Bioteknologi

Minggu ke-2

Proses transkripsi, translasi, dam replikasi di eukariot karna ada nucleus.

Protein diproduksi tidak asal. Kode awal yg dimiliki DNA kita mendapatkan melalui PCR (cetakan DNA) yg
nantinya untuk mengkode protein.

Pembentukkan RNA dengan cetakan DNA -> transkripsi. RNA akan digunakan sbg cetakan untuk
membentuk protein. Kalau DNA yg berubah jadi RNA, kromosomnya akan habis. Karena DNA yang ada di
kromosom yang dijadikan cetakan.

Kalau di prokariot, ketiga proses tersebut terjadi di sitoplasma. Kalau eukariot, transkripsi dan replikasi
di nucleus sedangkan translasi di sitoplasma. Terkait dengan transkripsi di eukariot, RNA yg terbentuk
blm matang yg disebut pre-RNA. Kalau sudah matang disebut mature mRNA.

Transkripsi itu menghasilkan mRNA, sebagian ada yang berubah jd protein nanti masuk ke sitoplasma.
Kalau tidak diubah menjadi protein dia lgsg bekerja sbg mRNA (yang membawa cetakan untuk translasi).
mRNA ada dua kalau di eukariot, yaitu pre-mRNA (belum matang) dan mature mRNA (matang). Yang
masuk ke sitoplasma itu yg mature mRNA. Yang membedakan mature mRNA dan pre mRNA, kalau
mature mRNA di 5’ ada cap, di 3’ poliatail (Adenin banyak sekali di ekornya), dan ada suatu peristiwa
yang menyebabkan intron ilang jadi tidak memiliki intron (bagian mRNA yang tidak mengkode protein).
Mature mRNA sudah mengalami splicing jadi hanya memiliki intron. mRNA sebelum matang itu ada
selang-seling, ekstron intron ekstron intron dst.

Struktur gen prokariot

Ada yang tidak diregulasi dan diregulasi.

 1. Tidak diregulasi/Konstitutif
Komponennya ada:
- Promotor : tempat duduknya RNA polymerase
- Inisiasi transkripsi/+1 : menginisiasi mulainya transkripsi
- RBS (ribosom binding site) : tempat menempelnya ribosom
- Coding Sequence/Open Reading Sequence : start kodon-stop kodon
- Kodon start
- Kodon stop
- Terminator : menghentikan transkripsi

Gen adalah fragmen DNA yg berawal di promotor dan berakhir di terminator, dia akan
mengkode sesuatu. Produk gen bisa berhenti di RNA saja (Trna, mRNA) atau bisa sampai
menjadi protein (insulin). Komponennya berupa DNA.

Komponennya ada yg bekerja di proses transkripsi dan translasi. Kalau bekerja di transkripsi
maka bekerja dalam bentuk RNA (promotor, +1, terminator). Proses transkrip dan translasi dari
5’ ke 3’, kalau arahnya berbalik, artinya yang menjadi kode untuk diproses menjadi protein itu
adanya di untai yg bawah.

Translasi dari mRNA yg terbentuk dr transkripsi digunakan utk cetakan translasi, nanti
membutuhkan situs yg disebut RBS (tempat melekatnya ribosom), nanti akan mulai mengkode
asam amino di start kodon (setelah RBS) kemudian akan berhenti di kodon stop. Tidak mungkin
terminator letaknya di kodon stop karena nanti RNA nya tidak ada. Kalau

Contoh gen yang tidak diregulasi, housekeeping gene. Kl tidak diregulasi jumlah gennya akan
selalu tetap.

Cara penyebutan posisi :

- Promotor adanya di upstream inisiasi transkripsi

- Inisiasi transkripsi downstream thd promotor

Bagian yang berperan dlm transkripsi adalah promotor, teriminator, dan +1. Yang berperan dalam
translasi adalah RBS karna dia tempat nempelnya ribosom, kodon start, dan kodon stop.

DNA : promotor, operator, situs activator, dan terminator (gen)

RNA : RBS, kodon start, dan kodon stop.

 RNA, +1 sampai sebelum terminator

protein, kodon start sampai kodon stop.

2. Yang diregulasi
Komponen :
- Situs aktivator : membantu RNA menjalankan fungsinya, bekerja ketika diduduki aktivator
(protein). Upstream dr promotor. Kalau ada yg duduk di situs aktivator, membantu RNA
polimerase menjalankan fungsinya. Yang menduduki adalah aktivator (protein).
- Promotor : untuk diduduki RNA polimerase.
- Operator : posisinya di depan promotor, artinya kalau ada yg menduduki operator maka
peristiwa transkripsi akan terhalang. Yang duduk di operator adalah represor (protein).
Bekerja ketika diduduki represor (protein). Di antara promotor dan +1.
- Terminator : menghentikan proses transkripsi
- RBS : diduduki oleh ribosom, yang menandakan peristiwa translasi
- Kodon start
- Kodon stop : berenti peristiwa translasi

RBS : RNA, dikode oleh DNA. Berfungsinya ketika dalam bentuk RNA. Ketika dalam bentuk DNA
kita bisa tahu bahwa itu merupakan RBS.
Situs aktivator : DNA
Aktivator : DNA

Situs aktivator dan operator berperan dalam regulasi maka gen yang memiliki keduanya disebut
gen yang diregulasi. Komponennya berupa DNA. Kehadiran situs aktivator dan operator tidak
harus berbarengan. Kadang hanya ada salah satu. Ada gen yang mengandung operator, ada gen
yang memiliki situs aktivator, ada juga yang memiliki keduanya.
RNA, +1 sampai kodon stop.

Protein, kodon start sampai kodon stop.

Struktur Eukariot

Eukariot lebih kompleks.

Promotornya bisa di hulu, bisa di dalam, beragam. Yang harus diingat, kalau buat eukariot untuk
menjadi protein yg kita perlukan adalah kode dr mRNA matang yang hanya mengandung ekson. Kita
dapat DNA belum tentu urutan proteinnya. Ini penting ketika orang biotek mau memproduksi protein
eukariot di organisme prokariot.

Ketika mau memproduksi protein eukariot di prokariot, RNA matangnya kita ambil dan dibalikkan jadi
DNA peristiwa ini disebut transkripsi balik yang menggunakan enzim DNA polimerase, nama umumnya
RNA dependent DNA polimerase, nama lainnya reverse transkriptase. Nanti DNA yang terbentuk disebut
cDNA, dan ini yang kita olah untuk membentuk RNA dan protein.

Kalau replikasi, DNA dependent DNA polimerase. DNA dependent RNA polimerase. Karna kalau virus
corona, virus RNA itu butuh membuat RNA untuk virus baru, dia genomnya RNA jadi dia bikin RNA dari
RNA maka memiliki fungsi RNA dependent RNA polimerase.

Harus tau karena misalnya kita ingin memproduksi protein dari eukariot tp mau produksinya di
prokariot. Caranya, dibalik. Kalau proses transkripsi normalnya DNA ke RNA oleh enzim RNA polimerase
kalau mau memproduksi kita balik pake reverse trancription RNA diubah jadi cDNA menggunakan enzim
DNA polimerase atau biasa disebut RNA dependent DNA polimerase. Yang pertama, yg membentuknya.
TRANSKRIPSI

RNA polimerase akan duduk di promotornya dibantu oleh faktor sigma (protein). Lalu bertemu dengan
+1 akan mulai transkripsi sampai bertemu terminator. Kalau udah ketemu terminator, RNA polimerase
akan lepas bisa menggunakan dua cara, yaitu rho dipendent dan rho independent. Rho dependent, lepas
dibantu oleh faktor rho sedangkan rho independent gadibantu faktor rho jadi terminatornya bakal
ngeloop jadi RNA polimerasi bakal lepas sendiri (DNA nya membentuk loop, jadi ketahan sama loop
DNA, jadi lepas). Komponen :

- Protein : aktivator, repressor, RNA polimerase, faktor sigma, faktor rho

- RNA : mRNA (hasil)
- DNA : cetakannya (codding dan template strand), terminator, situs aktivator, operator,
promotor, inisiasi transkripsi

DNA ada dua, yaitu untai atas dan untai bawah. Arah transkripsi 5’ ke 3’. Ada istilah codding strand,
yaitu urutan yang nanti sama atau mirip dengan urutan RNA yang mengkode protein. Template strand,
yaitu cetakan untuk membentuk RNA. Kode buat protein itu sama dengan kode dari DNA. Kalau arah
gennya kiri yang jadi codding strand yang bawah, yg template yg atas.

TRANSLASI
Pembentukkan protein dari asam amino (polipeptida).
RNA hasil transkripsi akan mengalami peristiwa translasi. Mereka menggunakan suatu bahasa untuk
berubah menjadi suatu protein, yaitu kodon (3 huruf). Ada yang asam aminonya sama tapi kodenya
beda-beda. Kodon adalah 3 basa nukleotida yang mengkode asam amino.
Awalnya DNA ditranskripsi menjadi RNA nanti ditranslasi diterjemahin jadi asam amino.
1 asam amino bisa dikode lebih dari 1 kodon.
AUG, ATG : start kodon
1 kodon terdiri dari 3 basa. 3 basa membentuk 1 kodon.
1 asam amino = 3 bp
1 bp = 0.3 aa
1 aa = 110 Da = 0.11 kDa
Kalau dikasih tau urutan DNA kita bisa tau urutan asam amino. Kalau dikasih tau urutan DNA kita bisa
tau panjang/ukuran proteinnya.
300 DNA (pb) = 100 asam amino (protein)
100 asam amino = 300 pb (coding sequence)
750 pb = 27.500 Da

Komponennya :

- RNA : rRNA, mRNA berupa (RBS, start kodon, stop kodon) , tRNA yg membawa asam amino
- Protein : ribosom, asam amino yg dibawa tRNA, peptida transferase
- DNA : -

Ada 3 RNA yang terlibat. Berawal dari Ribosom akan mengenali RBS kemudian mulai di start kodon dan
berhenti di stop kodon. 1 tRNA bawa 1 asam amino. Nanti ada peristiwa menghubungkan asam amino
yaitu ikatan peptida (enzim peptida transferase).

EKSPRESI GEN

Ekspresi gen itu gen menghasilkan produknya, produknya gen bisa berupa protein bisa berupa RNA.
Final : rRNA.
Protein : N-C
RNA : 5’-3’
Ekspresi gen harus diregulasi karna diekspresikannya hanya pada saat tertentu, pada saat dia
dibutuhkan. Kalau dibutuhkan terus menerus itu tidak diregulasi (konstitutif), jadi jumlahnya tetap.
Contoh gen yg diregulasi, ketika suatu sel misalnya makan glukosa lalu glukosa abis jadi dia harus
konsumsi laktosa. Tapi laktosa harus dipecah dulu utk bisa dikonsumsi, karna laktosa itu glukosa dan
galaktosa. Biar bisa dipecah dia butuh enzim shg butuh gen yang mengekspresikan enzim tsb tapi tdk
terus2an dibutuhkan shg perlu diregulasi.
Biotek memanfaatkan terkait regulasi gen, jadi dimanipulasi untuk memproduksi protein dalam jumlah
yg banyak.
Ekspresi gen tujuannya utk merespon keadaan di lingkungannya.
RNA polimerasi bisa berikatan dengan promotor karena urutannya pas (DNA) dengan asam amino yg
dimiliki RNA polimerase.
Promotor :
- Promotor kuat : ketika RNA polimerase terikat kuat di promotor, dimana urutannya sangat
sesuai sehingga peristiwa transkripsi ini menghasilkan RNA dalam jumlah banyak per satuan
waktu. Scr tdk lgsg, jumlah protein akan banyak krn cetakan RNA utk membuat protein itu
ketersediaannya banyak. Biasanya yg diregulasi yg kuat krn kl terlalu kuat, selnya akan
pusing karena hrs memproduksi hal yg tidak dibutuhkan. Orang biotek, memproduksi
 protein tidak dari organisme aslinya. Misal insulin diproduksi di e.coli, e. coli tidak memiliki
diabet jadi tidak memproduksi insulin, ini menggunakan promotor kuat tapi e. coli bisa mati.
Agar e. colinya gamati maka harus diregulasi, kapan sih e. colinya mau memproduksi protein
kita. Cara meregulasinya, salah satunya dengan menggunakan situs aktivator atau operator.
Yang kedua itu ada senyawa yg bisa ditambahkan, fungsinya bisa berinteraksi dengan
represor atau aktivator shg mungkin represor malah berfungsi (mampu duduk dioperator)
atau ketika berikatan dgn represor maka fungsi represor hilang (transkripsi jalan).
- Promotor lemah : ketika ikatannya tidak efisien, shg RNA nya tidak banyak
Promotor kuat itu butuh regulasi krn ikatannya sangat besar, ketika sudah terikat berarti menandakan
mulai transkripsi kalau terikatnya kuat maka berhentinya sulit krn ikatannya terlalu kuat shg harus
diregulasi agar dia tdk memproduksi produk yg tidak dibutuhkan.
Diaturnya oleh situs aktivator dan operator.
Cara regulasi dibagi 2, yaitu :

1. Indusible gene
Ketika menambahkan suatu senyawa yang berfungsi utk berinteraksi dengan represor atau
aktivator. Disini kita memberi sesuatu untuk berikatan dengan represor shg represor tikda bisa
menduduki operator. Jadi, transkripsinya tetep jalan.
2. Repressible gene
Memberi sesuatu jadi transkripsinya gajalan. Karena bisa jadi ditambahkan trs berikatan dengan
represor, represornya malah duduk di operator. Atau sesuatu itu berikatan dengan aktivator shg
aktivator tdk bisa lagi duduk di situs aktivator.

Represor yg terjadi pada laktosa. Pada laktosa ada promotor dan operator. Ada suatu protein regulator
(LacI) , kalau dia bebas dia bisa duduk di operator, maka transkripsi tdk bisa jalan. Yg terjadi sebenernya
kalau ada laktosa dia berikatan dengan represor, represornya tidak bisa duduk di operator, transkripsi
jalan.
Operon Laq mengkode enzim2 yg mendegradasi laktosa, kalau laktosa ada di sel maka harus
didegradasi maka butuh produk gen tsb. Laktosa bisa berikatan dgn protein represor, proten represor
gabisa duduk di operator jadi RNA polimerase bebas utk melakukan transkripsi. Kalau gaada laktosa,
represornya tidak ada yg mengikat, shg represor duduk di operator, jadi gen-gen tidak
dikode/ditranskripsikan. Wajar karena gaada yg mau didegradasi jadinya gausah ada produk gen.

Kalau ada inducer (suatu molekul jika berikatan dgn represor, represor ini akan berubah bentuknya,
membuat dia tidak mampu utk berikatan dengan operator) maka RNA polimerase bisa melakukan
transkripsi.
Inducer = laktosa

Contoh,
Ada repressor akan berikatan sama laktosa nanti akan berubah scr konformasinya akhirnya dia gabisa
duduk di operator. Jadi, transkripsi jalan. lacZ lacY lacA : protein yg berfungsi utk mendegradasi laktosa
Mengkode 3 gen tapi ditiap gennya masing2 harus punya start kodon dan stop kodon dan RBS.
Promotor dan terminator di awal dan akhir.
Protein yang dihasilkan (represor) LaqI duduk di operator, menghalangi proses transkripsi. Ketika ada
laktosa (inducer), laktosa berikatan dengan protein dari LacI shg bentuknya berubah dan tidak bisa
duduk dioperator. Jadi transkripsi jalan sehingga bisa menghasilkan protein LacZ, LacY, LacA yaitu enzim
untuk menguraikan laktosa.

Inducer (IPTG) mirip laktosa, kalau pakai laktosa nnt habis dimakan sel.
- Kalau 1 gen + 1 promotor = monosistronik
- Banyak gen + 1 promotor + 1 terminator = polisistronik

Maka ketika ada 3 gen berarti ada 3 RBS, 3 start kodon, 3 stop kodon.

Aplikasi

Kalau ingin memanfaatkan kita tidak butuh lacY,lacZ,lacA nanti kalau ingin memanfaatkan tidak butuh,
kita ganti dgn gen target. Yg dipakai promotor dengan operatornya. di dalam sel harus menyediakan
protein represornya, bisa jadi ditambahkan berupa protein atau gennya.
Kalau nambahin komponen regulator, pasangannya harus disediakan juga.

Bikin kaset ekspresi. Vector itu kaya kendaraan. Kaset ekspresi, ada operator, promotor, RBS, start
kodon, stop kodon, dan terminator. Nanti penumpangnya (gen) bisa diganti-ganti untuk memproduksi.
Di kasett ekspresi harus ada komponen transkripsi dan translasi.

LacI – pengkode repressor.