larutan standar Mac Farland

h. Buffered Pepton Water (BPW) untuk pembuatan suspensi bakteri uji

i. Akuadest steril sebagai pelarut senyawa uji
j. Alkohol 70 %

Cara kerja :

a. Preparasi Mikroba Uji

1. Siapkan kultur murni bakteri uji.
2. Siapkan deret larutan standard Mac Farland
3. Buat 10 ml suspensi bakteri uji menggunakan media BPW dan setarakan

kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland II (konsentrasi mikroba 6. 108

CFU/ml).
b. Pengujian potensi antibiotik secara difusi paper disk

1) Pembuatan kontrol kontaminasi media

a) Siapkan 20 ml media NA dan tuang secara aseptis ke dalam petri steril, biarkan
memadat
b) Beri label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan.

2) Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji

a) Ambil 0,2 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke dalam petri berisi media NA
secara spread plate (harus merata di seluruh permukaan media) dan biarkan
permukaan agar mengering.
b) Beri label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uji.
3) Pengujian potensi antibiotik secara difusi paper disk
a) Siapkan petri berisi 20 ml media nutrien agar (NA) b) Ambil 0,2 ml suspensi
bakteri uji, inokulasikan ke media NA secara merata dengan cara spread plate dan
biarkan permukaan agar mengering.
c) Secara aseptik, letakkan 1 disk antibiotik (disk yang mengandung
penisilin/ampisilin) dan 4 disk blank (yang mengandung berbagai konsentrasi
senyawa uji antibiotik sebanyak 20 µ l), serta 1 disk blank kontrol negatif (disk
yang mengandung pelarut) pada permukaan media NA.
d) Setiap paper disk diinokulasikan dengan jarak tertentu secara teratur, agar
supaya tidak terjadi overlapping zona hambat yang terbentuk.
e) Beri label pada dasar petri secara benar

f) Inkubasikan selama 24 jam. Amati zona keruh dan jernih di setiap petri

g) Amati, gambar pertumbuhannya dan ukur diameter zona jernih yang terbentuk di
sekitar paper disk dengan jangka sorong/penggaris.

2. Metode Dilusi (agar dillution plate method)

Metode dilusi disebut metode pengenceran. Pada metode ini obat (misalnya
antibiotik) dibuat dalam berbagai konsentrasi, kemudian ditambahkan pada media yang
mengandung mikroba uji. Hasil yang dibaca adalah kekeruhan. Kekeruhan menandakan
adanya potensi hambat obat pada konsentrasi tersebut. Ada 3 macam cara dalam metode
dilusi yaitu metode Macro Broth Dilution, metode Micro Broth Dilution dan metode agar
dilusi (dilusi padat). Pada metode agar dilusi digunakan satu seri plate agar, masing-
masing mengandung konsentrasi obat yang berbeda yang berkisar pada dosis terapeutik.
Setelah inkubasi dapat dilihat hasilnya dengan membaca kekeruhan pada masing-masing
konsentrasi sehingga bisa ditentukan Kadar Hambat Minimum (KHM) atau MIC (Minimum
Inhibitory Concentration) (Koneman et al, 1997)
Metode dilusi (dilution method) menggunakan senyawa antimikroba dengan kadar
yang menurun secara bertahap, baik dengan media cair atau padat. Pada media yang
diinokulasi mikroba uji, dilarutkan senyawa antimikroba dengan menggunakan beberapa
tingkatan konsentrasi senyawa antimikroba, dan kemudian diamati pada konsentrasi
berapakah senyawa antimikrobia tersebut bersifat menghambat atau mematikan.Pada uji
mikrodilusi cair dapat memberikan hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antimikrobia
yang dibutuhkan untuk mematikan bakteri (Jawetz dkk, 2001). Metode ini
dapat digunakan untuk penentuan Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh
Minimal (KBM). Kadar Hambat Minimal (KHM) suatu antibiotik adalah konsentrasi
antibiotik terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan mikroba tertentu. Kadar
Bunuh Minimal (KBM) suatu antibiotik adalah konsentrasi antibiotik terendah yang dapat
membunuh pertumbuhan mikroba tertentu. Prosedur ini digunakan untuk menentukan
konsentrasi antibiotik yang masih efektif untuk mencegah pertumbuhan patogen dan
mengindikasikan dosis antibiotik yang efektif dalam mengontrol infeksi pada pasien (Radji,
2004).

Alat dan Bahan :

- Kultur murni bakteri uji dalam media BHIB/NB umur 24 jam
- Senyawa uji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilllin sirup kering). Variasi
konsentrasi ditentukan berdasarkan hasil percobaan VI. (variasi konsentrasi, 6; 3;
dan 1,5 mg/ml)
- Media nutrien agar (NA)
- Deret larutan standar Mac Farland
- BHIB/NB untuk pembuatan suspensi bakteri uji
- Alkohol 70 %
- Akuades steril
- Alat-alat : petridish steril, pipet

Cara Kerja :

Buatlah seri pengenceran/variasi konsentrasi larutan antibiotik dalam akuades steril.

Seri pengenceran dibuat seperti membuat pengenceran alcohol

A. Pengujian potensi antibiotik secara broth dilution

1. Siapkan media NA (siap dituang ke petri secara pour plate).
2. Bila media dalam keadaan memadat, cairkan terlebih dahulu dengan pemanas sampai

menjadi cair dan buat hingga suhunya sekitar 45 – 50oC sehingga siap untuk dicampur
dengan bakteri uji.
3. Buatlah suspensi bakteri uji dengan kepadatan yang setara dengan larutan standar Mac
Farland II.
4. Pembuatan kontrol kontaminasi media (per meja)
a. Ambil 15 ml media NA, tuang ke dalam petri streril secara pour plate. Biarkan
memadat.
b. Beri label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan.
c. Inkubasi selama 24 jam. Bandingkan dengan perlakuan.
5. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji (per meja)
a. Ambil 15 ml media NA dalam tabung. Masukkan 1 ml suspensi bakteri uji ke dalam
tabung tersebut.
b. Tuang dalam petri steril secara pour plate. Biarkan memadat. Beri label pada
dasar petri: kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uji. Inkubasi selama
c. 24 jam. Bandingkan dengan perlakuan.
6. Pembuatan kontrol negatif (pengujian potensi antibakteri pelarut) (per
kelompok kecil)
a. Ambil 15 ml media NA dalam tabung. Masukkan 1 ml suspensi bakteri uji dan 1
ml aquades steril pelarut senyawa antibiotik ke dalam tabung tersebut.
b. Tuang dalam petri steril secara pour plate. Biarkan memadat. Beri label pada
dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uji. Inkubasi selama 24 jam.
Bandingkan dengan perlakuan.

B. Pengujian potensi antibiotik secara dilusi padat

1. Ambil 3 tabung yang masing-masing berisi 15 ml media NA suhu 45 – 50oC,

tambahkan 1 ml suspensi bakteri uji pada masing-masing tabung tersebut.
Tambahkan pula larutan antibiotik dengan konsentrasi yang telah ditetapkan pada
langkah 1.
2. Siapkan 3 petri steril untuk menuang ketiga preparat di atas secara pour plate.
Biarkan memadat. Beri label pada dasar petri.
3. Inkubasi selama 24 jam. Amati dan bandingkan kekeruhan dari masing-
masing petri. Bandingkan antara kontrol dan perlakuan.
4. Pembacaan Hasil
 a. Setelah masa inkubasi, kekeruhan media yang menunjukkan kepadatan
pertumbuhan bakteri uji diamati dan diberi penilaian menggunakan notasi
(+) untuk media yang tampak keruh dan (-) jika tidak ada kekeruhan yang
berarti tidak ada pertumbuhan bakteri uji dalam media agar tersebut.
b. Hasil pengamatan dianalisis untuk mendapatkan konsentrasi atau kadar
hambat minimal senyawa antibiotik. Kadar Hambat Minimal (KHM) adalah
konsentrasi minimal senyawa antibiotik yang menunjukkan adanya
penghambatan pertumbuhan bakteri uji.
5. Penegasan Hasil
a. Dari pengamatan kekeruhan, pilih perlakuan dengan tingkat kekeruhan (-)
dan perlakuan dengan tingkat kekeruhan b. Dengan menggunakan jarum
ose, ambilah 1 ose dari tabung perlakuan tersebut dan tanamlah di atas
permukaan cawan agar dengan metode goresan sederhana.
b. Dari hasil goresan pada cawan agar, tentukan harga KHM (Kadar Hambat
Minimal) dan KBM (Kadari Bunuh Minimal). KHM : kadar antibiotik terendah
yang masih menunjukkan pertumbuhan ketika ditanam dalam cawan agar
dengan metode gores. KBM : kadar antibiotik terendah yang sama sekali
tidak menunjukkan pertumbuhan ketika ditanam dalam cawan agar dengan
metode gores.
Praktikum 9: Lakukan uji potensi antibakteri dari senyawa antimikroba misalnya antibiotic
dengan metode sumuran dan paper disc

Praktikum 10: Lakukan uji potensi antibakteri dari senyawa antimikroba misalnya antibiotic
dengan teknik paper disc dan teknik dilusi
 MATERI VIII

TEKNIK DASAR BIOLOGI MOLEKULER :

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

Kompetensi :
1. Mahasiswa dapat mengetahui teknik dasar biologi molekuler di bidang kedokteran gigi.
2. Mahasiswa dapat teknik dasar biologi molekuler

Untuk menegakkan suatu diagnosis penyakit yang tepat dapat dilakukan dengan
mendeteksi adanya patogen seperti bakteri, virus atau komponennya seperti faktor-faktor
virulensinya yang paling spesifik di dalam sel atau jaringan penderita. Hal ini dapat
dilakukan dengan menganalisis DNA dari penderita sehingga dapat diketahui jenis bakteri
atau virusnya. Salah satu caranya adalah dengan menggunakan teknik PCR, teknik ini juga
dapat mendeteksi adanya kelainan genetik, mendeteksi organisme dalam air, makanan dan
minuman.
PCR juga dapat dipergunakan untuk mengisolasi suatu gen untuk proses kloning
pada teknologi DNA rekombinan, untuk tujuan forensik, penentuan jenis kelamin dan
sebagai marker untuk menentukan sidik DNA spesifik untuk tumor malignan tertentu dan
memonitor adanya sel-sel neoplastik selama pengobatan dengan antikanker. Teknik PCR
dapat digunakan untuk memperbanyak DNA yang diperoleh dari sampel dimana sampel
tersebut dapat diambil dari cairan gusi, saliva, gigi, spesimen patologik, sel mukosa atau
jaringan lainnya.
PCR mirip dengan pembiakan patogen yang membedakannya bahwa pada
pembiakan patogen yang dilibatkan dalam amplifikasi adalah sel yang dibiakkan pada
cawan petri sedangkan pada teknik PCR yang diamplifikasi adalah fragmen DNA spesifik
secara in vitro. Keberhasilan proses pembiakan patogen sangat tergantung pada
kemampuan tumbuh patogen in vitro.
Keuntungan teknik PCR adalah dapat mendeteksi patogen secara sangat cepat
karena patogen tidak perlu dikultur terlebih dahulu, lebih sensitif, dan dengan pemilihan
primer yang spesifik untuk patogen tertentu teknik ini mempunyai tingkat kespesifikan
yang tinggi. Beberapa patogen yang ditemukan pada manusia yang berhasil dideteksi
melalui teknik PCR adalah :
- Mycobacterium tuberculosa
- Mycobacterium leprae
- Escheria coli
- Clostridium difficile
- Mycoplasma pneumoniae
- Staphylococcus aureus
- Virus hepatitis B
- Virus HIV

Teknik dan Prinsip PCR

PCR merupakan suatu teknik biomolekuler yang berguna untuk memperbanyak
segmen DNA spesifik secara in vitro melalui proses enzimatik yaitu dengan menggunakan
DNA polimerase dan primer nukleotida yang akan berhibridisasi dengan bagian DNA dari
dua arah yang berlawanan. Dengan penggunaan tehnik ini dapat diamplifikasi suatu
segmen DNA diantara dua regio yang diketahui sekuennya. Sintesis untai baru DNA
bermula dengan terjadinya hibridisasi DNA primer secara spesifik pada bagian tertentu
rangkaian DNA target yang akan dijadikan cetakan. Mengingat cetakan berupa DNA ber
untai ganda, maka dibutuhkan sepasang primer untuk menyalin kedua untai tersebut. Agar
kedua untai baru hasil penyalinan tersebut dapat saling komplementer, diperlukan sepasang
primer yangb akan berhibridisasi pada dua daerah berlainan yang mengapit bagian DNA
yang digandakan.
Persyaratan penting untuk amplifikasi DNA adalah urutan / sekuens nukleotida
pada kedua ujung ( sekuens yang mengapit kedua ujung )harus diketahui.

Pertama-tama DNA cetakan akan di denaturasi dengan jalan pemanasan (940)

didalam campuran campuran yang juga berisi dua jenis primer oligonukleotida, enzim
DNA polimerase dan empat macam dNTP (deoxyribonucleoside triphoshates) dalam
jumlah berlebihan. Campuran reaksi tersebut kemudian didinginkan sampai temperatur
tertentu ( 370-560) yang akan menyebabkan primer berhibridisasi (anneal) dengan sekuens
target, kemudian apabila temperatur dinaikkan lagi ( 720-760) proses annealing terhenti dan
proses extension dimulai, primer yang telah berhibridisasi akan diperpanjan dengan
bantuan DNA polimerisase. Demikianlah siklus denaturasi annealing dan sintesis DNA
akan berulang terus menerus sampai di dapat jumlah DNA yang diinginkan.

PCR telah dipermudah dengan penggunaan heat-stable enzyme taq polymerase dan
dari Thermophilus aquaticus dan dilengkapi dengan pengatur suhu yang otomatis.
Kekuatan PCR tergantung pada tingginya sensitifitas pengikatan primer pada sekuens
DNA target selama reaksi anneling. Pada saat penanganan sampel harus diperhatikan agar
tidak terjadi kontaminasi karena kontaminasi DNA asing yang sangat kecil pun akan
menyebabkan kesalahan besar (positif palsu), sedangkan negatif palsu dapat diakibatkan
oleh jumlah primer yang tidak adekuat.
Pemilihan target dan primer yang akan digunakan serta kondisi PCR yang tepat
pada umumnya dapat menanggulangi terjadinya kemungkinan kesalahan amplifikasi DNA.
Metode deteksi yang umum dilakukan adalah dengan menggunakan teknik elektroforesis
dengan menganalisa ukuran fragmen yang dihasilkan serta pola pita yang terbentuk setelah
dilakukan pemotongan. Pada umumnya deteksi produk PCR dilakukan dengan
menggunakan sistem pelacak (probe-base detection).
 g

Dalam reaksi enzymatis ini diperlukan beberapa komponen:

1. Kit isolasi DNA (berguna untuk mengisolasi DNA dari bakteri atau pathogen yang
ingin didiagnosa)
2. DNA yang ingin diperbanyak (DNAtemplate).
3. Primer (pencetak) yang umunya merupakan susunan nukleotida dengan panjang
maksimum 27 pasang basa (base pair).
4. Kit PCR yang terdiri dari : dNTPS ( yang merupakan sumber nucleotide: A, C, G,
T), Buffers dan MgCl2 (agar reaksi bisa berjalan dengan optimal), Enzyme
polimerase tahan panas (thermostable enzyme) atau TaqPolymerase.
Tahapan yang dilakukan pada PCR adalah:
1. Isolasi DNA bakteri/pathogen
2. Running PCR
3. Elektroforesis

8.1. Isolasi kromosomal DNA

Pengetahuan dasar tentang DNA merupakan salah satu prasyarat dalam melakukan
pekerjaan terkait biologi moleculer. Isolasi DNA merupakan pekerjan dasar dalam teknik
biologi molekuler sebelum dilanjutkan pada hal hal teknis seperti karakterisasi
mikroorganisme, sekuen susunan basa basa dalam sebuah gen, melakukan tranformasi
(memasukkan gen tetentu) ke dalam vector (pembawa gen) dan selanjutnya cloning
(memasukkan gen yang sudah dibawa oleh vector) ke dalam organisme model (E. coli,
B. subtilis, Arabidopsis, S. cerevisciae, dll).
 Ada berbagai metode untuk mengisolasi DNA dari mikrooranisme, hewan dan
tanaman. Dan secara umum bias dianggap bahwa metode isolasi dnegan fenol adalah
yang paling umum dipergunakan oleh para peneliti. Saaat ini para ahli banyak
menggunakan KIT (reagen untuk mengisolasi DNA dalam bentuk paket pereaksi)
terutama apabila kita mengisolasi DNA dalam jumlah yang sedikit (hanya untuk
keperluan PCR). DNA dapat diisolasi dengan menggunakan skala yang lebih
sedikit. Umumnya kultur dibiakkan dalam 5 ml media cair dan DNA diisolasi dari 1 ml
(bahkan 100 mikro liter) suspensi kultur dengan cara diatas. Buatlah skala
perbandingan sehingga konsentrasi pelarut yang digunakan sesuai. Ekstraksi DNA
dengan skala kecil (small scale) ini, akan memudahkan apabila kita memepunyai banyak
sampel yang akan dikerjakan. Disamping itu, DNA hanya dibutuhkan dalam jumlah
yang sangat sedikit untuk tujuan PCR (mungkin seitar 10-100 piko gram) untuk satu
kali reaksi PCR sudah lebih dari cukup. Kecuali utnuk keperluan kloning atau
hibridisasi diperlukan jumlah DNA yang lebih banyak banyak (beberapa mikro gram).

8.2. Running PCR

Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:
1. Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu
ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.

2. Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40
detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA
template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.

3. Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA
polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan
dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan
dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G,
 begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung.
Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi,
secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.

Secara umum, reaksi berjalan dalam beberapa tahapan dimana tahap awal dimulai
dnegan denaturasi DNA tenpale menjadi bentuk single strand, dan selanjutnya suhu
diturunkan secara cepat untuk memberikan kondisi terjadinya annealing
(penempelan/hibridisasi primer) pada bagian yang mempunyai susuanan basa basa
yang komplemeter pada tenplate yang secara bersamaan enzyme polimerase bekerja
untuk menggabungkan susunan basa-basa yang sesuai. Se telah itu terjadi reaksi
ekstensi (elongation) dimana perpanjangan reaksi pembentukan rantai DNA dengan
sempurna. Jadi, karena setiap double strand DNA akan dicetak menjadi 2 rantai single
strand, maka setiap satu kali siklus reaksi menghasilkan 2 rantai double strand dari satu

rantai DNA tenplae (double strand). Dengan kata lain bahwa akan terjadi 2n produk
PCR (n adalah jumlah siklus reaksi). Dengan metode ini akan dihasilkan DNA dalam
jumlah yang sangat besar dari sejumlah tenplate DNA yang sangat terbatas.

8.3.
Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan DNA atau molekul biologis lainnya
seperti protein (emzim dll), dengan cara mengalirkan pada lempengan agar khusus pada
larutan elektrolit (buffer tertentu). Dalam teknik molekuler biologi yang beruhubungan
dengan DNA dan teknik yang melibatkan PCR, elektoforesis merupakan bagian
terintegrasi yang tidak bisa dihindari. Teknik ini bertujuan untuk: memastikan apakan
DNA bisa terisolasi dengan baik dan seberapa jauh kemurnian DNA yang diperoleh, dan
yang lebih penting lagi adalah setelah dilakukan pencetakan fragment DNA
(PCR), apakah reaksi amplifikasi berlangsung dengan baik, atau apakan besar (panjang)
produk yang terbentuk sudah sesuai dengan besarnya target gen, atau apakan primer yang
digunakan cukup spesifik pada reaksi PCR. Ini semua dilakukan dengan menganalisis
pita yang muncul pada gel setelah dilakukan elektroforesis.

Bahan dan alat :

a. DNA Extraction Kit (Tiangen, Beijing) yang terdiri dari:
 - Cell Lysis Solution
- Nuclaei Lysis Solution
- Rnase Solution
- Protein Precipitation Solution
- DNA Rehydration Solution
b. PCR master mix yang berisikan:
- Taq DNA polymerase 50 units/ml
- dNTP 400 M
- MgCl2 3 mM
c. Primer
d. Agarose LE (Low Electroendosmosis)
e. Tris Buffer Elektroforesis (TBE) /TE
f. Loading dye (Promega Corporation Madison, WI, USA)
g. DNA Molecular Weight Marker XII 0,5-5,0 kbp (
h. Dry Bath
i. Thermo-Block NB-305TB
j. Horizontal Electrophoresis
k. Conventional PCR, iCyclerTM Thermal Cycler
l. Sentrifus mini
m. Transluminator (lampu uv)

Primer PCR yang digunakan untuk menentukan serotipe S. mutans

Primer Sequence (Urutan Basa) bp Referensi

GTFB-F 5’-ACTACACTTTCGGGTGGCTTG G-3’ 517 1
GTFB-R 5’-CAGTATAAGCGCCAGTTTCATC-3’ 1

GTFI-F 5’-GATAACTACCTGACAGCTGACT-3’ 712 1

GTFI-R 5’-AAGCTGCCTTAAGGTAATCACT-3’ 1

SC-F 5’-CGGAGTGCTTTTTACAAGTGCTGG-3’ 727 77

SC-R 5’-AACCACGGCCAGCAAACCCTTTAT-3’

SE-F 5’-CCTGCTTTTCAAGTACCTTTCGCC-3’ 517 77

SE-R 5’-CTGCTTGCCAAGCCCTACTAGAAA-3’

SF-F 5’-CCCACAATTGGCTTCAAGAGGAGA-3’ 316 77

SF-R 5’-TGCGAAACCATAAGCATAGCGAGG-3’
Cara kerja isolasi DNA bakteri:
a. Kultur S. mutans dalam 10 ml medium cair yang sesuai (TSB) dan diinkubasi 3 x 24
jam pada suasana anaerob.
b. Panen sel bakteri yang tumbuh pada TSB dengan cara memasukkan 1-5 ml
campuran bakteri dan TSB ke dalam tube sentrifuge lalu sentrifugasi pada
10.0000 rpm selama 1 menit, buang supernatan
c. Tambahkan 200 μl Buffer GA dan vortex untuk menghomogenkan campuran
tersebut.(Yang harus diingat :
1. S. mutans merupakan bakteri Gram positif, karena itu harus ditambahkan
Lisozim sebanyak 180 μl, inkubasi selama kurang lebih 30 pada suhu 37°C.
2. Lisozim harus disiapkan dengan buffer, jika maka lisozim menjadi tidak aktif.
3. Bila diperlukan RNA-Free genomic DNA, tambahkan 4 μl RNase homogeny
selama 15 detik dan inkubasi pada suhu kamar selama 5 menit (15-25°C).
d. Tambahkan 20 μl Proteinase K dan votex untuk menghomogenkan.
e. Tambahkan 220 μl Buffer GB (terbentuk presipitat berwarna putih) dan vortex selama
15 detik, lalu inkubasi pada suhu 70°C selama 10 menit untuk menghomogenkan larutan
sehingga presipitat akan hilang. Sentrifugasi tube tersebut untuk menjatuhkan titik titik
air yang menempel pada tutup tube.
f. Tambahkan 220 μl ethanol (96-100%) dan vortex selama 15 detik. A white precipitate
may form on addition of ethanol. Sentrifugasi tube tersebut untuk menjatuhkan titik titik
air yang menempel pada tutup tube.
g. Pindahkan campuran ke dalam Spin Column CB3 (dalam 2 ml collection tube) dan
sentrifugasi pada 12,000 rpm (~13,400 × g) selama 30 detik. Buang supernatant dan
masukkan kembali spin column ke dalam collection tube.
h. Tambahkan 500 μl Buffer GD ke dalam Spin Column CB3, dan setrifugasi 12,000 rpm
(~13,400 × g) selama 30 detik. Buang supernatant dan masukkan kembali spin column
ke dalam collection tube.
i. Tambahkan 600 μl Buffer dan setrifugasi 12,000 rpm (~13,400 × g) selama 30 detik.
Buang supernatant dan masukkan kembali spin column ke dalam collection tube.
j. Ulangi langkah h.
k. Sentrifugasi pada kecepatan 12,000 rpm selama 2 menit untuk mengeringkan membrane
secara komplit.
l. Tempatkan Spin Column CB3 ke dalam tube sentrifuge baru dan tambahkan 50-200 μl
Buffer TE or akuades ke tengah membran. Inkubasi pada suhu rungan (15-25°C) selama
2-5 min, dan sentrifugasi 2 min pada kecepatan 12,000 rpm.
m. DNA yang diperoleh digunakan sebagai DNA template pada tahap running PCR.

Cara Kerja Running PCR:

1. Siapkan tube PCR, masukkan PCR master mix (12,5 l), primer spesifik (2,5 l) dan
DNA template (3.5l). Terakhir baru ditambahkan aqua khusus sampai mencapai
volume 25 l.
2. Tempatkan tube PCR dalam mesin PCR
3. Atur suhu :
a. Inisiasi denaturasi 940C selama 1 menit,
b. denaturasi 940C selama 30 detik,
c. annealing 580C selama 30 detik,
d. Extention 720C selama 30 detik
e. final extention 40C (Lampiran 2).
4. Jalankan mesin PCR, tunggu sampai selesai proses amplifikasinya.

Cara Kerja Elektroforesis:

1. Siapkan gel agarose dalam bufer TAE, 1X strength (stok buffer TAE biasanya dibuat
dalam 50X strength). Untuk gel dengan ukuran standar, cukup dengan 50-75 ml
agarose (tebal agarose 75% dari panjang sisir yang digunakan).
2. Panaskan agarose sampai larut, biasanya dilakukan dengan memanaskan berulangkali
dalam mikrowave selama 2 menit sampai agarose larut dengan sempurna.
3. Tuangkan agarose pada cetakan ( t r a y ) yang standar digunakan, jangan lupa comb
nya dipasang, dan biarkan selama 20 menit sampai beku secara sempurna.
4. Angkat sisir (untuk membuat sumur sample) kearah vertical secara perlahan-lahan.
5. Masukkan ke dalam chamber elektroforesis i dengan TAE buffer 1X, dengan
permukaan lautran buffer 2-3 mm diatas agar. Perhatikan jangan sampai ada
gelembung udara di bawah cetakan (tray) agarose karena akan menghambat aliran
listrik pada saat elektroforesis.
6. Pipet suspensi DNA (1-2 mikro liter), tergantung dari konsentrasi DNA. Biasanya
DNA yang diisolasi dari 1.5 ml kulture cair, dan DNA akhir dilarutkan dalam 100
 mikro liter buffer TE, diambil sebanyak 3-5 mikro liter menghasilkan pita DNA yang
bagus. Terlalu banyak DNA akan memberikan pita yang terlalu tebal dan terkadang
smear (fuzzy).
7. Teteskan di atas parafilm yang bersih dan selanjutnya ditambahkan dengan loading
buffer (agar DNA tidak menyebar di atas permukaan agar). Biasanya loading buffer
dibuat 6X strength, sehingga 1 mikro liter loading buffer ditambahkan dengan 5X
volume DNA.
8. Masukkan sampel secara vertikal tepat di dalam sumur gel. Lakukan hati-hati agar
sampel tidak menyebar diatas agarose. Tandai posisi line keberapa DNA yang
dimasukkan
9. Pipetkan marker size standar (marker untuk menentukan panjang pita yang
akan terbentuk) pada line no 1 atau ditengah line.
10. Lakukan elektroforesis selama 30 menit (apabila konsentrasi agarose 1%: atau sekitar
45 menit untuk fragment PCR yang menggunakan 1.5 – 2% Agarose).
11. Stop mesin elektroforesis, dan angkat gel, masukkan ke dalam UV transluminator
untuk mengamati pita DNA yang terbentuk dan selanjutnya di foto.

Praktikum 11 : Lakukan Isolasi DNA dengan menggunakan Kit Ekstraksi DNA

bakteri yang disediakan

Praktikum 12: Lakukan Running PCR dan Elektroforesis untuk visualisasi pita
DNA
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1992, Cara Uji Cemaran Mikroba, SNI (Standar Nasional Indonesia), SNI 01-
2897-1992, Badan Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta

Anonim, 1994, Keputusan Menteri Kesehatan RI No.

661/MenKes/SK/VII/1994 Tentang Persyaratan Obat Tradisional, Jakarta

Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tanaman Obat, Cetakan Pertama,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Direktorat Jenderal POM, Direktorat
Pengawasan Obat Tradisional, Jakarta

Anonim, 2006, Metode Analisis PPOMN (MA Suplemen 2000

Revisi 2006), Mikrobiologi, Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional, Jakarta

Atlas, R. M., 1997, Principles of Microbiology, Wm. C. Brown Publishers. Iowa

Bonang, G., dan Koeswardono, E.A., 1982, Mikrobiologi Kedokteran Untuk Laboratorium
dan Klinik, 45-46, P.T. Gramedia, Jakarta BPOM, 2006, Metode Analisis PPOMN, MA
PPOMN nomor 96/mik/00, Uji Angka Kapang/Khamir dalam Obat Tradisional, Jakarta

Holt, et.al, 2000, Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Ed., Lippincott
Williams and Wilkins Philadelphia, USA.

Hugo, W.B. and Russel, A.D., 1999, Pharmaceutical Microbiology,5th Ed. Blackwell
Science, Oxford

Jawetz, and Melnick, 1996, Mikrobiologi Kedokteran, EGC, Jakarta

Jutono, J. Soedarsono, S. Hartadi, S. Kabirun S., Suhadi D., 1980, Pedoman Praktikum
Mikrobiologi Umum, Departemen Mikrobiologi, Fakultas Pertanian UGM, Yogyakarta

Lay, B., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada, Jakarta
Madigan, M.T., J.M. Martinko, and J. Parker, Brock, 2000, Biology of Microorganisms,
9th ed, Prentice Hall International Inc., Upper Saddle River, New York

Madigan, M.T., J.M. Martinko, P.V. Dunlap and D.P. Clark, 2009, Brock Biology and
Microorganisms, 12th ed, Pearson Benjamin Cummings, San Fransisco

McKane, L., Kandel, J., 1996, Microbiology : Essentials and Application, Mc

Graw Hill Inc., New York

Murray P.R., 1999, Manual of Clinical Microbiology, ASM Press, Washington

Pelczar, M.J., 1988, Dasar-dasar Mikrobiologi, UI Press, Jakarta

Prescott, L.M., Habley, J.P., and Klein, D.A., 1999, Microbiology, Fourth ed., Mc Graw-
Hill, New York

Radji, M. 2004, Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi, Departemen Farmasi Fakultas

MIPA Universitas Indonesia, Jakarta SNI, 1992, Cara Uji Cemaran Mikroba, SNI 01-2897-
1992, Jakarta, pp. 4, 36

Soekarto, 2008,Kapang Dalam Bahan Pangan,http://www.scumdoctor.com/

Indonesian/firstaid/kapang/.html. Diakses pada 28 November 2013
Volk, W. A., dan M. F. Wheeler, 1988, Mikrobiologi Dasar, Penerbit Erlangga, Jakarta