Isolasi, Budaya, dan Identifikasi Virus

TUJUAN PEMBELAJARAN

Diskusikan mengapa virus pada awalnya digambarkan sebagai agen yang dapat disaring

Jelaskan budidaya virus dan pengumpulan serta penanganan spesimen

Bandingkan teknik in vivo dan in vitro yang digunakan untuk membudidayakan virus

Di awal bab ini, kami menjelaskan bagaimana filter Chamberland porselen dengan pori-pori
yang cukup kecil untuk memungkinkan virus melewatinya digunakan untuk menemukan TMV.
Saat ini, filter porselen telah diganti dengan filter membran dan perangkat lain yang digunakan
untuk mengisolasi dan mengidentifikasi virus.

Isolasi Virus

Tidak seperti bakteri, yang banyak di antaranya dapat tumbuh pada media nutrisi buatan,
virus membutuhkan sel inang yang hidup untuk replikasi. Sel inang yang terinfeksi (eukariotik
atau prokariotik) dapat dibudidayakan dan ditumbuhkan, kemudian media pertumbuhannya dapat
dipanen sebagai sumber virus. Virion dalam media cair dapat dipisahkan dari sel inang dengan
sentrifugasi atau filtrasi. Filter secara fisik dapat menghapus apa pun yang ada dalam larutan
yang lebih besar dari virion; virus kemudian dapat dikumpulkan di filtrat (lihat Gambar 1).

Gambar 1. Filter membran dapat digunakan untuk menghilangkan sel atau virus dari suatu larutan. (a) Pemindaian
mikrograf elektron ini menunjukkan sel-sel bakteri berbentuk batang yang ditangkap pada permukaan filter
membran. Perhatikan perbedaan perbandingan ukuran pori-pori membran dan bakteri. Virus akan melewati filter ini.
(b) Ukuran pori-pori di filter menentukan apa yang ditangkap di permukaan filter (hewan [merah] dan bakteri [biru])
dan dikeluarkan dari cairan yang lewat. Perhatikan bahwa virus (hijau) melewati filter yang lebih halus. (kredit a:
modifikasi pekerjaan oleh Departemen Energi AS)
PIKIRKAN TENTANG ITU

Berapa ukuran pori filter yang dibutuhkan untuk mengumpulkan virus?

Budidaya Virus

Virus dapat ditumbuhkan secara in vivo (dalam organisme hidup, tumbuhan, atau hewan)
atau in vitro (di luar organisme hidup dalam sel dalam lingkungan buatan, seperti tabung reaksi,
labu kultur sel, atau piring agar). Bakteriofag dapat tumbuh dengan adanya lapisan bakteri yang
padat (juga disebut rumput bakteri ) yang ditanam dalam agar lembut 0,7% dalam cawan Petri
atau labu datar (horizontal) (lihat Gambar 2). Konsentrasi agar-agar diturunkan dari 1,5% yang
biasanya digunakan dalam pembiakan bakteri. Agar lembut 0,7% memungkinkan bakteriofag
dengan mudah berdifusi melalui media. Untuk bakteriofag litik, lisis dari inang bakteri kemudian
dapat dengan mudah diamati ketika zona bening disebut plak.terdeteksi (lihat Gambar 2). Saat
fag membunuh bakteri, banyak plak diamati di antara rumput bakteri yang keruh.

Gambar 2. (a) Labu seperti ini dapat digunakan untuk membiakkan sel manusia atau hewan untuk pembiakan virus.
(b) Lempeng ini mengandung bakteriofag T4 yang tumbuh di halaman rumput Escherichia coli . Plak bening terlihat
di mana sel-sel bakteri inang telah dilisis. Titer virus meningkat di pelat sebelah kiri. (kredit a: modifikasi karya oleh
National Institutes of Health; kredit b: modifikasi karya oleh American Society for Microbiology)

Virus hewan membutuhkan sel dalam hewan inang atau sel kultur jaringan yang berasal
dari hewan. Budidaya virus hewan penting dilakukan untuk 1) identifikasi dan diagnosis virus
patogen pada spesimen klinis, 2) produksi vaksin, dan 3) studi penelitian dasar. Sumber inang in
vivo dapat berupa embrio yang berkembang dalam telur burung berembrio (misalnya ayam,
kalkun) atau hewan utuh. Misalnya, sebagian besar vaksin influenza yang diproduksi untuk
program vaksinasi flu tahunan dibudidayakan dalam telur ayam.

Embrio atau hewan inang berfungsi sebagai inkubator untuk replikasi virus (lihat Gambar
3). Lokasi di dalam embrio atau hewan inang penting. Banyak virus memiliki tropisme jaringan,
dan oleh karena itu harus dimasukkan ke dalam situs tertentu untuk pertumbuhan. Dalam embrio,
situs target termasuk rongga ketuban, membran chorioallantoic, atau kantung kuning telur.
Infeksi virus dapat merusak membran jaringan, menghasilkan lesi yang disebut cacar;
mengganggu perkembangan embrio; atau menyebabkan kematian embrio.
 Gambar 3. (a) Sel-sel di dalam telur ayam digunakan untuk membiakkan berbagai jenis virus. (b) Virus dapat
direplikasi di berbagai lokasi di dalam telur, termasuk membran chorioallantoic, rongga ketuban, dan kantung
kuning telur. (kredit a: modifikasi karya "Chung Hoang" / YouTube)

Untuk penelitian in vitro, berbagai jenis sel dapat digunakan untuk mendukung
pertumbuhan virus. Sebuah kultur sel primerdibuat baru dari organ atau jaringan hewan. Sel
diekstraksi dari jaringan dengan pengikisan atau pemotongan mekanis untuk melepaskan sel atau
dengan metode enzimatik menggunakan tripsin atau kolagenase untuk memecah jaringan dan
melepaskan sel tunggal ke dalam suspensi. Karena persyaratan ketergantungan penjangkaran,
kultur sel primer memerlukan media kultur cair dalam cawan Petri atau labu kultur jaringan
sehingga sel memiliki permukaan padat seperti kaca atau plastik untuk menempel dan tumbuh.
Budaya primer biasanya memiliki masa hidup yang terbatas. Ketika sel-sel dalam kultur primer
mengalami mitosis dan kepadatan sel yang cukup diproduksi, sel-sel bersentuhan dengan sel lain.
Ketika kontak sel-ke-sel ini terjadi, mitosis dipicu untuk berhenti. Ini disebut penghambatan
kontakdan mencegah kepadatan sel menjadi terlalu tinggi. Untuk mencegah penghambatan
kontak, sel-sel dari kultur sel primer harus dipindahkan ke wadah lain dengan media
pertumbuhan segar. Ini disebut kultur sel sekunder. Secara berkala, kepadatan sel harus
dikurangi dengan membuang beberapa sel dan menambahkan media segar untuk menyediakan
ruang dan nutrisi untuk mempertahankan pertumbuhan sel. Berbeda dengan kultur sel primer,
garis sel kontinu , biasanya berasal dari sel yang berubah atau tumor, seringkali dapat disubkultur
berkali-kali atau bahkan tumbuh tanpa batas (dalam hal ini disebut abadi). Garis sel
berkelanjutan mungkin tidak menunjukkan ketergantungan penjangkaran(mereka akan tumbuh
dalam suspensi) dan mungkin telah kehilangan penghambatan kontak mereka. Akibatnya, garis
sel kontinyu dapat tumbuh di tumpukan atau gumpalan yang menyerupai pertumbuhan tumor
kecil (lihat Gambar 4).
 Gambar 4. Sel untuk kultur disiapkan dengan memisahkannya dari matriks jaringannya. (a) Kultur sel primer
tumbuh menempel pada permukaan wadah kultur. Penghambatan kontak memperlambat pertumbuhan sel setelah
menjadi terlalu padat dan mulai saling bersentuhan. Pada titik ini, pertumbuhan hanya bisa dipertahankan dengan
membuat budaya sekunder. (b) Kultur sel kontinyu tidak terpengaruh oleh penghambatan kontak. Mereka terus
tumbuh terlepas dari kepadatan selnya. (kredit “mikrograf”: modifikasi karya oleh Pusat Pengendalian dan
Pencegahan Penyakit)

Contoh garis sel yang abadi adalah garis sel HeLa , yang awalnya dibudidayakan dari sel
tumor yang diperoleh dari Henrietta Lacks , seorang pasien yang meninggal karena kanker
serviks pada tahun 1951. Sel HeLa adalah garis sel kultur jaringan pertama yang
berkesinambungan dan digunakan untuk menetapkan kultur jaringan sebagai teknologi penting
untuk penelitian dalam biologi sel, virologi, dan kedokteran. Sebelum penemuan sel HeLa, para
ilmuwan tidak dapat membuat kultur jaringan dengan keandalan atau stabilitas apa pun. Lebih
dari enam dekade kemudian, garis sel ini masih hidup dan digunakan untuk penelitian medis.
Lihat "Garis Sel Abadi Kekurangan Henrietta" di bawah ini untuk membaca lebih lanjut tentang
garis sel penting ini dan cara kontroversial yang digunakan untuk memperolehnya.

PIKIRKAN TENTANG ITU

Sifat sel apa yang membuat pengenceran kultur sel primer secara berkala diperlukan?

GARIS SEL ABADI HENRIETTA KEKURANGAN

Pada Januari 1951, Henrietta Lacks , seorang wanita Afrika-Amerika berusia 30 tahun
dari Baltimore, didiagnosis menderita kanker serviks di Rumah Sakit John Hopkins. Kita
sekarang tahu bahwa kankernya disebabkan oleh human papillomavirus (HPV). Efek sitopatik
dari virus mengubah karakteristik selnya dalam proses yang disebut transformasi, yang memberi
sel kemampuan untuk membelah secara terus menerus. Kemampuan ini, tentu saja,
menghasilkan tumor kanker yang akhirnya membunuh Ny. Lacks pada bulan Oktober di usia 31.
Sebelum kematiannya, sampel sel kankernya diambil tanpa sepengetahuan atau seizinnya.
Sampel akhirnya menjadi milik Dr. George Gey, seorang peneliti biomedis di Universitas Johns
Hopkins. Gey mampu menumbuhkan beberapa sel dari sampel Lacks, menciptakan apa yang
sekarang dikenal sebagai yang abadiGaris sel HeLa . Sel-sel ini memiliki kemampuan untuk
hidup dan tumbuh tanpa batas dan, bahkan hingga saat ini, masih digunakan secara luas di
banyak bidang penelitian.

Menurut suami Lacks, baik Henrietta maupun keluarganya tidak memberikan izin kepada
rumah sakit untuk mengambil spesimen jaringannya. Memang, keluarga tidak menyadari sampai
20 tahun setelah kematian Lacks bahwa sel-selnya masih hidup dan secara aktif digunakan untuk
tujuan komersial dan penelitian. Namun sel HeLa telah menjadi sangat penting dalam berbagai
penemuan penelitian yang berkaitan dengan polio, kanker, AIDS, dan penyakit lainnya. Sel-sel
tersebut juga telah dikomersialkan, meskipun mereka sendiri tidak pernah dipatenkan. Meskipun
demikian, perkebunan Henrietta Lacks tidak pernah mendapat manfaat dari penggunaan sel,
meskipun, pada tahun 2013, keluarga Lacks diberi kendali atas publikasi urutan genetik selnya.

Gambar 5. Gambar fluoresensi multifoton sel HeLa dalam kultur. Berbagai noda fluoresen telah digunakan untuk
menunjukkan DNA (cyan), mikrotubulus (hijau), dan badan Golgi (oranye). (kredit: modifikasi pekerjaan oleh
National Institutes of Health)

Kasus ini menimbulkan beberapa masalah bioetika seputar informed consent pasien dan
hak untuk tahu. Pada saat jaringan Lacks diambil, tidak ada hukum atau pedoman tentang
persetujuan yang diinformasikan. Apakah itu berarti dia diperlakukan dengan adil pada saat itu?
Tentu menurut standar sekarang, jawabannya adalah tidak. Mengambil jaringan atau organ dari
pasien yang sekarat tanpa persetujuan tidak hanya dianggap tidak etis tetapi juga ilegal, terlepas
dari apakah tindakan seperti itu dapat menyelamatkan nyawa pasien lain. Jadi, apakah etis bagi
para ilmuwan untuk terus menggunakan jaringan Lacks untuk penelitian, meskipun jaringan
tersebut diperoleh secara ilegal menurut standar saat ini?

Etis atau tidak, sel Lacks banyak digunakan saat ini untuk banyak aplikasi sehingga tidak
mungkin untuk mencantumkan semuanya. Apakah ini kasus di mana tujuan membenarkan cara?
Akankah Lacks senang mengetahui tentang kontribusinya bagi sains dan jutaan orang yang telah
memperoleh manfaat? Apakah dia ingin keluarganya diberi kompensasi untuk produk komersial
yang telah dikembangkan menggunakan selnya? Atau akankah dia merasa dilecehkan dan
dieksploitasi oleh para peneliti yang mengambil bagian tubuhnya tanpa persetujuannya? Karena
dia tidak pernah ditanya, kita tidak akan pernah tahu.

Deteksi Virus

Terlepas dari metode kultivasinya, setelah virus dimasukkan ke dalam organisme inang,
embrio, atau sel kultur jaringan, sampel dapat dibuat dari inang, embrio, atau garis sel yang
terinfeksi untuk analisis lebih lanjut di bawah medan terang, elektron. , atau mikroskop
fluorescent. Efek sitopatik (CPE) adalah kelainan sel yang dapat diamati yang berbeda karena
infeksi virus. CPE dapat berupa hilangnya kelekatan pada permukaan wadah, perubahan bentuk
sel dari datar menjadi bulat, penyusutan nukleus, vakuola dalam sitoplasma, fusi membran
sitoplasma dan pembentukan sinkronisasi multinuklear, badan inklusi dalam nukleus atau
sitoplasma , dan lisis sel lengkap (lihat Tabel 1).

Perubahan patologis lebih lanjut termasuk gangguan virus dari genom inang dan
mengubah sel normal menjadi sel yang diubah, yang merupakan jenis sel yang terkait dengan
karsinoma dan sarkoma. Jenis atau tingkat keparahan CPE tergantung pada jenis virus yang
terlibat. Tabel 1 mencantumkan CPE untuk virus tertentu.
Uji Hemaglutinasi

Tes serologis digunakan untuk mendeteksi keberadaan jenis virus tertentu dalam serum
pasien. Serum adalah fraksi cair plasma darah berwarna jerami dimana faktor pembekuan telah
dihilangkan. Serum dapat digunakan dalam uji langsung yang disebut uji hemaglutinasi untuk
mendeteksi jenis virus tertentu dalam sampel pasien. Hemaglutinasi adalah aglutinasi
(penggumpalan) bersama dari eritrosit (sel darah merah). Banyak virus menghasilkan protein
permukaan atau paku yang disebut hemagglutinins yang dapat mengikat reseptor pada membran
eritrosit dan menyebabkan sel menggumpal. Hemaglutinasi dapat diamati tanpa menggunakan
mikroskop, tetapi metode ini tidak selalu membedakan antara partikel virus yang menular dan
tidak menular, karena keduanya dapat menggumpalkan eritrosit.

Untuk mengidentifikasi virus patogen tertentu dengan menggunakan hemaglutinasi, kita

harus menggunakan pendekatan tidak langsung. Protein yang disebut antibodi, yang dihasilkan
oleh sistem kekebalan pasien untuk melawan virus tertentu, dapat digunakan untuk mengikat
komponen seperti hemaglutinin yang secara unik terkait dengan jenis virus tertentu. Pengikatan
antibodi dengan hemagglutinin yang ditemukan pada virus kemudian mencegah eritrosit
berinteraksi langsung dengan virus. Jadi ketika eritrosit ditambahkan ke virus yang dilapisi
antibodi, tidak terlihat adanya aglutinasi; aglutinasi telah dihambat. Kami menyebut jenis
pengujian tidak langsung ini untuk pengujian antibodi spesifik virus hemagglutination inhibition
(HAI).. HAI dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang spesifik untuk
berbagai jenis virus yang mungkin menyebabkan atau telah menyebabkan infeksi pada pasien
bahkan beberapa bulan atau tahun setelah infeksi (lihat Gambar 6). Pengujian ini dijelaskan
secara lebih rinci dalam Pengujian Aglutinasi .
 Gambar 6. Bagan ini menunjukkan hasil yang mungkin dari tes hemaglutinasi. Baris A: Eritrosit tidak saling
mengikat dan akan tenggelam ke dasar pelat sumur; ini menjadi terlihat sebagai titik merah di tengah sumur. Baris
B: Banyak virus memiliki hemaglutinin yang menyebabkan aglutinasi eritrosit; hemaglutinasi yang dihasilkan
membentuk struktur kisi yang menghasilkan warna merah di seluruh sumur. Baris C: Antibodi khusus virus, virus,
dan eritrosit ditambahkan ke pelat sumur. Antibodi spesifik virus menghambat aglutinasi, seperti yang terlihat
sebagai titik merah di dasar sumur. (kredit: modifikasi pekerjaan oleh Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit)

PIKIRKAN TENTANG ITU

Apa hasil tes HIA positif?

Uji Amplifikasi Asam Nukleat

Tes amplifikasi asam nukleat (NAAT) digunakan dalam biologi molekuler untuk
mendeteksi urutan asam nukleat unik dari virus dalam sampel pasien. Polymerase chain reaction
(PCR) adalah NAAT yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan DNA virus dalam jaringan
atau sampel cairan tubuh pasien. PCR adalah teknik yang memperkuat (yaitu, mensintesis
banyak salinan) dari segmen DNA virus yang diinginkan. Menggunakan PCR, urutan nukleotida
pendek yang disebut primer mengikat urutan spesifik DNA virus, memungkinkan identifikasi
virus.

Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) adalah NAAT yang digunakan untuk mendeteksi

keberadaan virus RNA. RT-PCR berbeda dari PCR karena enzyme reverse transcriptase (RT)
digunakan untuk membuat cDNA dari sejumlah kecil RNA virus dalam spesimen. CDNA
kemudian dapat diperkuat dengan PCR. Baik PCR dan RT-PCR digunakan untuk mendeteksi
dan memastikan keberadaan asam nukleat virus dalam spesimen pasien.

HPV SCARE

Michelle, seorang mahasiswa perawat berusia 21 tahun, datang ke klinik universitas

karena khawatir dia mungkin terkena penyakit menular seksual (PMS). Pasangan seksualnya
baru-baru ini mengembangkan beberapa benjolan di pangkal penisnya. Dia sempat menunda
pergi ke dokter, tapi Michelle menduga itu kutil kelamin yang disebabkan oleh HPV. Dia sangat
prihatin karena dia tahu bahwa HPV tidak hanya menyebabkan kutil tetapi merupakan penyebab
utama kanker serviks. Dia dan pasangannya selalu menggunakan kondom untuk kontrasepsi,
tetapi dia tidak yakin tindakan pencegahan ini akan melindunginya dari HPV.

Dokter Michelle tidak menemukan tanda-tanda fisik kutil kelamin atau penyakit menular
seksual lainnya, tetapi merekomendasikan agar Michelle melakukan Pap smear bersama dengan
tes HPV. Pap smear akan menyaring sel-sel serviks yang abnormal dan CPE yang terkait dengan
HPV; tes HPV akan menguji keberadaan virus. Jika kedua tes tersebut negatif, Michelle dapat
lebih yakin bahwa dia kemungkinan besar tidak terinfeksi HPV. Namun, dokternya menyarankan
mungkin bijaksana bagi Michelle untuk mendapatkan vaksinasi HPV untuk melindungi dirinya
dari kemungkinan paparan di masa depan.
Mengapa dokter Michelle memesan dua tes berbeda alih-alih mengandalkan satu atau yang lain?

Enzim Immunoassay

Enzim immunoassay (EIA) mengandalkan kemampuan antibodi untuk mendeteksi dan

menempel pada biomolekul spesifik yang disebut antigen. Antibodi pendeteksi menempel pada
antigen target dengan tingkat spesifisitas yang tinggi dalam apa yang mungkin merupakan
campuran kompleks biomolekul. Juga termasuk dalam jenis pengujian ini adalah enzim tak
berwarna yang melekat pada antibodi pendeteksi. Enzim bertindak sebagai penanda pada
antibodi pendeteksi dan dapat berinteraksi dengan substrat tak berwarna, yang mengarah ke
produksi produk akhir berwarna. AMDAL sering kali mengandalkan lapisan antibodi untuk
menangkap dan bereaksi dengan antigen, yang semuanya melekat pada filter membran (lihat
Gambar 7). AMDAL untuk antigen virus sering digunakan sebagai tes skrining awal. Jika
hasilnya positif, konfirmasi lebih lanjut akan membutuhkan tes dengan sensitivitas yang lebih
besar, seperti awestern blot atau NAAT . AMDAL dibahas lebih rinci dalam AMDAL dan
ELISA .

Gambar 7. Klik untuk melihat gambar yang lebih besar. Mirip dengan tes kehamilan yang cepat dan bebas resep,
AMDAL untuk antigen virus memerlukan beberapa tetes serum atau plasma pasien yang diencerkan yang dioleskan
ke filter membran. Filter membran sebelumnya telah dimodifikasi dan disematkan dengan antibodi terhadap antigen
virus dan kontrol internal. Konjugat antibodi ditambahkan ke filter, dengan antibodi yang ditargetkan melekat pada
antigen (dalam kasus tes positif). Konjugasi berlebih dicuci dari filter. Substrat ditambahkan untuk mengaktifkan
reaksi yang dimediasi oleh enzim untuk menunjukkan perubahan warna pada tes positif. (kredit: modifikasi karya
oleh "Cavitri" / Wikimedia Commons)
PIKIRKAN TENTANG ITU

Apa yang biasanya menunjukkan tes EIA positif?

FOKUS KLINIS: JOAQUIM, BAGIAN 3

Contoh ini melanjutkan cerita Joaquim yang dimulai sebelumnya tentang Virus .

Bersamaan dengan analisis RT / PCR, air liur Joaquim juga dikumpulkan untuk budidaya
virus. Secara umum, tidak ada uji diagnostik tunggal yang cukup untuk diagnosis antemortem,
karena hasilnya akan bergantung pada sensitivitas uji, jumlah virion yang ada pada saat
pengujian, dan waktu uji, sejak pelepasan virion dalam air liur. bisa bervariasi. Ternyata, hasil
budidaya virus dari air liur negatif. Hal ini tidak mengherankan bagi dokter Joaquim, karena satu
hasil negatif bukanlah indikasi mutlak tidak adanya infeksi. Mungkin saja jumlah virion dalam
air liur rendah pada saat pengambilan sampel. Bukan hal yang aneh untuk mengulangi pengujian
dalam interval untuk meningkatkan kemungkinan mendeteksi muatan virus yang lebih tinggi.

Haruskah dokter Joaquim mengubah pengobatannya berdasarkan hasil tes ini?

Kami akan kembali ke contoh Joaquim di halaman selanjutnya.

KONSEP DAN RINGKASAN KUNCI

Budidaya virus membutuhkan kehadiran beberapa bentuk sel inang (organisme utuh, embrio,
atau kultur sel).

Virus dapat diisolasi dari sampel dengan penyaringan.

Filtrat virus adalah sumber yang kaya dari virion yang dilepaskan.

Bakteriofag dideteksi dengan adanya plak bening di rumput bakteri.

Virus hewan dan tumbuhan dideteksi dengan efek sitopatik , teknik molekuler (PCR, RT-PCR),
enzim immunoassay, dan uji serologis (uji hemaglutinasi, uji penghambatan hemaglutinasi).