1.

Prinsip Kromatografi Kertas

Prinsip kromatografi kertas adalah adsorbsi dan kepolaran, dimana
adsorbsi didasarkan pada panjang komponen dalam campuran yang
diadsorbsi pada permukaan fase diam dan kepolaran komponen
berpengaruh karena komponen akan larut dan terbawa oleh pelarut  jika
memiliki kepolaran yang sama serta kecepatan migrasi pada fase diam
dan fase gerak. Sedangkan prinsip kerja kromatografi kertas adalah
pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen bergerak
pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan pada
perbedaan bercak warna.
2. Tujuan Kromatografi Kertas
Tujuan kromatografi kertas adalah memisahan campuran dari
substansinya menjadi komponen-komponennya berdasarkan distribusi
suatu senyawa pada dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak.
 
3. Peralatan Dan Bahan Dalam Kromatografi Kertas
Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam pelaksanaan teknik
pemisahan menggunakan metode kromatografi antara lain yaitu pipa
kapiler, gunting, tabung gelas, penutup tabung gelas, penggaris, pensil,
pipet tetes dan beberapa alat yang lain yang mungkin dibutuhkan.
Sedangkan bahan yang diperlukan antara lain yaitu kertas whatman atau
kertas selulosa sebagai fase diam, pelarut sebagai fase gerak dan
beberapa larutan lain yang diperlukan sesuai dengan komponen
campuran yang akan dipisahkan.

4. Cara kerja kromatografi kertas

a. Memasukan 10 ml sampel cair atau 10 –25 gram sampel padatan ke dalam
gelas piala 100 ml.
b. Diasamkan dengan menambahkan 5 ml Asam asetat 10 %.
c. Memasukan dan merendam benang wool ke dalam sampel tersebut.
d. Memanaskan dan mendiamkan sampai mendidih ( 10 menit).
e. Mengambil benang wool, dicuci dengan air dan dibilas dengan aquades.
f. Menambahkan 25 ml amoniak 10 % ke dalam benang wool yang telah dibilas
tersebut.
g. Memanaskan benang wool sampai tertarik pada benang wool (luntur).
h. Benang wool dibuang, larutan diuapkan di atas water bath sampai kering.
i. Residu ditambah beberapa tetes metanol, Untuk ditotolkan pada kertas
kromatografi yang siap pakai.
j. Dieluasi dalam bejana dengan eluen sampai mencapai tanda batas.
k. Kertas kromatografi diangkat dan dibiarkan mengering.
l. Warna yang terjadi diamati, membandingkan Rf (Retardation factor) antara
Rf sampel dan Rf standar.

Perhitungan :

Rf = Jarak yang ditempuh komponen/Jarak yang ditempuh eluen

4. Analisis Data :
Identifikasi noda-noda pada kromatogram dapat dilakukan dengan
menentukan harga Rf (retardation factor) dari masing-masing noda tersebut.
Nilai Rf merupakan rasio jarak tempuh suatu komponen pada kromatogram
dengan jarak tempuh eluen.
5. Cara Kerja Spektrofotometer UV-VIS
Cara kerja spektrofotometer yaitu sinar dari sumber radiasi diteruskan menuju
monokromator. Cahaya dari monokramator diarahkan terpisah melalui sampel
dengan sebuah cermin berotasi. Detector menerima cahaya dari sampel secara
bergantin secara berulang-ulang, sinyal listrik dari detector diproses, diubah ke
digital dan dilihat hasilnya, selanjutnya perhitungan dilakukan dengan
computer yang sudah terprogram.
6. Prinsip dasar spektroskopi UV Vis adalah terjadinya transisi elektronik
yang disebabkan penyerapan sinar UV-Vis yang mampu mengeksitasi
elektron ke orbital kosong atau ke tingkat energi orbital yang lebih
tinggi. Umumnya, transisi yang paling memungkinkan adalah transisi
pada tingkat tertinggi (HOMO atau Highest Occupied Molecule Orbital)
ke orbital molekul yang kosong pada tingkat terendah (LUMO atau
Lowest Unoccupied Molecule Orbital). Pada sebagian besar molekul,
orbital molekul terisi pada tingkat terendah adalah yang lebih tinggi.
Orbital yang tidak berikatan atau non bonding (n) yang mengandung
 elektron-elektron yang belum berpasangan berada pada tingkat yang
lebih tinggi lagi, sedang orbital-orbital anti ikatan yang kosong yaitu σ*
dan π* menempati tingkat yang tertinggi [3]. Pergesaran pada rentang
panjang gelombang Uv Vis terbagi ada 2 yang umumnya biasa digunakan
dalam menentukan energi celah pita suatu material seperti
semikonduktor (berkaitan dengan sepktroskopi UV Vis DRS baca disini).
Pertama, pergesaran merah (red shift) yang terjadi menuju ke panjang
gelombang yang lebih besar atau tingkat energi yang lebih rendah.
Kedua, pergeseran biru (blue shift) yang terjadi menuju ke panjang
gelombang yang lebih rendah atau tingkat energi yang lebih tinggi.

7. Prosedur Pemakaian Spektrofometer UV-VIS

1. Putar tombol on-off (disebelah kiri) kekanan. Biarkan 15 menit
untukmemanaskan alat. Atur tombol sampai menunjuk angka nol pada
petunjuk%T.

2.Putar tombol pengatur panjang gelombang (yang ada di sebelah atas

alat)untuk memilah panjang gelombang sesuai panjang gelombang
yangdiinginkan.

3.Masukkan kuvet yang berisi paling sedikit 3 ml aquadest kedalam

tempatsampel (sebelum memasukkan kuvet, pastikan kuvet dalam keadaan
keringdengan mengeringkannya dengan kertas tissue (tutup penutup sampel.

4.Putar tombol pengatur cahaya (tombol yang terletak disebelah

kanan)sehingga %T menunjuk angka 100 atau A menunjuk angka nol.

5.Angkat kuvet yang berisi aquadest deri tempat sampel dengan tutup. Gantiisi
kuvet dengan larutan lampu, baca serapannya.

6.Ganti larutan blanko dalam kuvet dengan larutan standar atau larutan uji,
baca serapannya.
Question
1. Apa yang dimaksud dengan pewarna pangan?
2. Apa saja zat pewarna yang diizinkan penggunaan nya?
3. Apa saja zat pewarna yang dilarang penggunaannya?
4. Bagaimana cara identifikasi zat pewarna dalam sampel makanan?
5. Apa prinsip dari kromatografi kertas?
6. Bagaimana cara pemilihan eluen dalam kromatografi kertas?
7. Bagaimana cara kerja kromagrafi kertas?

Jawaban:
1. Pewarna kimia didefinisikan sebagai bahan kimia aktif karena
itu memerlukan perhatian yang lebih besar daripada aditif
lunak (bland) seperti emulsifier. Pewarna pangan alami adalah
diekstraksi dan diisolasi dari tanaman dan hewan yang berbeda
yang tidak memberikan efek yang membahayakan sehingga
mereka dapat digunakan dalam beberapa pangan dalam
jumlah tertentu. Pewarna ini memiliki kestabilan yang rendah,
kurang cerah dan tidak merata, namun sangat murah. Namun,
pewarna sintetik dan produk metabolitnya jika dikonsumsi
dalam jumlah besar memungkinkan toksik dan menyebabkan
kanker, deformasi dan lain-lain.
Warna makanan memegang peranan utama dalam penampilan
makanan, karena meskipun makanan tersebut lezat, tetapi
penampilannya tidak menarik waktu disajikan,
akan mengakibatkan selera orang yang akan
memakannya menjadi hilang.
2. Pewarna makanan terbagi menjadi dua, yaitu alami dan sintetis
(kimia). Pewarna alami terbuat dari bahan alami seperti
tumbuhan, hewan, dan mineral. Menurut Peraturan Kepala
Badan Pengawas Obat Dan Makanan (BPOM) Republik
Indonesia Nomor 37 Tahun 2013 Tentang Batas Maksimum
Penggunaan Bahan Tambahan Pangan Pewarna, daftar
pewarna alami yang diperbolehkan adalah kurkumin,
riboflavin, karmin dan ekstrak cochineal, klorofil, karamel,
 karbon tanaman, beta-karoten, ekstrak anato, karotenoid,
merah bit, antosianin, dan titanium dioksida.

Sedangkan pewarna sintesis yang diperbolehkan, namun

dibatasi penggunaannya, antara lain tartrazin, kuning kuinolin,
kuning FCF, karmoisin, ponceau, eritrosin, merah allura,
indigotin, biru berlian FCF, hijau FCF, dan cokelat HT. Pewarna
makanan sintesis tersebut diperoleh secara kimia dengan
mencampur dua atau lebih zat menjadi satu zat baru.
3. Pemerintah sudah memberikan daftar pewarna yang boleh
digunakan dalam makanan. Tetapi kenyataannya masih ada
saja pewarna bukan untuk makanan yang dicampurkan dalam
makanan. Dua di antaranya yang sering ditemukan di Indonesia
adalah rhodamin B dan metanil yellow.

i. Rhodamin B
Rhodamin B merupakan pewarna sintetis berbentuk serbuk
kristal, dan berwarna hijau atau ungu kemerahan. Biasanya
pewarna ini digunakan untuk mewarnai tekstil, kertas, dan
produk kosmetik. Namun tak jarang rhodamin B justru
dicampurkan ke dalam makanan, seperti kerupuk dan
jajanan kue, serta minuman.

Rhodamin B memiliki nama lain seperti D and C Red no 19.

Food Red 15, ADC Rhodamine B, Aizen Rhodamine, dan Acid
Brilliant Pink B. Pewarna ini diduga dapat menyebabkan
kanker, namun masih diperlukan penelitian lebih lanjut
untuk memastikan perkiraan tersebut.
ii. Metanil Yellow
Metanil yellow adalah pewarna sintetik berbentuk serbuk,
berwarna kuning kecokelatan, dan larut dalam air dan
alkohol. Pewarna yang satu ini umumnya digunakan sebagai
pewarna tekstil, kertas, tinta, plastik, kulit, cat, dan
sebagainya.

Makanan atau minuman yang dicampur dengan metanil

yellow biasanya akan berwarna kuning mencolok,
 berpendar, dan terdapat titik warna (warna tidak rata).
Pewarna ini bisa dijumpai pada aneka jajanan seperti
kerupuk, mie, tahu, dan gorengan.

Bila dikonsumsi, metanil yellow dapat menyebabkan iritasi

saluran cerna, mual, muntah, sakit perut, diare, demam,
lemah, dan hipotensi (tekanan darah rendah).
Mengonsumsi metanil yellow dalam jangka panjang
dikhawatirkan dapat memengaruhi sistem saraf pusat dan
menyebabkan kanker kandung kemih.

4. Analisis yang dilakukan di laboratorium meliputi dua tahap.

Yaitu tahap identifikasi (analisis kualitatif) terhadap kandungan
pewarna sintetis yang terdapat dalam sampel, kemudian tahap
pengukuran kadar pewarna sintetik yang teridentifikasi pada
sampel (analisis kuantitatif).
Salah satu tahapan uji kualitatif adalah ekstraksi. Ekstraksi pada
minuman tak beralkohol dapat dilakukan secara langsung,
sehingga zat warna dapat langsung ditarik dengan benang wol.
Untuk contoh makanan jajanan dengan komponen utama pati
dan contoh makanan jajanan yang mengandung banyak lemak
dilakukan ekstraksi dengan menggunakan pelarut organik. Hasil
ekstraksi dipekatkan dengan pelarut organik. Kemudian zat
warna ditarik dengan benang wol dalam suasana asam dengan
pemanasan. Zat warna yang terikat pada benang wol
dilarutkan dalam larutan ammonium hidroksida disertai
pemanasan. Pada penelitian ini ekstraksi dilakukan pada
suasana asam menggunakan asam asetat 10 % serta pada
suasana basa menggunakan amoniak 10%, dengan isolasi dan
absorpsi oleh benang wool. Pada proses ekstraksi diperoleh
pewarna sintetis asam, sedangkan pewarna sintetis basa tidak
ditemukan, karena pada waktu ekstraksi oleh benang wool
bebas lemak dengan penambahan amoniak 10% warna tidak
tertarik oleh benang.

Larutan ammonium hidroksida dipekatkan dan pekatan zat

warna hasil isolasi pada preparasi contoh makanan jajanan
 ditotolkan (spotting) pada jarak kira-kira 2 cm dari ujung kertas
kromatografi. Jumlah sampel yang ditotolkan kurang lebih 1µl,
dengan menggunakan mikropipet. Tetesan sampel harus
diusahakan sekecil mungkin dengan meneteskan berulang kali,
dibiarkan mengering sebelum totolan berikutnya dikerjakan.
Pengembangan dilakukan dengan mencelupkan dasar kertas
kromatografi yang telah ditotoli sampel dalam sistem pelarut
untuk proses pengembangan. Proses pengembangan dilakukan
dengan cara dikerjakan searah atau satu dimensi.

5. Prinsip Kromatografi Kertas adalah adsorbsi dan kepolaran,

dimana adsorbsi didasarkan pada panjang komponen dalam
campuran yang diadsorbsi pada permukaan fase diam dan
kepolaran komponen berpengaruh karena komponen akan
larut dan terbawa oleh pelarut jika memiliki kepolaran yang
sama serta kecepatan migrasi pada fase diam dan fase gerak.
Sedangkan prinsip kerja kromatografi kertas adalah pelarut
bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen bergerak
pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan
pada perbedaan bercak warna.

6. Fase gerak pada kromatografi kertas merupakan eluen berupa

campuran yang terdiri atas satu komponen organik yang
utama, air, dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa,
atau pereaksi-pereaksi kompleks untuk memperbesar
kelarutan dari beberapa senyawa atau untuk mengurangi yang
lainnya. Pelarut yang digunakan adalah pelarut yang memiliki
kemurnian tinggi dan mudah menguap. Pemilihan pelarut
organic ini sangat penting karena akan menentukan
keberhasilan pemisahan. Pemilihan pelarut disesuaikan dengan
kepolaran komponen yang akan dianalisa. Pendekatan
polaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut.
Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang
bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar. Sebaliknya,
senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non
polar dari pada fase gerak yang polar.
 Tiap eluen memiliki perbandingan tertentu dalam
campurannya, sehingga untuk menghasilkan campuran dengan
perbandingan yang sesuai harus dibuat secara hati-hati dan
teliti. Karena mudah menguap, maka eluen harus dibuat baru
untuk menjamin agar komposisi dalam campurannya tetap
dapat dipertahankan hingga akhir elusi. Senyawa organik polar
akan lebih mudah larut dalam air dari pada dalam zat cair
organik. Oleh karena itu, gerakan komponen akan lambat jika
digunakan pelarut anhidrida, namun penambahan air dalam
eluen akan menyebabkan komponen-komponen dalam sampel
akan bergerak mengikuti gerakan eluen.

7. Setetes larutan cuplikan yang mengandung campuran yang

akan dipisahkan ditotolkan pada daerah yang telah diberi
tanda di atas sepotong kertas kromatografi dimana totolan
tersebut akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda
telah kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang
sesuai dengan satu ujung, dimana totolan ditempatkan,
tercelup dalam pelarut yang telah dipilih sebagai fasa gerak.
Totolan noda tidak boleh tercelup karena apabila tercelup
berarti senyawa yang dipisahkan akan terlarut dari kertas.
Pelarut bergerak melalui serat-serat dari kertas oleh gaya
kapiler dan menggerakkan komponen-komponen dari
campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran
pelarut. Perlu diperhatikan bahwa permukaan dari kertas
jangan sampai terlalu basah dengan pelarut karena akan
menyebabkan daerah noda menjadi kabur dan tidak dapat
dipisahkan sama sekali.

Terdapat berbagai teknik elusi pada kromatografi kertas, yaitu:

1. Kromatografi Kertas Satu Arah

i. Metode Ascending (Penaikan)
Pada metode ini, eluen diletakkan di bagian bawah bejana kemudian kertas
dicelupkan di atasnya. Eluen akan merambat ke atas dengan gaya kapiler dan
laju perambatan yang pelan dan semakin lama akan semakin menurun karena
pengaruh dari gaya berat. Namun demikian, perambatan yang pelan akan
memperbesar kemungkinan untuk tercapainya kesetimbangan sehingga
menghasilkan pemisahan yang baik.

ii. Metode Descending (Penurunan)

Pada metode penurunan, eluen ditempatkan di bagian atas kemudian
perambatan noda dan eluen memiliki arah menuruni kertas.

iii. Metode Mendatar (Radial)

Pada metode mendatar, kertas yang digunakan berbentuk bulat kemudian
dibagi menggunakan pensil sejumlah totolan yang akan dibuat dilebihkan satu.
Salah satu bagian tersebut kemudian dipotong menuju titik tengah kertas
tetapi tidak sampai terputus. Potongan tersebut nantinya akan berfungsi
sebagai sumbu untuk merambatkan eluen ke bagian tengah kertas. Garis awal
rambatan yang akan diberi totolan dibuat menggunakan jangka.

2. Kromatografi Kertas Dua Arah (Dua Dimensi)

Pada metode ini, elusi dilakukan secara berturut-turut dalam dua arah yang
saling tegak lurus. Kertas berbentuk persegi dan sampel ditotolkan pada salah
satu sudut.terdapat dua macam eluen yang digunakan pada kromatografi
kertas metode ini. Elusi pertama dilakukan dengan campuran eluen pertama.
Setelah itu lembaran kertas diambil dan dikeringkan kemudian dielusi dengan
eluen yang kedua, dengan posisi kertas diputar 90o. Dengan cara ini,
komponen yang tidak terpisah secra maksimal pada elusi yang pertama, akan
terpisah dengan lebih baik pada elusi kedua.
Metode ini digunakan untuk memisahkan sampel dengan komponen yang
banyak dan memiliki nilai Rf berdekatan antara komponen yang satu dengan
yang lainnya, misalnya asam-asam amino.