KALIBRASI SPEKTROFOTOMETER UV/VIS

Tujuan kalibrasi :
- agar alat spektrofotometer dapat digunakan dengan baik
(menghasilkan data yang handal dan absah/valid) dan awet.
- untuk mengetahui letak kesalahan atau kerusakan
secara dini sehingga dapat diperbaiki sebelum alat
mengalami kerusakan berat.
- sesuai persyaratan ISO/IEC 17025 (klausul 5.5)

Kalibrasi : 1. Panjang gelombang (presisi - akurasi)

2. Absorban (presisi - akurasi)

3. Sinar sesatan

Verifikasi (Unjuk kerja) alat : pengecekan secara rutin

 Persyaratan Teknis ISO/IEC 17025

5.1 Umum
5.2 Personil
5.3 Kondisi akomodasi dan lingkungan
5.4 Metoda pengujian, metode kalibrasi
dan validasi metode
5.5 Peralatan
5.6 Ketertelusuran pengukuran
5.7 Pengambilan contoh
5.8 Penanganan barang yang diuji dan dikalibrasi
5.9 Jminan mutu hasil pengujian dan kalibrasi
5.10 Pelaporan hasil
 KALIBRASI DAN PEMELIHARAAN
PERALATAN LABORATORIUM UJI
SESUAI ISO/IEC 17025-2005

Persyaratan Teknis

5.5 Peralatan

1. Laboratorium harus dilengkapi dengan peralatan

pengukuran dan pengujian yang diperlukan untuk
melaksanakan pengujian dengan benar

2. - Peralatan dan piranti lunak yang digunakan harus

mampu menghasilkan akurasi yang diperlukan dan
harus sesuai dengan spesifikasi yang relevan
2. - Sebelum digunakan, peralatan harus dikalibrasi
atau dicek untuk menetapkan peralatan tersebut
memenuhi persyaratan spesifikasi laboratorium

3. Peralatan harus dioperasikan oleh personil yang

berwenang dengan instruksi yang mutakhir untuk
menggunakan dan merawat peralatan

4. Setiap peralatan dan piranti lunaknya, bila dapat

dilakukan, diidentifikasi secara unik
5. Memelihara rekaman untuk setiap peralatan dan
piranti lunaknya yang signifikan pada pengujian.
Rekaman tersebut harus mencakup minimal ;
a). Identitas peralatan dan piranti lunaknya
b). Nama manufaktur, tipe, nomor seri
c). Cek kesesuaian peralatan dengan spesikasinya
d). Lokasi terkini, bila sesuai
e). Instruksi manufaktur atau acuannya
f). Tanggal, hasil dan salinan sertifikasi kalibrasi
g). Program perawatan

6. Lab harus mempunyai prosedur penangan yang

aman
7. Peralatan yang telah mengalami pembebanan lebih/
cacat/rusak harus diberi label atau tanda yang
jelas agar tidak digunakan sebelum diperbaiki.

8. Peralatan yang dikalibrasi diberi label atau tanda

untuk identifikasi status kalibrasinya.

9. Bila alat berada diluar pengendalian langsung lab,

maka fungsi dan status kalibrasi harus dicek

10. Perlu ada prosedur & program pengecekan antara

11. Prosedur untuk menangani faktor koreksi kalibrasi

12. Prosedur keamanan terhadap penyetelan peralatan

 INFORMASI APA YANG AKAN
DIPEROLEH DARI HASIL RUN ALAT
SPEKTROFOTOMETER UV/Vis ?

1. Absorbansi/Serapan ; A

2. Transmitansi ; T

3. Panjang gelombang ; 

4. Spektrum absorpsi

5. Kurva kalibrasi standar (Hub c vs A)

 1. KALIBRASI PANJANG GELOMBANG (  )

Ada tiga metode kalibrasi  :

a. Lampu lucutan bertekanan rendah

( Hg ; Cd atau Zn )

b. Gelas filter Holmium atau Didimium

c. Larutan Holmium oksida dalam HClO4

1.a. Lampu lucutan bertekanan rendah

Tabel 1. Garis emisi lampu Hg, Cd dan Zn

Unsur  (nm) Unsur  (nm)

Hg 185,0 Hg 435,8

Zn 213,9 Cd 467,8

Cd 228,8 Cd 480,0

Hg 253,7 Hg 546,1

Hg 365,0 Hg 579,1

Hg 404,7 Cd 643,8
 1.b. Gelas Filter Holmium atau Didimium

Tabel 2. Data  maks terseleksi dari Holmium dan Didimium

Filter Holmium Filter Didimium

maks (nm) maks (nm)
241,5  0,2 573  3,0
279,4  0,3 586  3,0
287,5  0,4 685  4,5
333,7  0,6
360,9  0,8
418,4  1,1
453,2  1,4
536,2  2,3
637,5  3,8
Kurva absorpsi Holmiumoksida filter
Kurva spektrum absorpsi didimium filter
 Tabel 2a. Data  maks eksperimen Holmium oksida


Panjang gelmb Eksperimen Acuan + toleransi
(Eksp – acu) Evaluasi
Acuan (nm) (nm) (nm)

241,5 241,5  0,2

279,4 279,4  0,3

287,5 287,5  0,4
333,7 334 333,7  0,6 
360,9 360 360,9  0,8 ?

418,4 418 418,4  1,1 

453,2 452 453,2  1,4 

536,2 536 536,2  2,3 
637,5 638 637,5  3,8 
 Tabel 2a. Data  maks eksperimen Holmium oksida


Panjang gelmb Eksperimen Acuan + toleransi
(Eksp – acu) Evaluasi
Acuan (nm) (nm) (nm)

241,5 241,4 241,5  0,2 

279,4 279,2 279,4  0,3 

287,5 287,3 287,5  0,4 
333,7 333,4 333,7  0,6 
360,9 360,3 360,9  0,8 

418,4 417,8 418,4  1,1 

453,2 452,8 453,2  1,4 

536,2 535,2 536,2  2,3 
637,5 636,3 637,5  3,8 
 Tabel 2a. Data  maks eksperimen Holmium oksida


Panjang gelmb Eksperimen Acuan + toleransi
(Eksp – acu) Evaluasi
Acuan (nm) (nm) (nm)

241,5 241,4 0,1 241,5  0,2 

279,4 279,2 0,2 279,4  0,3 

287,5 287,3 0,2 287,5  0,4 
333,7 333,4 0,3 333,7  0,6 
360,9 360,3 0,6 360,9  0,8 

418,4 417,8 0,6 418,4  1,1 

453,2 452,8 0,4 453,2  1,4 

536,2 535,2 1,0 536,2  2,3 
637,5 636,3 1,2 637,5  3,8 
 Tabel 2b. Data  maks eksperimen Holmium oksida


Panjang gelmb Eksperimen Acuan + toleransi
(Eksp – acu) Evaluasi
Acuan (nm) (nm) (nm)

241,5 241,8 0,3 241,5  0,2 ?

279,4 279,8 0,4 279,4  0,3 ?

287,5 288,0 0,5 287,5  0,4 ?
333,7 334,5 0,8 333,7  0,6 ?
360,9 361,7 0,8 360,9  0,8 

418,4 419,0 0,6 418,4  1,1 

453,2 453,5 0,4 453,2  1,4 

536,2 537,2 1,0 536,2  2,3 
637,5 638,7 1,2 637,5  3,8 
 1.c. Larutan Holmium(III) oksida dalam HClO4

Cara membuat larutan:

0,50 g Ho(III) Erlenmeyer 2,4 mL HClO4 70%

Kocok semalam 10 mL H2O dionised

Panj. Gelb. Maks Lar. Holmium Oksida (nm)

241,1  0,1 416,3  0,1

278,2  0,5 450,8  0,1
287,2  0,2 485,2  0,2
361,2  0,2 536,5  0,3
640,5
 1.d. Perbandingan Filter & larutan Holmium

Tabel 2a. Data  maks terseleksi dari Holmium Filter & Larutan
 PENGECEKAN PANJANG GELOMBANG

1. Keterulangan panjang gelombang/Wavelength repeatability

Adalah ukuran kemampuan suatu spektrofotometer untuk kembali pada

posisi spektral yang sama yang ditentukan berdasarkan pita absorpsi dari

suatu pita (band) dari panjang gelombang yang telah diketahui bila alat

di reset atau dbaca pada panjang gelombang yang telah ditentukan.

2. Akurasi panjang gelombang/Wavelength accuracy

Adalah besarnya penyimpangan (bias) dari rata-rata pembacaan panjang

gelombang pada suatu pita (band) absorpsi dari panjang gelombang

yeng telah ditentuklan.

2. Kalibrasi Absorbansi

 Konsentrasi analit yang mengabsorpsi berbanding lurus

dengan absorbansi yang terukur.

 Linearitas skala fotometrik harus diperiksa.

 Stabilitas pembacaan fotometrik harus cukup baik

sehingga variasi selama pengukuran tidak berpengaruh
pada ketelitian.

Bahan yang dapat digunakan untuk kalibrasi absorban sbb;

- Larutan Dikromat
- Asam kromat
- Tembaga sulfat
2.a. Larutan K2Cr2O7 dalam 0,005 M H2SO4
(Direkomendasikan untuk daerah UV)

K2Cr2O7

Pada 140-150 C
30 - 60 menit

Keringkan

Lar. A : 50 ± 0,5 mg dalam

1L 0,005 mol/L H2SO4
K2Cr2O7
Kering
Lar. B : 100 ± 1,0 mg dalam
1L 0,005 mol/L H2SO4
Tabel 3. Harga absorban K2Cr2O7 dalam 0,005 M H2SO4

 (nm) Larutan A Larutan B

235 (Min) 0,626  0,009 1,251  0,018

257 (Maks) 0,727  0,007 1,454  0,014

313 (Min) 0,244  0,004 0,488  0,008

350 (Maks) 0,536  0,005 1,071  0,010

 257 (4350)

350 (3250)
Absorptivitas molar

235

313
K2Cr2O7
dlm asam

K2Cr2O7
dlm basa

Panjang gelombang,  (nm)

 Tabel 1.  a Pada Absorbansi spesifik teramati, kg g-1 cm-1 SRM 935a (NBS)

Panjang gelombang dan celah (nm)

Konsent Ketidak
(g/ kg) pastian
235,0 (1,2) 257,0 (0,8) 313,0 (0,8) 345,0 (0,8) 350,0 (0,8)

0,020 12,260 14,262 4,805 10,604 10,672 ± 0,034

0,040 12,304 14,318 4,811 10,603 10,682 ± 0,020
0,060 12,347 14,374 4,816 10,602 10,692 ± 0,020
0,080 12,390 14,430 4,821 10,601 10,701 ± 0,020
0,100 12,434 14,486 4,827 10,600 10,711 ± 0,020

235,0 (1,6) 257,0 (1,6) 313,0 (1,6) 345,0 (1,6) 350,0 (1,6)
0,120 12,480 14,541 4,835 10,600 10,722 ± 0,04
0,140 12,524 14,605 4,840 10,599 10,731 ± 0,04
0,160 12,557 14,658 4,846 10,599 10,742 ± 0,04
0,180 12,609 14,711 4,851 10,598 10,751 ± 0,04
0,200 12,649 14,763 4,856 10,597 10,759 ± 0,04
 Tabel 2. A, Pada Absorbansi spesifik teramati , SRM 935a (NBS)

Panjang gelombang dan celah (nm)

Konsent Ketidak
(g/ kg) pastian
235,0 (1,2) 257,0 (0,8) 313,0 (0,8) 345,0 (0,8) 350,0 (0,8)

0,020 0,245 0,285 0,056 0,212 0,213 ± 0,034

0,040 0,492 0,573 0,192 0,424 0,427 ± 0,020
0,060 0,741 0,862 0,289 0,636 0,642 ± 0,020
0,080 0,991 1,154 0,386 0,848 0,856 ± 0,020
0,100 1,243 1,449 0,483 1,060 1,071 ± 0,020

235,0 (1,6) 257,0 (1,6) 313,0 (1,6) 345,0 (1,6) 350,0 (1,6)
0,120 1,498 1,745 0,580 1,272 1,287 ± 0,04
0,140 1,753 2,045 0,678 1,484 1,502 ± 0,04
0,160 2,011 2,345 0,775 1,696 1,719 ± 0,04
0,180 2,270 2,648 0,873 1,908 1,935 ± 0,04
0,200 2,530 2,953 0,971 2,119 2,152 ± 0,04
Ketentuan :
Penggunaan Standard Reference Material 935a (NBS)
(Kristal Kalium Dikromat)
1. Nilai acuan  a dalam 0,001 N asam perklorat dengan satuan
kg.g-1 cm-1pada 23,5 C.
2. Verifikasi Akurasi dan linieritas ditujukan pada 235, 257, 313,
345 dan 350 nm
3. Efektif spectral band pass 1,6 nm
4. Pengeringan 105 C selama 12 jam menunjukkan kandungan
airnya kurang dari 0,01 %.
5. Rentang suhu percobaan diperkenankan antara 20 – 30 C
6. Pada  = 345,0 nm untuk menguji akurasi panjang gelombang
 Absorptivitas molar

235

257 (4350)

313
345
350 (3250)

Panjang gelombang,  (nm)

 Tabel 2. A, Pada Absorbansi spesifik teramati , SRM 935a (NBS)

Panjang gelombang dan celah (nm)

Konsent Ketidak
(g/ kg) pastian
235,0 (1,2) 257,0 (0,8) 313,0 (0,8) 345,0 (0,8) 350,0 (0,8)

0,020 0,245 0,285 0,056 0,212 0,213 ± 0,034

0,040 0,492 0,573 0,192 0,424 0,427 ± 0,020
0,060 0,741 0,862 0,289 0,636 0,642 ± 0,020
0,080 0,991 1,154 0,386 0,848 0,856 ± 0,020
0,100 1,243 1,449 0,483 1,060 1,071 ± 0,020

235,0 (1,6) 257,0 (1,6) 313,0 (1,6) 345,0 (1,6) 350,0 (1,6)
0,120 1,498 1,745 0,580 1,272 1,287 ± 0,04
0,140 1,753 2,045 0,678 1,484 1,502 ± 0,04
0,160 2,011 2,345 0,775 1,696 1,719 ± 0,04
0,180 2,270 2,648 0,873 1,908 1,935 ± 0,04
0,200 2,530 2,953 0,971 2,119 2,152 ± 0,04
ASTM : E 925 Tabel 3a. Absorbansi terbaca (A), SRM 935a (NBS)

Panj glb Konsent Rentang Absorban Absorban Abs Kesim

(celah), (mg/L) absorbansi si teramati si blanko terukur = pulan
nm kalkulasi (Ar) (Ab) Ar - Ab

235 (1,2) 40 0,485 - 0,499

50 0,607 – 0,625
60 0,730 – 0,752
70 0,853 – 0,879
257 (08) 40 0,564 – 0,582
50 0,706 – 0,728
60 0,840 – 0,875
70 0,993 – 1,023
313 (0,8) 40 0,189 – 0,195
50 0,237 – 0,245
60 0,285 – 0,293
70 0,332 – 0,342
345 (0,8)
350 (0,8)
ASTM : E 925 Tabel 3a. Absorbansi terbaca (A), SRM 935a (NBS)

Panj glb Konsent Rentang Absorban Absorban Abs Kesim

(celah), (mg/L) absorbansi si teramati si blanko terukur = pulan
nm kalkulasi (Ar) (Ab) Ar - Ab

350 (0,8) 40 0,427 -

50 0,534 –
60 0,642 –
70 0,749 –
40
50
60
70
313 (0,8) 40
50
60
70
345 (0,8)
ASTM : E 925 Tabel 3b. Absorbansi terbaca (A), SRM 935a (NBS)

Panj glb Konsent Rentang Absorban Absorban Abs Kesim

(celah), (mg/L) absorbansi si teramati si blanko terukur = pulan
nm kalkulasi (Ar) (Ab) Ar - Ab

235 (1,2) 40 0,485 - 0,499 0,500 0,002 0,498

50 0,607 – 0,625 0,626 0,002 0,524
60 0,730 – 0,752 0,752 0,002 0,750
70 0,853 – 0,879 0,870 0,002 0,868
257 (08) 40 0,564 – 0,582 0,584 0,003 0,579
50 0,706 – 0,728 0,728 0,003 0,725
60 0,840 – 0,875 0,878 0,003 0,875
70 0,993 – 1,023 1,027 0,003 1,024
313 (0,8) 40 0,189 – 0,195
50 0,237 – 0,245
60 0,285 – 0,293
70 0,332 – 0,342
345 (0,8)
350 (0,8)
 KOREKSI SUHU TERHADAP NILAI 

KALIBRASI ABSORBAN DILAKUKAN PADA SUHU : 20 - 30 C

k
 t =  23,5 [ 1 + ( t - 23,5)]
100

 (nm) k (koef. suhu)

235 -0,05
257 -0,05
313 -0,02
345 -0,08
350 -0,05
Hitunglah nilai  dan A larutan K2Cr2O7 0,02 g/kg
pada suhu 25,5 C ?

Pada

 = 235,0 25,5 = 12,260 [ 1 + (-0,05/100) x 2 ]

= 12,260 x 0,999 = 12,249 A = 0,2449

 = 257,0 25,5 = 14,262 [ 1 + (-0,05/100) x 2 ]

= 14,262 x 0,999 = 14,248 A = 0,2849

 = 313,0 25,5 = 4,805 [ 1 + (-0,02/100) x 2 ]

= 4,805 x 0,999 = 4,800 A = 0,0960

 = 345,0 25,5 = 10,640 [ 1 + (-0,05/100) x 2 ]

= 10,640 x 0,998 = 10,587 A = 0,2117

 = 235,0 25,5 = 10,672 [ 1 + (-0,05/100) x 2 ]

= 10,672 x 0,999 = 10,661 A = 0,2132
 2.b. Larutan CuSO4 dalam H2SO4 1%
(Direkomendasikan untuk daerah Vis)

Cara pembuatan larutan CuSO4 :

20 g CuSO4 5H2O

Akuades Labu takar 1L 10 mL H2SO4 (d 1,83)

addkan
Akuades Lar CuSO4
Tabel 4: Nilai absorbansi lar. CuSO4 dalam H2SO4 1%.

Catatan : - pengukuran dilakukan dengan kuvet 10 mm

- lebar pita (bandwiths) lebih kecil dari 10 nm
- penyimpangan absorban maksimum 2%
3. Tes untuk Sinar Sesatan :

Untuk mengetahui unjuk kerja sinar sesatan dianjurkan

menggunakan metode ASTM dengan cara :
Pada 220 nm: ukur transmitansi dari 10 g/L NaI dengan
kuvet 1 cm %T < 10-10
Pada 340 nm: ukur transmitansi dari 50 g/L NaNO3 dengan
kuvet 1 cm %T = ?