Farmaka

Volume 14 Nomor 1 59

PENENTUAN TINGKATAN JAMINAN STERILITAS PADA

AUTOKLAF DENGAN INDIKATOR BIOLOGI SPORE STRIP
Insan Sunan Kurniawan Syah

Departemen Farmasetika dan Teknologi Farmasi

Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran
E-mail : insan.sunan.kurniawansyah@unpad.ac.id

ABSTRAK
Proses sterilisasi termal menggunakan uap jenuh di bawah tekanan berlangsung di suatu
bejana yang disebut autoklaf, dan merupakan proses sterilisasi yang paling banyak dilakukan.
Suatu siklus autoklaf yang ditetapkan dalam farmakope untuk media atau pereaksi adalah
selama 15 menit pada suhu 121 0C kecuali dinyatakan lain. Autoklaf yang sederhana
menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Dengan
autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api.
Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas secara manual,
selama masa sterilisasi dilakukan. Pada penelitian ini dilakukan pengujian menggunakan
indikator biologi spore strip terhadap proses sterilisasi dengan variasi waktu pemaparan
berdasarkan nilai D. Dari hasil pengujian menunjukkan bahwa waktu pemaparan proses
sterilisasi untuk mencapai Tingkatan Jaminan Sterilitas dari autoklaf yang digunakan bisa
dicapai dalam waktu 12 menit, yang ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan
mikroorganisme pada media uji.

Kata kunci : autoklaf, indikator biologi, sterilisasi, tingkatan jaminan sterilitas.

ABSTRACT
Thermal sterilization process by saturated steam within pressure vessel usually termed an
autoclave, and it was the most common sterilization process. The cycle of autoclave that
determined at pharmacopeia for medium and product affording at temperature 121 0C for 15
minutes, unless other statement. The simple autoclave using steam source from boiling water
that added to autoclave. With this simple autoclave, pressure and temperature set by amount
of heat. Weakness from this autoclave thats need heat keeping and setting manually as long
as sterilization process. This research was done by testing biological indicator spore strip at
sterilization process with time variation according D value. The result showed that
sterilization process cycle to reach Sterility Assurance Level (SAL) from used autoclave at 12
minutes, that indicated by no growth at test medium.

Keywords: autoclave, biological indicator, sterilization, sterility assurance level.

PENDAHULUAN serta algae dan cendawan mikroskopis.

Mikroorganisme adalah suatu Dalam mikroorganisme kita mempelajari

telaah mengenai organisme hidup yang banyak segi mengenai jasad-jasad renik ini

berukuran mikroskopis. Dalam dunia (juga dinamakan mikroba atau protista),

mikroorganisme terdiri dari lima kelompok dimana adanya, ciri-cirinya, kekerabatan

organisme, yaitu bakteri, protozoa, virus antara sesamanya seperti juga dengan
Farmaka
Volume 14 Nomor 1 60

kelompok organisme lainnya, lengkap yang resmi, namun sediaan akhir

pengendaliannya dan peranannya dalam pengujian sterilitas mengalami banyak

kesehatan serta kesejahteraan manusia. batasan. Batasan yang paling nyata adalah

(Pelczar dan Chan, 2005) sifat dasar dari uji sterilitas ini adalah uji

Sediaan steril memiliki beberapa yang destruktif sehingga hal ini tergantung

sifat bentuk takaran yang unik, seperti pemilihan statistik sampel acak dari

bebas dari mikroorganisme, pirogen dan keseluruhan. Jika diketahui bahwa satu

bebas dari partikulat serta memiliki standar unit dari 1000 unit terkontaminasi (yakni,

yang sangat tinggi dalam hal kemurnian angka kontaminasi = 0,1%) dan 20 unit di

dan kualitas. Tujuan utama pembuatan sampel secara acak dari 1000 unit,

sediaan steril adalah mutlak tidak adanya kemungkinan unit yang terkontaminasi

kontaminasi mikroba. Kontaminasi dapat dari 20 sampel itu adalah 0,02. dengan kata

berasal dari beberapa penyebab sebagai lain, hanya 2% peluang dari unit yang

berikut : sterilisasi media yang kurang terkontaminasi akan dipilih sebagai bagian

sempurna, lingkungan kerja dan 20 wakil sampel dari keseluruhan 1000

pelaksanaan cara kerja saat penanaman, unit. Bahkan jika unit yang terkontaminasi

eksplan, molekul-molekul atau benda- satu dari 20 sampel dipilih untuk uji

benda asing berukuran kecil yang jatuh sterilitas, kemungkinan uji sterilitas akan

atau masuk ke dalam botol kultur setelah gagal, masih ada untuk mendeteksi

penanaman dan ketika diletakkan di kontaminasi. Konsentrasi kontaminan

ruangan. (Agalloco and Carleton, 2008; mikroba mungkin saja terlalu rendah untuk

Irby, 1994) terdeteksi selama periode inkubasi atau

Tidak seperti syarat banyak sediaan dapat saja tidak cukup berkembang cepat

yang lain, syarat sterilitas adalah nilai yang atau tidak sama sekali karena

mutlak. Secara historis, pertimbangan ketidakcukupan media dan inkubasi.

sterilitas bersandar pada uji sterilitas (Abdou, 1974; Lukas, 2006)

Farmaka
Volume 14 Nomor 1 61

Jika perkembangan mikroba persyaratan, diantaranya bebas

terdeteksi dalam uji sterilitas, maka hal ini mikroorganisme aktif. (Australian

dapat mencerminkan pembacaan positif Government, 2006; Sandle, 2008)

yang salah (false-positive reading) karena Autoklaf adalah alat untuk

masalah kontaminasi aksidental dari media mensterilkan berbagai macam alat dan

kultur pada saat uji sterilitas berlangsung. bahan yang digunakan dalam mikrobiologi

Masalah kontaminasi aksidental adalah hal menggunakan uap air panas bertekanan.

serius, merupakan batasan yang masih Tekanan yang digunakan pada umumnya

tidak dapat dihindari dari uji sterilitas. 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu

Food and Drug Administration (FDA) 121 0C (250 0F). Jadi tekanan yang bekerja

menerbitkan pedoman mengenai prinsip ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon

umum dari proses validasi (Australian tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square

Government, 2006). Titik utama yang inch). Lama sterilisasi yang dilakukan

ditekankan pada pedoman adalah biasanya 15 menit untuk 121 0C. (Marino

ketidakcukupan kepercayaan dari uji and Benjamin, 1986)

sterilitas sediaan akhir dalam memastikan Pada saat sumber panas dinyalakan,

sterilitas dari kumpulan sediaan steril. air dalam autoklaf lama kelamaan akan

Batasan-batasan utama ini menunjukkan mendidih dan uap air yang terbentuk

bahwa kepercayaan pada pengujian mendesak udara yang mengisi autoklaf.

sterilitas produk akhir saja dalam Setelah semua udara dalam autoklaf

memastikan sterilitas sediaan dapat diganti dengan uap air, katup uap/udara

mengarahkan kepada hasil yang keliru. ditutup sehingga tekanan udara dalam

Untuk memberikan jaminan yang lebih autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan

luas dan mendukung hasil dari uji sterilitas dan suhu yang sesuai, maka proses

sediaan akhir, sebaiknya ruangan produksi sterilisasi dimulai dan timer mulai

steril harus memenuhi beberapa menghitung waktu mundur. Setelah proses

Farmaka
Volume 14 Nomor 1 62

sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan Alat : Alat-alat yang digunakan dalam

dan tekanan dibiarkan turun perlahan penelitian antara lain autoklaf (All

hingga mencapai 0 Psi. Autoklaf tidak American), inkubator (Memmert),

boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 Laminar Air Flow (LAF) kabinet, lemari

Psi. (Marino and Benjamin, 1986; Lukas, pendingin (Sharp), timbangan analitik

2006) digital (Metler Todello), indikator biologi

Untuk mendeteksi bahwa autoklaf (SGMStrip Dual Species™) dan alat-alat
bekerja dengan sempurna dapat digunakan gelas yang lazim digunakan di
mikroba penguji yang bersifat termofilik Laboratorium Teknologi dan Formulasi
dan memiliki endospora yaitu Bacillus Sediaan Steril.
stearothermophillus, lazimnya mikroba ini Metode penelitian :
tersedia secara komersial dalam bentuk Metode yang akan digunakan
spore strip. Kertas spore strip ini dalam penelitian ini adalah eksperimental
dimasukkan dalam autoklaf dan laboratorik dengan tahapan sebagai
disterilkan. Setelah proses sterilisasi lalu berikut:
ditumbuhkan pada media. Jika media tetap 1. Penyiapan alat dan bahan.
bening maka menunjukkan autoklaf telah Seluruh prosedur pengerjaan dilakukan
bekerja dengan baik. (Capuccino and didalam ruang Laminar Air Flow (LAF)
Natalie, 2000; Hugo and Russel, 1998) yang telah dibersihkan dengan alkohol
BAHAN DAN METODE 70% 1 jam sebelum pengerjaan dan
Bahan : Alkohol 70% (Brataco), Aqua disinari sinar UV selama 1 jam, lalu

pro injectionum bidestilata bebas pirogen lantai ruangan percobaan dibersihkan

(IPHA Pharma), aquadest, karbol, dengan menggunakan desinfektan

indikator pH universal (Merck), medium (karbol). Semua alat dan bahan yang

agar (Tripton Soy Broth dan Nutrient akan digunakan disterilkan dengan cara

Agar) (Merck), spiritus (Brataco). yang sesuai.

Farmaka
Volume 14 Nomor 1 63

2. Sterilisasi Alat 4. Uji cemaran mikroba LAF (dengan

Seluruh alat yang digunakan dibungkus metode Apus)

menggunakan kertas perkamen Secara aseptik (di meja dengan aliran

kemudian disterilisasi menggunakan udara laminer), batang apus steril

autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 dimasukkan ke dalam aqua pro

menit. Setelah itu, alat kualitatif yang injectionum bidestilata bebas pirogen.

telah disterilisasi dimasukan ke dalam Semua bahan diatas dibawa ke ruang

oven dengan suhu 150 0C selama 1 jam. yang akan diuji cemaran mikrobanya.

(Departemen Kesehatan Republik Dengan hati-hati batang apus diapus

Indonesia, 1995; Hagman, 2005) pada daerah seluas 25 cm2. Batang apus

3. Pembuatan medium uji kemudian diperas ke dalam cawan petri

Pembuatan medium agar terdiri dari: yang berisi cairan media NA, tutup

a. Nutrient Agar (NA) cawan petri tersebut kemudian

Ditimbang 5,75 g NA, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 0C, selama

dilarutkan dengan 250 ml aquadest, lalu 18 - 24 jam. (Halls,1994)

didihkan sampai semua larut. Larutan 5. Aplikasi indikator biologi dalam proses

agar disterilkan dalam autoklaf pada sterilisasi autoklaf

suhu 121 0C selama 15 menit. (Lukas, Prosedur aplikasi indikator biologi

2006) dalam proses sterilasi autoklaf yaitu :

b. Trypticase Soy Broth (TSB) a. Tempatkan tiga buah indikator

Ditimbang 7,5 gram TSB, kemudian biologi spore strip di dalam autoklaf

dilarutkan dalam 250 ml aquadest, lalu untuk proses sterilisasi.

didihkan sampai semua larut. Larutan b. Lakukan proses sterilisasi dengan

agar disterilkan dalam autoklaf pada variasi waktu 9; 10,5; 12; 13,5 dan 15

temperatur 121 0C, selama 15 menit. menit (berdasarkan perhitungan D-

(Lukas, 2006) Value).

Farmaka
Volume 14 Nomor 1 64

0
c. Setelah mengalami proses sterilisasi, pada temperatur 55-60 C sebagai

pindahkan indikator biologi spore strip kontrol positif dan medium TSB steril

segera setelah autoklaf dingin. Lalu sebagai kontrol negatif.

pindahkan indikator biologi spore strip 6. Pengamatan hasil

(McCauley, 2004)
ke ruang LAF untuk dilakukan uji pada
HASIL
media pertumbuhan.
1. Uji cemaran mikroba LAF
d. Di dalam ruang LAF; Menggunakan
(dengan metode Apus)
teknik aseptik yang benar dan sesuai
Ruang LAF yang telah disterilkan
sertifikat kelas 100, pindahkan masing-
kemudian diuji cemaran mikrobanya
masing indikator biologi spore strip ke
selama 30-48 jam pada suhu 37 0C. Dari
dalam tabung yang berisi medium
hasil pemantauan diperoleh hasil bahwa
pertumbuhan TSB.
ruang LAF steril, yang ditunjukkan dengan
e. Inkubasikan indikator biologi spore
tidak ada pertumbuhan mikroba dalam
strip di dalam TSB pada temperatur 55-
cawan media pertumbuhan, seperti yang
0
60 C selama tujuh hari.
terlihat pada Tabel 1 di bawah ini.
f. Jika spora bertahan selama proses
Tabel 1. Hasil pemeriksaan ruang LAF
sterilisasi, media pertumbuhan akan
Cawan Hasil
menjadi keruh dan gelap. I -
II -
g. Inkubasi indikator biologi spore strip
Keterangan :
dalam medium TSB tanpa perlakuan + : ada pertumbuhan mikroba
- : tidak ada pertumbuhan mikroba
Farmaka
Volume 14 Nomor 1 65

2. Aplikasi Indikator Biologi dalam proses sterilisasi autoklaf

Tabel 4.2 Hasil pengamatan uji aplikasi indikator biologi dalam proses sterilisasi
autoklaf dalam variasi waktu
Hari Ke-
Waktu Ind.
No 1 2 3 4 5 6 7
Sterilisasi Biologi
+/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
Sampel 1 - + + + + + +
1 9’ Sampel 2 - + + + + + +
Sampel 3 - + + + + + +
Sampel 1 - + + + + + +
2 10,5’ Sampel 2 - + + + + + +
Sampel 3 - + + + + + +
Sampel 1 - - - - - - -
3 12’ Sampel 2 - + + + + + +
Sampel 3 - - - - - - -
Sampel 1 - - - - - - -
4 13,5’ Sampel 2 - - - - - - -
Sampel 3 - - - - - - -
Sampel 1 - - - - - - -
5 15’ Sampel 2 - - - - - - -
Sampel 3 - - - - - - -
Keterangan : (+) = ada pertumbuhan mikroba
(-) = tidak ada pertumbuhan mikroba
medium TSB steril = kontrol negatif
medium TSB steril + indikator biologi tanpa perlakuan = kontrol positif

Aplikasi indikator biologi spore PEMBAHASAN

strip yang dilakukan pada saat proses Ruang LAF yang merupakan ruangan

sterilisasi dengan berbagai variasi waktu produksi sediaan steril yang dikategorikan

berdasarkan nilai D, menghasilkan waktu sebagai ruang kelas I atau white area yang

yang efektif dengan autoklaf yang harus memenuhi syarat jumlah mikroba

digunakan pada saat proses sterilisasi dan partikel (Badan Pengawas Obat dan

adalah 12 menit dengan suhu + 1250C Makanan, 2006). Untuk memperoleh

dengan indikasi tidak terjadinya ruangan yang steril dan memenuhi

pertumbuhan mikroogranisme pada persyaratan jumlah mikroba dan partikel,

medium uji (TSB). ruang LAF dibersihkan terlebih dahulu

bagian dinding, lantai, dan langit-langitnya

dari debu dan kotoran. Lalu bagian-bagian

Farmaka
Volume 14 Nomor 1 66

tersebut dibersihkan dengan cairan waktu atau suhu yang diperlukan dalam

disinfektan. Disinfektan yang digunakan sterilisasi akan diketahui. Pada sterilisasi

yaitu alkohol 70 % dan fenol. Alkohol bioburden digunakan bakteri Bacillus

merupakan disinfektan dengan mekanisme stearothermophillus sebagai indikator

kerja mendenaturasi protein dengan daya biologis karena merupakan

bunuh yang cepat tetapi mudah menguap mikroorganisme yang paling tahan panas

dan terbakar, tidak bersifat sporoidal, dan pada sterilisasi uap panas. Adapun nilai D

perlu waktu kontak minimum 5 menit dari Bacillus stearothermophillus sebesar

untuk mencapai tingkat disinfeksi. 1,5 menit (Hanida, 2006; McCauley,

Sedangkan fenol memiliki mekanisme 2004).

kerja dengan berpenetrasi terhadap dinding Faktor suhu autoklaf yang dalam

sel dan mengendapkan protein sel. Fenol pengamatannya mencapai suhu 125 ºC

memiliki spektrum yang luas sebagai menyebabkan sterilisasi bisa dicapai dalam

disinfektan tetapi bersifat korosif terhadap waktu 12 menit. Ini ditunjukkan dengan

karet dan sebagian plastik. Dengan tidak ada pertumbuhan di dalam media uji

menggunakan kedua disinfektan tersebut, TSB. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri

ruang LAF sebagai ruangan produksi Bacillus stearothermophillus yang berada

sediaan steril bebas dari mikroorganisme di dalam indikator biologi spore strip telah

(Sandle, 2008). mati. Sterilisasi media yang terlalu lama

Nilai D adalah waktu dalam menit menyebabkan penguraian gula, degradasi

yang dibutuhkan untuk mengurangi vitamin dan asam-asam amino, inaktifasi

populasi mikroba sejumlah 90 % atau 1 log sitokinin zeatin riboside dan perubahan pH

siklus (1/10 bagian yang hidup) pada suhu yang berakibatkan depolimerisasi

tertentu. Nilai D sering digunakan untuk agar (Pelczar and Chan, 2005; Hugo and

menggambarkan keefektifan suatu proses Russel, 1998)

sterilisasi. Dengan diketahui nilai D maka

Farmaka
Volume 14 Nomor 1 67

Pada T = 12 menit sampel 2 dengan menggunakan indikator kimia

terdapat endapan di atas permukaan media ataupun indikator fisika (Irby, 1994)

uji, ini bisa disebabkan oleh kontaminan DAFTAR PUSTAKA

yang masuk pada saat pengerjaan. Abdou, M. 1974. Comparative study of

Sedangkan pada sampel 1 dan 3 seven media for sterility testing. J

menunjukkan hasil negatif, yang berarti Pharm Sci. 63(5). 23-26.

tidak ada pertumbuhan mikroba pada Agalloco, J and FJ Carleton. 2008.

waktu 12 menit. Validation of Pharmaceutical

Autoklaf yang lebih komplit Process. Third Edition. New York:

menggunakan sumber energi dari listrik. Informa. p. 1-4: 187-222

Alatnya dilengkapi dengan timer dan Australian Government. 2006. Therapeutic

thermostat. Bila pengatur automatis ini Good Administration Guidelines

berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat for Sterility Testing of Therapeutic

dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan Goods. Australia: Department of

lain. Kelemahannya adalah bila salah satu Health and Ageing. p. 34-36.

pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan Badan Pengawas Obat dan Makanan.

persiapan media menjadi sia-sia dan 2006. Pedoman Cara Pembuatan

kemungkinan menyebabkan kerusakan Obat yang Baik. Jakarta: Badan

total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, POM RI. hal. 145-152.

juga berasal dari air yang ditambahkan ke Capuccino, JG and S. Natalie. 2000.

dalam autoklaf dan didihkan. Untuk Microbiology A Laboratory

autoklaf sederhana diperlukan beberapa Manual. California: Benjamin/

proses validasi yang bisa menjamin Cummings Publishing Company

kelayakan autoklaf itu. Salah satunya Inc. p. 139-148

pengujian dengan menggunakan indikator Departemen Kesehatan Republik

biologi. Pengujian lain bisa dilakukan Indonesia. 1995. Farmakope

Farmaka
Volume 14 Nomor 1 68

Indonesia. Edisi Keempat. Jakarta: Lukas, S. 2006. Formulasi Steril.

Departemen Kesehatan Republik Yogyakarta: Penerbit Andi. hal. 9-

Indonesia. hal. 9; 855; 1110-1114. 14; 82-84; 86-99.

Hagman, DE. 2005. Sterilization. In: Marino, FJ and F Benjamin. 1986.

Remington; The Science and Industrial sterilization. In: Kenneth

Practice of Pharmacy. 21st Edition. E. Avis, Leon Lachman, and

Philadelphia: Lippincott Williams Herbert A (editors).

and Witkins. p. 776. Pharmaceutical Dossage Form:

Halls, NA. 1994. Achieving Sterility in Parenteral Medications. Vol 2.

Medical and Pharmaceutical Marcel Dekker Inc. New York. p.

Products. New York: Marcel 2-4.

Dekker. p. 82-86. McCauley, K. 2004. Product d-value

Hanida. 2006. Metode overkill dan studies: a critical tool when

bioburden. Tersedia di: developing a sterilization process.

http://www.depkes.go.id.html 1(3). Available at: www.

Diakses tanggal 14 April 2014. sgmbiotech.com Diakses tanggal

Hugo, WB and AD Russel. 1998. 23 November 2014.

Pharmaceutical Microbiology. 6th Pelczar, MJ and ECS Chan. 2005. Dasar-

Edition. London: Blackwell dasar Mikrobiologi. Jakarta:

Science. p. 25-27. Universitas Indonesia Press. hal.

Irby, T. 1994. Pembersihan, Sterilisasi dan 131-135

Penyimpanan. Tersedia di: Sandle, T. 2008. Environmental

http://www.uaf.edu [Diakses Monitoring in a Sterility Testing

tanggal 16 April 2014] Isolator. Available at:

http://www.pharmig.org.uk/pages/a
Farmaka
Volume 14 Nomor 1 69

rticles/envmon.html [Diakses

tanggal 16 April 2014