TUTOR HEMATOLOGI

Pemeriksaan Anti Thrombin III dengan alat Sysmex CS 2500i

Oleh :

Dr. Erro Bagus Ziefrizal

Pembimbing:

Arifoel Hajat, dr., Sp.PK (K)

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS I

PATOLOGI KLINIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

RSUD Dr. SOETOMO SURABAYA

2021
 BAB I

PENDAHULUAN

Antitrombin III (ATIII) adalah protease yang tidak tergantung vitamin K yang
menghambat koagulasi dengan menetralkan aktivitas enzimatik trombin (faktor IIa, IXa,
Xa). Aktivitas antitrombin III secara nyata diperkuat oleh heparin, mekanisme utama dimana
heparin dan LMWH menghasilkan antikoagulasi.. Antitrombin merupakan glikoprotein
plasma yang terdiri dari 432 residu asam amino yang tidak terpisahkan dalam pengaturan
proses koagulasi selama perdarahan. Antitrombin terutama berikatan dengan faktor protease
II serin (trombin), faktor IXa, dan faktor Xa yang menghambat proses pembekuan darah yang
terlibat dalam jalur kaskade koagulasi. Sebagai bagian dari respons fisiologis normal terhadap
perdarahan, trombosit yang beredar di plasma awalnya diaktivasi oleh beberapa faktor yang
diproduksi dari sel endotel untuk berkumpul dan membentuk sumbat. Fibrinogen yang
bersirkulasi kemudian diubah menjadi fibrin oleh trombin melalui serangkaian aktivasi
protease, yang merupakan reaksi dari jalur kaskade koagulasi. Fibrin bertindak untuk
menstabilkan sumbat yang dibuat trombosit awal yang menentukan penyelesaian
pembentukan gumpalan. [1]
Antitrombin salah satu dari sejumlah mekanisme pengaturan kaskade koagulasi yang
menyediakan mekanisme penghitung untuk pembentukan gumpalan. Ini berfungsi sebagai
hingga 80% dari komponen penghambatan pembentukan trombin, serta penghambatan faktor
IXa dan faktor Xa. [2] Kekurangan antitrombin memiliki hubungan klinis dengan
peningkatan risiko trombosis, tromboemboli, dan komplikasi terkait yang terkait dengan
keadaan hiperkoagulasi. [3] Kegiatan ini bertujuan untuk memberikan pemahaman umum
tentang sifat biokimia anti-trombin, menyajikan gambaran umum strukturnya dalam
hubungannya dengan fungsinya terkait interaksi dengan serine protease dan heparin.

Antitrombin adalah bagian dari keluarga serine protease inhibitor yang dikenal
sebagai serpins. Serpin umumnya terdiri dari struktur rantai asam amino yang sangat
terkonservasi yang disusun menjadi tiga lembar beta, sembilan lembar alfa, dan loop pusat
reaktif (RCL) yang ditunjuk sebagai urutan asam amino yang berfungsi sebagai situs reaktif
untuk interaksi protease [4] . Loop RCL dalam antitrombin ada di sepanjang urutan rantai
asam amino pada 393 residu arginin dan 394 residu serin dekat terminal karboksil dari urutan
asam amino. Ini adalah wilayah di dalam antitrombin yang menciptakan kompleks
antitrombin-protease untuk penghambatan. [4]

Sintesis antitrombin terjadi terutama di hati pada awalnya sebagai rantai protein yang
belum matang yang terdiri dari 464 residu asam amino. Rantai asam amino kemudian dibelah
di terminal-N oleh 32 asam amino, sehingga menciptakan protein urutan asam amino 432
yang matang. Protein matang mengandung tiga ikatan disulfida yang secara antarmolekul
menghubungkan enam residu sistein. Konfigurasi ini memungkinkan empat lokasi glikosilasi
potensial ada di dalam molekul. [4] Bergantung pada jumlah situs glikosilasi yang ditempati,
anti-trombin selanjutnya dikategorikan menjadi dua isoform: antitrombin alfa dan
antitrombin beta. [5]

  Antitrombin alfa mengacu pada antitrombin di mana oligosakarida mengikat keempat

situs glikosilasi. Ini adalah konfigurasi utama antitrombin, yang menunjukkan sekitar 90%
antitrombin dalam plasma. [6] Antitrombin beta, bagaimanapun, mengacu pada antitrombin
dengan tiga dari empat situs yang ditempati, dengan rantai oligosakarida di Asn135
hilang. [6] Perubahan konfigurasi ini meningkatkan afinitas beta antitrombin yang mengikat
heparin pada domain pengikatan heparin yang ditentukan. [7] Pengikatan heparin secara
dramatis meningkatkan afinitas antitrombin untuk berikatan dengan serine protease,
meningkatkan efisiensi fungsional antitrombin untuk menghambat pembentukan gumpalan.

Antitrombin memiliki dua tempat pengikatan spesifik - situs reaktif yang terdiri dari
loop pusat reaktif (RCL) yang mengikat protease seperti trombin, faktor Xa, IXa, dan domain
pengikat heparin yang, seperti namanya, mengikat heparin. [8]

Lingkaran pusat reaktif antitrombin yang terletak di residu arginin di 393 dan residu
serin di 394 dekat terminal karboksil berfungsi untuk mengikat ke situs aktif protease melalui
mekanisme kompleks yang melibatkan perubahan konformasi dari situs reaktif
antitrombin. [8] Untaian dari beta-sheet A dari situs antitrombin terpisah setengah sepanjang
panjangnya dan RCL kemudian mengatur ulang pada titik masuk ke dalam sheet A bersama
dengan berbagai perubahan konformasi lainnya, yang berfungsi untuk meningkatkan
mobilitas RCL. Mobilitas yang meningkat menyediakan tempat berlabuhnya protease, yang
pada gilirannya menciptakan kompleks yang tidak dapat diubah. [8]

Kompleks inhibitor-protease kemudian dengan cepat dikeluarkan dari sirkulasi tidak

lebih dari 5 menit setelah pembentukan, yang menghilangkan trombin dari sirkulasi,
mengganggu efek pembekuan dari kaskade koagulasi. Meskipun mekanisme pastinya masih
belum pasti, bukti mungkin menyarankan reseptor pada hepatosit untuk terlibat dalam
pengangkatan kompleks dari plasma. [8]

Pembentukan kompleks antitrombin-protease, meskipun tidak dapat diubah, secara

alami merupakan reaksi yang lambat dan tidak efisien. Prosesnya dapat ditingkatkan secara
cepat hingga 1000 kali lipat dengan adanya polisakarida tersulfat berupa heparin dan heparan
sulfat. [8] Heparin mengandung urutan pentasakarida unik dalam rantai
glikosaminoglikannya yang terdiri dari gugus sulfat bermuatan negatif, yang bertanggung
jawab atas afinitasnya yang tinggi terhadap domain pengikatan heparin antitrombin.

Di sisi lain, domain pengikat heparin yang terletak di permukaan antitrombin,

mengandung arginin dan lisin bermuatan positif yang mengikat domain bermuatan negatif
dari urutan pentasakarida heparin melalui sebagian mekanisme alosterik. [9]

Pengikatan heparin yang berhasil mengaktifkan perubahan konformasi di dalam

antitrombin, yang meningkatkan afinitasnya terhadap protease, mendorong pembentukan
kompleks antitrombin-protease, dan pada akhirnya menghambat pembekuan darah. [10]

Aktivasi alosterik yang diinduksi oleh heparin ke struktur serpin antitrombin telah
menjadi objek studi ekstensif, dan sementara kinetika reaksinya cukup kompleks, umumnya
aktivasi alosterik antitrombin menginduksi perubahan struktural dalam RCL, situs pengikatan
heparin, dan inti hidrofobik yang merupakan antitrombin. Interaksi yang tepat yang terlibat
dalam perubahan konformasi masih menjadi topik penelitian dan revisi. [9]

Kadar antitrombin tidak mempengaruhi hasil pemeriksaan skrining koagulasi seperti

Partial Thromboplastin Time (PTT), Prothrombin Time (PT), dan Thrombin Time
(TT). Pengukuran aktivitas antitrombin (tingkat antitrombin fungsional) adalah tes
laboratorium yang banyak digunakan dalam praktik klinis, sedangkan uji antigen antitrombin
(tingkat antitrombin imunologi), yang digunakan untuk mengkonfirmasi defisiensi
antitrombin herediter, jarang digunakan.

Indikasi / Aplikasi

Pengujian antitrombin ditunjukkan sebagai berikut: [ 2 ]

 Penyakit tromboemboli idiopatik sebagai bagian dari pemeriksaan trombofilia dengan
tes hemostasis lain seperti protein C , protein S , homosistein , antikoagulan
lupus, faktor V Leiden , dan mutasi protrombin 20210
  Pemantauan terapi substitusi antitrombin dalam pengobatan defisiensi antitrombin
herediter atau defisiensi antitrombin didapat
 Resistensi pada terapi Unfractionated Heparin [ 3 ]

Pertimbangan

Defisiensi antitrombin herediter lebih jarang terjadi dibandingkan defisiensi

didapat. [ 4 ] Diagnosis defisiensi herediter memerlukan pengujian aktivitas antitrombin dan
antigen antitrombin, dan pengujian berulang serta studi keluarga mungkin diperlukan.
Kekurangan antitrombin dapat meningkatkan risiko keguguran berulang. [ 5 ] Pemberian
heparin tak terpecah dosis penuh (tapi tidak LMWH) dapat menyebabkan penurunan
reversibel tingkat antitrombin hingga 30% dalam beberapa hari. Konsentrasi antitrombin
normal palsu dapat ditentukan pada pasien defisiensi antitrombin yang diobati dengan
inhibitor trombin, tetapi tidak dengan inhibitor anti-Xa. [ 6 ] Sementara sebagian besar tes
laboratorium fungsional sensitif untuk mendeteksi defisiensi antitrombin tipe I, beberapa tes
komersial lebih baik daripada yang lain dalam mendeteksi defisiensi antitrombin tipe II. [ 7 , 8 ]

Rentang Referensi
Antitrombin adalah antikoagulan alami yang menghambat faktor koagulasi teraktivasi
trombin (faktor IIa), faktor Xa, dan, pada tingkat yang lebih rendah, faktor XIa dan faktor
IXa.

Temuan normal

Aktivitas antitrombin [ 1 ] :
 Baru lahir: 35-40%
 Lebih dari 6 bulan hingga dewasa: 80-130%
Uji antigen antitrombin [ 1 ] :
 Plasma:> 50% dari nilai kontrol
 Serum: 15-34% lebih rendah dari nilai plasma
 Imunologis: 17-30 mg / dL
 Fungsional: 80-120%
Variasi nilai terjadi sesuai dengan alat dan metode laboratorium yang digunakan. [ 1 ]
Signifikansi Klinis

Perkiraan prevalensi defisiensi antitrombin herediter umumnya antara 1 pada 2000

dan 1 dalam 5000. [8] Mereka yang mengalami trombosis vena memiliki insiden antara 1 dari
20 hingga 1 dalam 200. [11] Defisiensi antitrombin herediter dikategorikan ke dalam Tipe I
atau Tipe II. Tipe I menghasilkan defisiensi lengkap produk gen antitrombin jika dalam
keadaan homozigot. Genotipe heterozigot menghasilkan sekitar 50% aktivitas antitrombin
fungsional. Defisiensi tipe II secara khas menunjukkan produksi protein antitrombin yang
diubah, yang mengakibatkan hilangnya fungsinya [11]. Ada penurunan aktivitas antitrombin
secara keseluruhan, tetapi penurunan antigen antitrombin lebih kecil
kemungkinannya. Lokasi di mana protein mengalami perubahan dapat mempengaruhi situs
reaktif, domain pengikatan heparin, atau keduanya. Kurangnya aktivitas atau produksi
antitrombin paling sering muncul sebagai trombosis vena dalam. Namun, ada peningkatan
risiko rekurensi trombosis tak terpicu di tempat yang tidak biasa seperti vena serebral atau
mesenterika. [11]Contoh pertama trombosis terjadi pada usia yang relatif muda dengan risiko
trombosis memuncak sekitar usia 15 hingga 40 tahun. Pengobatan awal untuk trombosis pada
pasien ini adalah heparin, dan pengobatan pemeliharaan umumnya berlangsung dengan
antikoagulan oral. Untuk kejadian asimtomatik, profilaksis primer saat ini tidak
direkomendasikan karena peningkatan risiko perdarahan fatal pada antikoagulasi jangka
panjang versus risiko VTE fatal yang lebih rendah. [11]

Defisiensi antitrombin yang didapat umumnya dikaitkan dengan penurunan produksi

sebagai bagian dari gangguan sintesis dalam kasus gagal hati akut, sirosis, malnutrisi,
kehilangan langsung antitrombin dalam kondisi termasuk sindrom nefrotik, atau karena
peningkatan konsumsi. [11] Antitrombin hilang melalui koagulopati konsumsi, termasuk
sindrom koagulasi intravaskular diseminata (DIC), mikroangiopati dengan trombosis,
keganasan, dan reaksi transfusi hematologi. Kadar antitrombin yang kurang dari 50 sampai
60% pada sepsis umumnya memiliki hasil prognostik yang lebih buruk, dan kadar yang
kurang dari 20% berkorelasi dengan hasil yang fatal. [11]Hilangnya antitrombin pada sepsis
sebagian karena peningkatan pergantian plasma, dan penurunan regulasi produksi
antitrombin. Derajat defisiensi juga berhubungan dengan tingkat keparahan penyakit. Efek
antitrombin pada tubuh sangat luas, dan pemahaman tentang struktur dan fungsi molekul ini
memberikan pengetahuan dasar untuk mengintegrasikan perawatan dan praktik klinis untuk
pasien dengan gangguan antitrombin. [8]

Penafsiran

Tingkat antitrombin yang meningkat bukanlah masalah klinis.

Jenis defisiensi antitrombin yang diturunkan adalah sebagai berikut:
 Tipe I - Penurunan tingkat antitrombin fungsional dan imunologis
 Tipe II - Penurunan aktivitas antitrombin fungsional, sedangkan konsentrasi protein
normal
Defisiensi antitrombin yang didapat mungkin terkait dengan hal-hal berikut:
 Koagulasi intravaskular diseminata
 Terapi heparin tidak terpecah
 Penyakit hati
 Sindrom nefrotik
 Kondisi kehilangan protein
 Terapi estrogen
 Pengobatan L-asparaginase
 Operasi jantung
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2. 1. Tahapan Proses Laboratorium

Secara umum tahapan proses dalam laboratorium dapat dibagi menjadi 3 tahap, yaitu
tahap pre analitik, analitik, dan pasca analitik. Tahap pre analitik, yaitu segala proses
sebelum pengujian sampel. Mulai dari pemesanan, pengambilan bahan sampel, pemrosesan,
dan transportasi sampel. Tahap analitik, yaitu proses pengujian sampel. Tahap pasca analitik,
yaitu segala proses setelah pengujian sampel, mulai dari pencatatan hasil, pelaporan hasil,
dan interpretasi oleh klinisi (Plebani, 2010)(Sysmex Indonesia, 2014).

 Tahap Pre-analitik (Plebani, 2015)(Sysmex Indonesia, 2014)

• Permintaan test yang tidak sesuai

• Urutan pengambilan sampel dari pasien tidak sesuai

• Kekeliruan identifikasi pasien

• Pemilihan tabung sampel tidak sesuai

• Jumlah sampel kurang/ berlebih

• Pelabelan sampel tidak sesuai

Beberapa rekomendasi lain, selain yang disebutkan di atas adalah:

Spesimen : Plasma sitrat

Koleksi : Tabung tutup biru dengan 3,2% natrium sitrat
Sentrifugasi : 2000-2500 g selama 15 menit atau rejimen serupa untuk menghasilkan
plasma miskin trombosit
Penyimpanan : Hingga 8 jam pada suhu kamar; sampel plasma harus dibekukan dalam 1-2
jam ; spesimen stabil selama satu bulan pada -20 ° C atau 6-9 bulan pada -80 ° C
- Aktivitas antitrombin diukur dengan aktivitas kromogenik sintetik dengan adanya kadar
heparin berlebih.
- Konsentrasi hemoglobin, bilirubin, dan trigliserida yang tinggi dapat mempengaruhi
pengukuran antitrombin.
- Pengobatan dengan inhibitor trombin dapat menyebabkan perkiraan berlebihan dari tingkat
antitrombin dalam plasma.

Preparasi

• Antithrombin III Kit : Thrombin Reagent, Substrate Reagent, Buffer Solution

• Preparasi: Thrombin direkonstitusi dgn 5 ml buffer solution, substrate dgn 3 ml aquabides,

buffer siap pakai

• Stabilitas setelah rekonstitusi :

Suhu Trombin Substrate Buffer Solution

2 – 8 oC 2 minggu 6 minggu 6 bulan
- 20 oC 3 bulan 6 bulan -
On Board 72 jam 72 jam -

• Reference range: 75 – 125%

• Measurement range : 0 – 150%

Prinsip Metode Pemeriksaan Anti Thrombin III

AT III pada sampel diubah oleh heparin menjadi inhibitor langsung dan
menginaktivasi trombin yang terbentuk. Kandungan trombin sisa ditentukan dalam uji kinetik
yang mengukur peningkatan absorbansi pada 405 nm menurut reaksi berikut :
Proses Deteksi

Cahaya dipancarkan ke dalam campuran Sampel + Reagen  Perubahan transmisi yang

terjadi ditangkap detektor

Prinsip Deteksi

Clotting Assay: Perubahan turbiditas (kekeruhan) ketika fibrinogen berubah menjadi fibrin.

Chromogenic Assay : Perubahan warna oleh substrat

Immunassay : Aglutinasi dari latex melalui reaksi antigen-antibodi

Sistem deteksi : Multiwavelength Detection System

Metode deteksi : Transmitted light Detection Method

Panjang gelombang yang digunakan :

Clotting Assay : 405, 660, 800 nm

Chromogenic Assay : 405, 340 nm

Immunossay : 575, 800 nm