Light Transmission Aggregometry

Alat Light Transmission Aggregometry (LTA) ditemukan 1960, digunakan untuk

mendiagnosis defek trombosit, baik didapat maupun turunan, dan masih menjadi baku
emas untuk tes agregasi trombosit.21,22 Agregasi trombosit dapat diukur secara
kuantitatif dengan recording transmisi sinar ke arah suspensi trombosit yang teragitasi
secara konstan dalam aggregometer.

Sampel yang digunakan adalah platelet-rich citrated plasma (cPRP) dalam tabung yang
berisi sodium dihydrate citrate 3.8%(satu bagian per sembilan bagian darah). Sampel
disentrifugasi pada 190 g selama 15 menit pada suhu ruang. Sampel cPRP disimpan
pada suhu ruang dalam stoppered tubes under CO2 untuk menghindari pengaruh variasi
pH. Waktu jeda maksimal antara pengumpulan sampel dengan pemeriksaan agregasi
adalah 3 jam.23

Untuk menentukan defek trombosit dengan lebih baik dan mengeliminasi pengaruh
protein plasma, faktor pembekuan, bisa digunakan suspensi trombosit yang dicuci.
Sampel darah dikumpulkan menggunakan acid-citrate-dextrose, disentrifugasi pada
suhu 37℃ untuk mendapatkan cPRP. Pellet trombosit dicuci dua kali berdasarkan
metode Mustard.24 Agregasi trombosit atau aglutinasi diinduksi oleh agen endogen,
seperti adenosine diphosphate (ADP), adrenaline, collagen, thrombin, arachidonic
acid, atau platelet-activating factor-acether, atau ristocetin (yang menimbulkan
aktivasi faktor von Willebrand), convulxin (aktivator kuat untuk collagen receptor
GPVI), atau ionophore A23187.23

Hasil kuantitatif kurva agregasi (maximum amplitude of aggregation, amplitude at

defined time points, slope of the initial increase, shape change) mengidentifikasi
mekanisme fisiologi dan biokimiawi yang mengkontrol agregasi trombosit,
mengklasifikasi abnormalitas herediter atau dapatan yang menyebabkan perdarahan
atau trombosis, dan menentukan efek obat yang menghambat agregasi
trombosit.19,21,23 Penggunaan klinis LTA dalam monitor terapi antiplatelet terbatas
oleh volume sampel yang harus besar, langkah persiapan sampel yang kompleks,
keahlian dalam ekspertise, membutuhkan waktu yang lama, mahal, dan variasi
antarlaboratorium.20,21 Terlebih lagi, belum ada konsensus yang membahas
konsentrasi agonis yang harus digunakan LTA dalam tes fungsi trombosit.

VerifyNowTM
VerifyNow (Accumetrics, Inc., San Diego, CA; formerly known as Ultegra Rapid
Platelet Function Assay) dikembangkan sebagai alat point-of-care, menggunakan
whole-blood, semiotomatis, tes fungsi platelet dengan cartridge-based untuk
menentukan respons obat antitrombosit.25 Alat ini mengukur aglutinasi
fibrinogen-coated beads oleh trombosit yang distimulasi oleh agonis dalam citrated
whole blood. VerifyNow awalnya dikembangkan untuk mengukur efek antiplatelet
pada inhibitor glycoprotein (GP) IIb/IIIa.25,26

Sampel VerifyNow disimpan dalam tabung yang mengandung sodium citrate atau
antikoagulan lain. Tabung spesimen dimasukkan ke dalam staging well untuk kontrol
temperatur dan selanjutnya ke dalam sumuran sampel yang berisi needle yang masuk
langsung ke dalam tabung vakum tertutup.25 Untuk menentukan level platelet
inhibition pada pasien yang menerima terapi GP IIb/IIIa inhibitor, VerifyNow
menggunakan thrombin-receptor-activating peptide (iso-TRAP) sebagai agonis. Light
transmittance changes as the TRAP-activated platelets bind to the fibrinogen-coated
beads and fall out of solution; kecepatan perubahan light transmittance dilaporkan
sebagai platelet-aggregation units (PAU). Hasil dilaporkan sebagai raw PAU dan
sebagai persentase baseline (pre-treatment) PAU.25 VerifyNow cartridge yang baru
memiliki sensitivitas dan spesifisitas lebih besar terhadap dua antitrombosit yang
paling banyak digunakan, yaitu VerifyNow Aspirin untuk monitor terapi aspirin dan
VerifyNow P2Y12 untuk monitor terapi clopidogrel.21,27 Hasil dari ketiga tes
VerifyNow berkorelasi baik dengan LTA, hal ini disebabkan karena VerifyNow assay
berdasarkan agregasi trombosit.25,28,29 Kelebihan alat ini adalah semiotomatis,
terkalibrasi, dan terstandarisasi, kekuranganna terdapat pada ukuran tabung yang
sering tidak terisi penuh dan sampel dapat membeku sebelum pemeriksaan dilakukan.
(B. Aleil, unpublished). Sebagai tes agregasi, VerifyNow sensitif terhadap perlakuan
seperti GP IIb/IIIa inhibitor, terlepas dari tipe cartridge.25 Oleh karena VerifyNow
merupakan tes agregasi, VerifyNow tidak memberikan informasi lebih banyak dari
LTA dan penilaian ambang batas yang jelas dalam mengevaluasi efek inhibitor obat
tertentu masih dalam perdebatan, kecuali aspirin.

Flow cytometry
Flow cytometry dengan cepat mengukur karakteristik spesifik fluorescent banyak sel.
Suspensi sel melewati flow chamber di mana setiap sel akan diiluminasi dengan sinar
laser. Kebanyakan sel sudah dilabel dengan satu atau lebih antibodi fluorescent. Sinar
laser mengaktifkan fluorophore saat eksitasi panjang gelombang dan detektor akan
memproses emisi fluorescence dan hamburan sinar setiap sel. Intensitas emisi cahaya
berbanding lurus dengan densitas antigen atau karakter sel yang diuji.
Pemeriksaan flow cytometry dapat memeriksa trombosit teraktivasi dalam sirkulasi,
aktivasi trombosit in vitro, dan interaksi leukosit-trombosit, untuk mendiagnsois
kerusakan trombosit herediter atau dapatan, monitor terapi antitrombosit, dan lainnya.
30
Aktivasi trombosit in vitro dapat diukur menggunakan whole blood atau suspensi
trombosit, baik dengan cPRP atau washed platelets. Trombosit diaktivasi oleh agonis
dan penanda activation-dependent diukur berupa P-selectin exposure atau activated
GP IIb/IIIa. Sebagai alternatif, ikatan fibrinogen juga dapat diukur.

Keuntungan flow cytometry meliputi penggunaan darah dalam jumlah kecil dan
aplikasinya yang luas. Alat flow cytometry memiliki akurasi yang tinggi, memberikan
hasil yang berkorelasi baik dengan LTA. Walaupun flow cytometry bermanfaat bagi
penelitian, flow cytometry tidak praktis dalam mengukur respon obat antitrombosit
dalam klinis harian. Keterbatasannya berupa biaya unit yang tinggi dan persiapan
sampel yang kompleks membutuhkan tenaga terlatih.30

Beberapa tahun yang lalu, perkembangan analisis fungsi trombosit oleh flow
cytometry berasal dari penggunaan fixed and permeabilized platelets to specifically
label the intra-cellular vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP).31 VASP adalah
protein regulatory intraselular yang non-phosphorylated pada keadaan basal dan
menjadi phosphorylated melalui kaskade biokimiawi cyclic adenosine
monophosphate (cAMP).32 Kaskade ini diaktivasi oleh prostaglandin E1 dan dihambat
oleh ADP melalui reseptor P2Y12. Hasil menunjukkan baik VASP phosphorylation,
mengindikasikan hambatan reseptor P2Y12, atau dephosphorylation,
mengindikasikan aktivitas reseptor P2Y12. Oleh karena itu, pemeriksaan VASP dapat
digunakan untuk monitor terapi thienopyridine. Hasilnya berupa indeks reaktifitas
trombosit terhadap ADP dengan jangkauan dari 0–100%. Hasil persentase yang lebih
rendah mengindikasikan inhibisi reseptor P2Y12 yang lebih besar. Hasil pemeriksaan
VASP berkorelasi baik dengan agregometri trombosit dan aktivasi tes flow cytometry.

Penggunaan kit komersial akan mereduksi variabilitas hasil interlaboratorium. Hasil

dapat diperoleh dalam 1 jam dan spesimen darah dapat disimpan pada suhu ruang
sampai 48 jam tanpa mempengaruhi hasil.5,33,34

PFA-100w
PFA-100 (Dade-Behring, Deerfield, IL) dikembangkan sebagai skrining pertama
disfungsi trombosit sebagai alternatif pemeriksaan bleeding time.35 Sampel whole
blood menggunakan antikoagulan sitrat sebanyak 0.8 mLdalam cartridge sekali pakai
dalam reservoir PFA-100. Vakum melewati sampel di bawah gaya geser tinggi (4000
s21) melalui membran dilapisi collagen dan ADP atau collagen dan epinephrine.
Ketika aperture membran terhalang oleh sumbat trombosit (dalam 110 detik) dan
aliran sistem berakhir, closure time (CT) dihasilkan. Hasil dilaporkan dalam detik
CT.35,36 Seperti tes fungsi trombosit lainnya, setiap laboratorium yang menggunakan
PFA-100 harus memiliki nilai rentang dasar dan normal pada orang sehat.

PFA-100 sangat mudah digunakan, otomatis, dan cepat. PFA-100 sensitif terhadap
penyakit von Willebrand dan kelainan trombosit berat seperti Glanzmann
thrombasthenia atau Bernard–Soulier syndrome. Namun, sistem PFA-100 kurang
sensitif terhadap defek bawaan ringan atau yang diinduksi obat.20,36 PFA-100 tidak
memadai untuk mengukur inhibisi agregasi trombosit dalam merespon clopidogrel.
Pasien yang menerima terapi aspirin bisa memiliki CT yang memanjang atau
normal.36 Banyak variabel yang mempengaruhi hasil, seperti jumlah trombosit, sel
darah merah, reaktivitas trombosit terhadap collagen,dan faktor von Willebrand
plasma. Oleh karena itu, sistem PFA-100 tidak sesuai untuk memastikan bahwa obat
tersebut tidak bertanggung jawab atas kegagalan terapi.41