Jurnal Spektrometri
Jurnal Spektrometri
dengan bentuk fenol kompleks berwarna yang menyerap cahaya dalam jarak
pandang, dengan serapan maksimum pada panjang gelombang 490 nm (DuBois et al.,
1956; Rao & Pattabiraman, 1989).
Meskipun lebih mudah digunakan daripada banyak metode yang tersedia, metode
Phenol-Sulfuric Acid memiliki beberapa kelemahan serius. Pertama, zat pewarna
yang digunakan dalam metode ini, fenol, memiliki banyak bahaya kesehatan.
Fenol dan uapnya bersifat korosif terhadap kulit, mata, dan sistem pernapasan.
Kontak berulang dan berkepanjangan dengan kulit dapat menyebabkan dermatitis
atau luka bakar tingkat kedua dan ketiga. Demikian pula, inhalasi uap fenol
yang lama atau berulang-ulang menyebabkan edema paru-paru. Paparan fenol
jangka panjang juga memiliki dampak serius pada sistem saraf pusat (ini adalah
neurotoksin yang kuat), ginjal, dan hati (Budavari, 1996; Lin, Lee, Lai, &
Lin, 2006; Michalowicz & Duda, 2007 ). Phenol adalah salah satu dari 126
'Polutan Prioritas' yang saat ini diatur oleh Badan Perlindungan Lingkungan
A.S. (Lampiran A hingga 40 CFR Bagian 423). Kedua, hasil dari metode Phenol-
Sulfuric Acid standar disajikan dalam hal konsentrasi setara glukosa.
Representasi ini mungkin memiliki keterbatasan potensial ketika berhadapan
dengan karbohidrat kompleks yang bukan polimer glukosa sederhana. Akhirnya,
reaktivitas kimia karbohidrat dengan pereaksi derivatisasi (asam sulfat)
sangat tergantung pada apakah karbohidrat itu netral atau anionik. Sebagai
hasilnya, koefisien penyerapan molar dapat sangat bervariasi tergantung pada
muatan karbohidrat yang dianalisis (Mecozzi, 2005).
Semua bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah kelas reagen
analitis. Glukosa (C6H12O6) diperoleh dari Sigma-Aldrich. Frukos (C6H12O6),
sukrosa (C12H22O11), pati ((C6H10O5) n), fenol (C6H6O) dan kalium hidroksida
(KOH) diperoleh dari Fisiotific Scientific. Asam sulfat pekat (H2SO4)
diperoleh dari ACROS. Asam polygalacturonic (PGA) ((C6H8O6) n), xanthan
((C35H49O25) n) dan dextran ((C6H12O6) n) diperoleh dari MP Biomedis. Actigum
((C24H40O19) n) diperoleh dari Cargill
perusahaan. Pengukuran penyerapan dilakukan pada Thermo Sci fi cific Evolution
300 UV-vis Spectrophotometer.
Larutan stok masing-masing karbohidrat disiapkan dengan menghilangkan 0,1 g
karbohidrat kering dalam 1 L air double milipore (DDI). Karena PGA tidak larut
dalam air, itu dibuat larut dengan penambahan kalium hidroksida (KOH). Telah
dilaporkan sebelumnya bahwa 0,46 mL KOH diperlukan untuk melarutkan 100 mg PGA
(Czarnes, Hallett, Bengough, & Young, 2000). Namun, percobaan pendahuluan kami
menunjukkan bahwa pH larutan yang disiapkan adalah indikator kelarutan PGA
yang lebih baik. Kami menemukan bahwa pH larutan harus dinaikkan menjadi 12,4
untuk pelarutan lengkap dan prosedur ini digunakan selama penelitian ini.
Berbagai pengenceran larutan stok karbohidrat dibuat dengan memipet volume
larutan stok yang diketahui dan melengkapi volume dengan air DDI. Konsentrasi
yang disiapkan untuk penelitian ini adalah: 0, 0,01, 0,03, 0,05, dan 0,07 g /
L.
Dalam paragraf di bawah ini kami menjelaskan dua metode yang didasarkan pada
penyerapan cahaya dalam rentang yang terlihat dan UV: Metode Asam Fenol-Sulfat
(DuBois et al., 1956) dan metode Asam Sulfat-UV yang diusulkan, masing-masing.
Jarum penganalisa TOC tidak selalu mewakili. Oleh karena itu, kami
memperkirakan kadar karbon dari solusi ini sebagai:
konsentrasi karbohidrat (kandungan karbon). Demikian pula, persen pemulihan
(r) dihitung sebagai
[C] n MC p S (1)
NONA
[C] ∗
r = 100 [C]
(5)
di mana [C] secara teoritis dihitung total karbon (dalam massa / volume), n
adalah jumlah atom C dalam unit dasar molekul karbohidrat, MC adalah massa
molar atom karbon, MS adalah massa molar satu unit dari molekul karbohidrat, p
adalah kemurnian dari reagen karbidrat yang digunakan dinyatakan sebagai
fraksi, dan S adalah konsentrasi larutan karbohidrat yang disiapkan (dalam
massa / volume).
Kami menguji efek waktu interaksi pada keakuratan kedua metode. Ini dilakukan
dengan memvariasikan waktu tunggu setelah asam sulfat pekat ditambahkan ke
dalam larutan karbohidrat. Efek waktu diuji pada larutan glukosa 0,01 dan 0,07
g / L dan waktu tunggu 5, 15, 30, 45, 75, 105, 135 dan 225 menit.
Validasi metode baru (metode Sulfuric Acid-UV) dilakukan sesuai dengan pedoman
Konferensi Internasional tentang Harmonisasi (ICH) (ICH Harmonized Tripartite
Guidelines., 2005). Proses validasi dilakukan dalam hal metrik berikut: batas
deteksi (LOD), batas kuantifikasi (LOQ), linieritas, presisi, dan akurasi.
Selain itu, metode baru ini diuji untuk kemungkinan gangguan dari komponen
solusi yang menyerap dalam rentang UV yang menarik, terutama protein dan
flavonoid.
Batas deteksi (LOD) adalah konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi
tetapi tidak harus dikuantifikasi sebagai nilai eksak, sedangkan batas
kuantifikasi (LOQ) adalah konsentrasi analitik terendah yang dapat diukur
dengan presisi yang sesuai. dan akurasi (Currie, 1999). LOD dan LOQ dihitung
untuk konsentrasi karbo- hidrat versus absorbansi dan total karbon versus
hubungan absorbansi
Rumus
RUMUS
Ketepatan prosedur analitik mengungkapkan kedekatan persetujuan (derajat
sebaran) antara serangkaian pengukuran yang diperoleh dari beberapa sampel
dari sampel homogen yang sama di bawah kondisi yang ditentukan. Ketepatan
prosedur analitis biasanya dinyatakan dalam istilah standar deviasi (SD) dalam
serangkaian pengukuran.
Untuk menguji kemungkinan gangguan dari adanya protein dan / atau flavonoid
dalam larutan sampel, kami menguji absorbansi UV dari serum albumin (BSA) dan
larutan asam sinamat yang menjadi sasaran prosedur penuh dari Sulfuric yang
diusulkan. Metode asam-UV. Tujuan dari tes ini adalah untuk memeriksa apakah
reaksi dengan asam sulfat pekat akan mengurangi atau menghilangkan absorbansi
UV dari senyawa-senyawa ini yang diketahui menyerap sinar UV dalam kisaran
target.
Semua pengukuran dalam penelitian ini dilakukan pada tiga sampel berulang.
Semua titik data yang dilaporkan dan spektrum menunjukkan cara ulangan. Bar
kesalahan tidak ditampilkan dalam plot karena kekacauan membuatnya sulit untuk
membedakan antara simbol yang mewakili karbohidrat yang berbeda. Kesalahan
rata-rata dan standar dari semua data yang dilaporkan dalam gambar disediakan
dalam data pelengkap elektronik. Analisis data dilakukan dengan menggunakan
program perangkat lunak analisis statistik R. Perbedaan yang signifikan antara
rata-rata dianalisis dengan Tukey's HSD (jujur perbedaan signifikan) tes pada
tingkat probabilitas ˛ <0,05.
GAMBAR
Gambar 1. Perbandingan efek waktu reaksi pada absorbansi untuk metode Phenol-
Sulfuric Acid (simbol penuh) dan Metode Sulfuric Acid-UV (simbol terbuka)
untuk dua konsentrasi glukosa. Perhatikan bahwa absorbansi berskala
menunjukkan absorbansi pada setiap waktu reaksi dinormalisasi dengan
absorbansi pada 225 menit, untuk masing-masing metode dan konsentrasi.
Karakteristik analitik dari metode Sulfuric Acid-UV dievaluasi dalam hal LOD,
LOQ, linearitas, akurasi dan presisi. Tes validasi ini dilakukan dengan
menggunakan persamaan kalibrasi gabungan yang disesuaikan dengan absorbansi vs
konsentrasi gula dan absorbansi vs data kandungan karbon dari gula netral dan
anionik secara kolektif. LOD dan LOQ untuk persamaan kalibrasi konsentrasi
gula dihitung menggunakan Persamaan. (2) dan
(3) masing-masing 0,002 dan 0,01 g / L. Dari hasil ini, sangat jelas bahwa
nilai LOD adalah urutan besarnya lebih rendah dari konsentrasi terendah yang
digunakan untuk kalibrasi. LOQ di sisi lain sama dengan konsentrasi terendah
yang digunakan dalam kalibrasi. Karena itu, metode baru dan kalibrasi yang
disediakan
GAMBAR
Gambar 3. Hubungan antara karbon total yang dihitung dan diukur untuk
karbohidrat berbeda yang digunakan (a) dan korelasi antara total kadar karbon
yang diukur dengan konsentrasi karbohidrat (b). Perhatikan bahwa kandungan
karbon yang dihitung digunakan untuk actigum dan xanthan di bagian (b) karena
kandungan karbon yang diukur tidak dapat diandalkan (lihat teks untuk
penjelasan).
GAMBAR
Gambar 4. Respon absorbansi terhadap kadar karbon total untuk konsentrasi
karbohidrat yang berbeda menggunakan metode Phenol-Sulfuric Acid (a) dan
metode Sulfuric Acid-UV (b). Garis-garis padat menunjukkan kecocokan regresi
linier terhadap data dan garis putus-putus mewakili interval kepercayaan 95%
dari garis regresi. Perhatikan bahwa simbol yang diisi mewakili gula anionik
sedangkan simbol yang terbuka mewakili gula netral. Untuk data statistik,
lihat Tabel 3.
TABEL
TABEL
dianggap berlaku untuk pengukuran kuantitatif dalam kisaran konsentrasi yang
digunakan dalam penelitian ini; yaitu konsentrasi gula 0,01-0,7 g / L.
Linearitas persamaan konsentrasi gula dan kalibrasi kadar gula disediakan
masing-masing dalam Tabel 1 dan 3. Nilai R2 yang diamati (R2 0,983 dan R2
0,988, masing-masing) dianggap tinggi untuk tujuan yang dimaksudkan dari
metode ini. Keakuratan dan ketepatan metode baru dilaporkan pada Tabel 4.
Keakuratan metode ini diuji dalam hal persentase kesalahan relatif (ı) dan
pemulihan persen (r), yang dihitung menggunakan Persamaan. (4) dan (5),
masing-masing. Secara umum, metode baru dapat dianggap akurat dalam 3,6%.
Standar deviasi (presisi) dari sampel validasi ulangan dilaporkan pada Tabel
4, yang umumnya menunjukkan pengukuran presisi tinggi yang rendah. Perhatikan
bahwa semakin kecil SD, semakin baik presisi.
Tes untuk gangguan menunjukkan bahwa absorbansi UV dari BSA dan asam sinamat
berkurang tetapi tidak sepenuhnya dihilangkan setelah hidrolisis melalui
reaksi dengan asam sulfat pekat. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa
metode yang diusulkan tidak sesuai untuk sampel yang menyerap dalam rentang UV
tanpa pra-perawatan. Sebagai tindakan pencegahan, disarankan bahwa sebelum
menggunakan metode Sulfuric Acid-UV yang diusulkan, sampel harus disaring
terlebih dahulu untuk menguji apakah mereka memiliki absorbansi UV.
Pengurangan absorbansi UV pada hidrolisis menunjukkan bahwa ada kemungkinan
sejumlah kecil pengotor protein / flavonoid dapat diterima, jika absorbansi
UVnya dikurangi di bawah batas deteksi. Tingkat absorbansi UV yang diterima
yang tidak diolah
sampel harus ditetapkan dengan analisis sistematis berbagai protein dan
flavonoid dicampur dengan karbohidrat pada berbagai konsentrasi dan proporsi.
4. Kesimpulan