LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS FARMASI II

Review Jurnal RP-HPLC Determination of Water-Soluble Vitamins in Honey

ANGGOTA KELOMPOK :

1. ARTHESWARA (051511133----)
2. AYU SUCI E (051511133----)
3. GALANG DESANTO EKO PUTRA
4. TAZKIYAH A (051511133----)
5. RUTH ELIZABETH
6. MARGARETA DITA
7. NURAINI
8. DINDA MAULYDIA IKHSAN (051511133104)
9. NABILAH LUTHFI (051511133108)
10. M. ARYA BARI (051511133-----)
11. NURIL FADILATUL N

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
2017
I. ABSTRAK
Validasi metode analisis yang dapat dipercaya untuk penentuan vitamin-vitamin di
dalam madu adalah bidang penelitian yang masih jarang dieksplorasi. Pembelajaran ini
bertujuan serta memvalidasi metode sederhana dan fast RP-HPLC untuk menentukan
secara simultan dari 5 vitamin yang larut air yang terdapat di madu. Metode
menetapkkan deteksi renda dan limit kuantifikasi; linearitas yang sangat baik dalam
interval konsentrasi yang luas, presisi yang sangat baik, dan tidak ada pengganggu.

II. PENDAHULUAN
 Madu adalah produk utama dari sarang lebah.
Madu adalah cairan yang menyerupai sirup, madu lebih kental dan berasa
manis, dihasilkan oleh lebah dan serangga lainnya dari nektar bunga. Jika Tawon
madu sudah berada dalam sarang nektar dikeluarkan dari kantung madu yang
terdapat pada abdomen dan dikunyah dikerjakan bersama tawon lain, jika nektar
sudah halus ditempatkan pada sel, jika sel sudah penuh akan ditutup dan terjadi
fermentasi. Rasa manis madu disebabkan oleh unsur monosakarida fruktosa dan
glukosa, dan memiliki rasa manis yang hampir sama dengan gula. Madu memiliki
ciri-ciri kimia yang menarik, dioleskan jika dipakai untuk pemanggangan. Madu
memiliki rasa yang berbeda daripada gula dan pemanis lainnya. Kebanyakan
mikroorganisme tidak bisa berkembang di dalam madu karena rendahnya aktivitas
air yang hanya 0.6.
 Pada dasarnya madu terdiri dari larutan jenuh gula.
 Karakteristik kualitatif dan kuantitatif senyawa minor digunakan untuk
mengetahui asal madu secara geografi dan botani.
 Metode analisis untuk menganallisa vitamin dalam madu yaitu metode uji
biologis.
 Berkurangnya kandungan vitamin dalam madu dapat disebabkan oleh filtrasi
komersial dan oksidasi asam askorbat oleh hidrogen peroksida.
 Memvalidasi metode RP-HPLC yang dapat menentukan kandungan 5 vitamin
yang larut air dalam madu (Vit. B2 , B3 , B5 , B9 dan Vit. C )
  Metode Analisis :

Metode mikrobiologi : Kelompok Vit.B

Kromatografi dan Titrimetrik : Vit. C
Kromatografi Cair : Vit. B2

III. PENELITIAN
a. Preparasi Sample
 Digunakan 28 sampel madu dari beberapa tanaman yang berbeda (termasuk
berbeda genus).
 Peneliti menyebutkan beberapa spesies tanaman dan dari mana dia memperoleh
madu- madu yang digunakan untuk analisis dalam jurnal ini.
 Semua sampel disimpan pada suhu 4oC segera setelah diambil/ diekstraksi dari
sarangnya sebelum dilakukan analisis.
 Sebelum dianalisis, sampel dihomogenkan dengan Ultra-turrax mixer mod
selama 15 menit

b. REAGEN
Semua reagen yang digunakan kemurniannya analytical grade. Hanya pelarut
asetonitril saja yang kemurniannya HPLC Grade. Selain itu untuk pelarut air yang
digunakan sebagai pelarut digunakan air dengan derajat kemurnian Ultra pure
water.

c. PERANGKAT RP-HPLC

Penulis mendeskripsikan spesifikasi RP-HPLC yang digunakan untuk analisis,

misalnya: sampel yang masuk ke dalam detector sekitar 20 µm, menggunakan
 detector UV-Vis, menggunakan kolom C18 dengan spesifikasi yang sudah
dituliskan, dsb.

Untuk injeksi sampel dilakukan replikasi sebanyak tiga kali.

d. PREPARASI LARUTAN STANDART

larutan standar dibuat r.p.
timbanglah:
1. 10 mg vit B2; 25 mg vit B5; 10 mg vit B9
2. + 40 ml air kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditambah 4
ml NaOH  kocok ad larut
3. + ditambahkan 50 ml larutan dapar fosfat 1 M (pH=5,5)
4. Timbanglah: 10 mg vit B3; 10 mg vit C  tambah air ad tepat tanda
5. Standart disimpan pada suhu 4oC dan dihindarkan dari cahaya
e. PREPARASI LARUTAN SAMPLE
1. Timbang 10 gram sampel madu masukkan dalam labu ukur 25 ml + 10 ml
ultra pure water
2. + 1 ml NaOH 2 ml
3. + 12,5 ml dapar fosfat (pH=5,5)
4. Tambahkan air ad tepat tanda
5. Sampel siap diinjeksikan
a. *Sampel disimpan pada suhu 4oC dan dihindarkan dari cahaya (apabila tidak
segera diinjeksikan)
IV. ANALISIS RP- HPLC

Pemisahan dilakukan dengan metode elusi gradient (merubah- rubah

komposisi fase gerak selama satu kali waktu retensi) dengan pemilihan komposisi
eluen yang paling maksimal untuk memisahkan. Komposisi eluen yang
digunakan beserta validasi metodenya akan dibahas pada bab yang selanjutnya.

V. HASIL PENELITIAN
a. ECALYPTUS
o Menentukan sampel madu asli dari tanaman dengan cara analisis kualitatif.
o Jumlah sampel madu dr tanaman kayu putih ditandai dengan serbuk sari yang
berlebih, mencapai lebih dari 90%.
b.CITRUS
o Sampel madu citrus menunjukkan persentase jumlah pollen yang relatif rendah
dan persentase kontaminan yang signifikan.
o Ada 3 yang mengkontaminasi :

- carduus

- echium

- trifolium

o Sampel madu tanaman Asphodel juga ditandai dengan jumlah serbuk sari yang
sangat sedikit. Sering dilakukan isolasi pada bijinya.
o Pada spektra sampel tanaman hedysarum menunjukkan mengandung serbuk
sari lebih dari 50%.
c. LAVENDER
o Pada sampel madu tanaman ini juga sangat sedikit prosentase serbuk
sarinya(6-10%).
VI. OPTIMASI METODE KROMATOGRAFI

Program elusi
kromatografi
Optimasi Resolusi
Pemilihan panjang
gelombang UV
Sensitivitas

o Fase gerak : Trifluoroacetic acid (Larutan A) dan Acetonitrile (Larutan B)

o Tabel hasil optimasi program elusi untuk matriks madu :

o Sensitivitas terbaik dicapai dengan menggunakan 2 panjang gelombang :

- 254 nm (Untuk vitamin B3 dan C)

- 210 nm (Untuk vitamin B2, B5 dan B9)

o Hasil Kromatogram
Keterangan :
(a) Kromatogram standar (b) Kromatogram dari
campuran dari : madu eucalyptus :
1. Vitamin C 1. Vitamin C
2. Vitamin B3 2. Vitamin B3
3. Vitamin B5 3. Vitamin B5
4. Vitamin B9
4. Vitamin B9
5. Vitamin B2
5. Vitamin B2
a. WATER SOLUBLE VITAMIN

Analit sample diidentifikasi dengan cara membandingkan retention

time antara larutan WSV dan atribusi. Ditunjukkan dengan spiking dari
puncak sample dengan larutan standard yang berisi sejumlah vitamin yang
murni.
Untuk menentukan retention time dari standard refference dengan cara
menginjeksikan keduanya dalam single bentuk campuran. Untuk analisis
kuantitatif menggunakan metode standard eksternal pada peak area WSV
yang dilakukan eluasiuntuk setiap vitamin, digunakan 4 level konsentrasi
yang memiliki interval linier yang terpilih.
Dari data yang diperoleh menunjukkan bahwa madu bukan vitamin.
Rata-rata konsentrasi tertinggi dari lima analit adalah kurang dari 36 mg kg¯¹
(diteliti madu pada jeruk), dan jumlah total dari WSV yang ditemukan hanya
pada sampel Madu Rosemarry, meskipun kurang dari 48 mg kg¯¹ .
 Pada dua sampel yakni Linden dan Multifloral origin yang
mengandung Vitamin C memiliki konsentrasi lebih rendah dari LOD.
Berdasarkan hal tersebut Vitamin C tidak mengandung madu yang
melimpah.Konsentrasi paling tinggi dari penelitian ini adalah 5,8 ± 0,5 mg
kg¯¹ pada madu ecalyptus. Dan konsentrasi rata-rata dari Madu Unifloral
antara 1,3 ± 0,8 mg kg¯¹ pada madu sulla 3,2 ± 0,7 mg kg¯¹ madu ecalyptus.
Kandungan vitamin B3 telah terdeteksi dalam semua sampel yang dianalisis,
meskipun 5 diantaranya (2 madu dari strawberry, satu dari tanaman eucalyptus,
lavender, dan rosemary) berada dibawah nilai LoQ.
Secara umum, konsentrasi vitamin B3 yang terkandung dalam madu
lebih tinggi daripada kandungan vitamin C nya Konsentrasi vitamin B3 yang
terukur yaitu 27.80 ±0.04 mg/kg sampai 2.1 ± 0.3 mg/kg pada sampel jeruk
dan eucalyptus. Observasi ini menunjukkan bahwa vitamin B3 yang
terkandung dalam madu bergantung pada tanaman asal yang dikonsumsi oleh
madu tersebut. Vitamin B5 yang dianalisa menunjukkan jumlah yang lebih
sedikit daripada vitamin C dan vitamin B3. (Kuantitatif; 12 sampel, Kualitatif;
9 sampel) Namun, ketika vitamin B5 terkandung dalam madu, maka
jumlahnya menjadi sangat tinggi. Hal ini terjadi pada ketiga sampel madu dari
asphodel (konsentrasi rata-rata vitamin B5 nya yaitu 16 ± 6 mg/kg).
Disamping itu, vitamin B9 dan vitamin B2 teridentifikasi secara
kuantitif dalam sebagian dari sampel, dan keberadaannya telah diobservasi
dalam 75% sampel yang pertama, dan 60% untuk yang selanjutnya. Kedua
vitamin ini menunjukkan konsentrasi dibawah 10 mg/kg. Meskipun demikian,
vitamin B9 adalah WSV paling melimpah pada madu eucalyptus (5 sampel;
rata-rata = 5.6 ± 0.4 mg/kg. Sementara itu, konsentrasi yang bermakna dari
riboflavin selalu terdeteksi dalam madu asphodel dan jeruk (3 sampel; rata-
rata 3.7 ± 0.3 mg/kg).
VII. VALIDASI
 LOD dan LOQ

LoD dihitung menurut metode pendekatan ULA1 .

Regresi ditentukan dengan menganalisis 4 larutan yang berbeda pada konsentrasi-
konsentrasi yang dekat dengan LoD yang diharapkan. Tiap pengukuran dilakukan
dalam 3 rangkap.
Sesuai dengan metode ULA1,
 LoQ = 3 x LoD

Vitamin Sensitivity

LoD LoQ
(mg/kg) (mg/kg)

B2 0,25 0,75

B3 0,25 0,75

B5 0,58 1,75

B9 0,15 0,50

C 0,10 0,30

 PRESISI
 Ditentukan dengan cara pengulangan (Repeatability) dan pengukuran
reproduksibilitas.
 Repeatability → 5 pengulangan berurutan dari analisis dengan sampel madu
sama. Dinyatakan sebagai CVexp.r
 Reprodusilibitas → 5 pengulangan dari analisis dengan sampel madu sama,
dilakukan melalui berbagai sesi analisi, dalam 1 bulan. Dinyatakan sebagai
CVexp.R. Dinyatakan
 Jika rasio antara sampel dan teoritis (teori Horwitz) kurang dari 1,5 dapat
dianggap aseptabel

 LINIERITAS
 Diperoleh dari 3-4 konsentrasi, dari nilai yang dekat dengan LoQ hingga
ratusan mg/L
 Dari tabel menunjukkan koefisien korelasi (R2) yang sangat baik yang teramati
pada semua vitamin.
 Linearitas
 Vitamin Linearity

Concentration R2
range (mg/L)

B2 0,1-100 1

B3 0,05-500 0,9929

B5 0,5-1000 0,9993

B9 0,05-100 0,9999

C 0,05-500 0,9899

 BIAS
 40 g sampel madu dibagi menjadi 4 aliquot (masing-masing 10 g)
 Aliquot 2,3, dan 4 ditambahkan larutan yang berisikan 100mg/L vitamin larut-

air, sedangkan aliquot 1 tidak ada penambahan.

 Dari hasil validasi, metode yang diusulkan dinyatakan akurat.

Vitamin Bias

Recovery
(%±SD)

B2 100±10
B3 99±7
B5 103±7
B9 98±8
C 104±3
VII. PERTANYAAN DAN JAWABAN
VIII. KESIMPULAN
Bahwa vitamin C dan vitamin B3 hampir ada pada semua sampel madu.
Tetapi konsentrasi vitamin C pada umumnya rendah (konsentrasi tertinggi yang
terdeteksi sedikit di atas 5mg kg-1.) dan tidak sesuai dengan asal usul madu. Salah
satu faktornya (mungkin karena adanya interaksi antara asam askorbat, oksidase
glukosa dan katalase pada madu) Sebaliknya, konsentrasi vitamin B3 diamati lalu
di dapatkan 28 mg kg-1 . Dan nampaknya sangat bergantung pada asal tanaman
sampel, kuantifikasi vitamin B5, B2, dan B9 berhasil hanya di capai 50% lalu
sampel dianalisis: sedangkan vitamin B5 dapat mencapai konsentrasi beberapa
puluh mg kg-1.  kita dapat mengandaikan pengaruh asal sampel pada konsentrasi
analit ini juga, namun jumlah sampel yang dianalisis yang rendah terus berlanjut
sampai pada kesimpulan seperti saat ini. Kesimpulannya, walaupun konsentrasi
WSV (Water Soluble Vitamins) pada madu mungkin terlalu rendah untuk
menghasilkan minat di bidang nutrisi, korelasi potensial dengan asal botani dari
sampel mungkin berguna untuk menentukan asal madu.