See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/339132965

ELEKTROFORESIS VERTICAL SDS-PAGE

Method · March 2018

CITATIONS READS

0 38,001

1 author:

Andri Setiawan
Brawijaya University
28 PUBLICATIONS   44 CITATIONS   

SEE PROFILE

All content following this page was uploaded by Andri Setiawan on 09 February 2020.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 LAPORAN PRAKTIKUM
INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE
ELEKTROFORESIS VERTICAL SDS-PAGE

OLEH:
ANDRI SETIAWAN
NIM: 176070100011002

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2018
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan
perbedaan berat molekul. Elektroforesis gel adalah teknik yang paling sering
digunakan di laboratorium untuk analisis protein dan DNA. Teknik ini
menggunakan prinsip elektroforesis zona dimana molekul protein bermigrasi pada
medium gel yang direndam dengan larutan penyangga di bawah pengaruh medan
listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa
molekul protein.
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan
listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut
akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang
terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anoda) akan
bergerak menuju kutub positif (katoda), sedangkan molekul-molekul yang
bermuatan positif (katoda) akan bergerak menuju kutub negatif (anoda).
Elektroforesis gel memisahkan molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-
masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama.
Ada beberapa gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis. Diantaranya gel
agarosa yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar dari
200 bp dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil kurang dari 200 bp.
Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel.
Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih
jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak
menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel memberikan resolusi
yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih
besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel
yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang
yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen
DNA kecil.
 Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada
deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan
kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang
dapat diperiksa. Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita
yang tidak berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak
sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan.

1.2 Tujuan
Adapun tujuan dilakukan praktikum ini adalah untuk :
1. Melakukan prosedur elektroforesis vertikal dengan metode SDS-PAGE
2. Mengidentifikasi berat molekul dari sampel protein
 BAB II
METODE PRAKTIKUM

2.1 Pelaksanaan Kegiatan Praktikum

Praktikum Elektroforesis Vertical SDS-PAGE ini dilaksanakan pada Rabu,
21 Maret 2018, dan bertempat di Laboratorium Sentral Biomedik Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya.
2.2 Prosedur Kerja
Adapun prosedur kerja dalam praktikum ini dibagi menjadi beberapa tahap
sebagai berikut :
A. Persiapan Gel
Alat dan bahan yang digunakan adalah Gel caster, Kaca, Penjepit kaca,
ddH2O, Acrillamida, Gel buffer, 10 % SDS, Tris-HCl, APS, dan TEMED.
Adapun prosedur pembuatan gel adalah sebagai berikut :
1. Alat dan bahan disiapkan, kaca dipasang pada penjepitnya.
2. Disiapkan bahan untuk membuat separating gel 12% terdiri dari 3,4 ml
ddH2O, 4 ml acrillamida, 2,5 ml Gel buffer, dan 0,1 ml SDS 10%, 1,5
M Tris-HCl pH 8,8, 100 µl 10% APS dan 10µl TEMED.
3. Campuran bahan separating gel dihomogenkan dengan cepat agar tidak
segera mengeras.
4. Campuran separating gel dimasukkan pada gel caster dengan bantuan
pipet, diikuti dengan pemberian aquades agar permukaan gel rata dan
tidak ada gelembung udara. Ruang disisakan untuk stacking gel.
5. Setelah separating gel mengeras, sisa aquades dibuang.
6. Campuran stacking gel 4% disiapkan dan dihomogenkan dengan cepat,
terdiri dari 6,1 ml ddH2O, 1,3 ml acrillamida, 2,5 ml Gel buffer, dan
0,1 ml SDS 10%, 0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 50 µl 10% APS dan 5 µl
TEMED.
7. Campuran stacking gel dituang di atas separating gel dan sisir segera
dipasang diatas stacking gel. Gel dibiarkan hingga mengeras.
8. Setelah gel mengeras, kaca dilepas dari penjepitnya.
B. Elektroforesis Gel
Alat dan bahan yang digunakan adalah Alat elektroforesis, gel, running
buffer (yang dibuat dari Tris-Base 3,03 gr, Glicine 14,4 gr, SDS 1 gr, dan
Akuades 1 L) dan sampel. Adapun prosedur elektroforesis gel adalah
sebagai berikut:
1. Gel pada kaca dipasang pada alat elektroforesis
2. Running buffer dituang
3. Sampel protein dimasukkan ke dalam gel melalui ujung atas stacking
gel sebanyak 1 µl / sumur
4. Power supply dinyalakan
5. Sampel diproses atau running dengan memberikan tegangan listrik
sebesar 120 V selama 60 menit
6. Gel dilepas dari kacanya

C. Staining dengan Coomasie Briliant Blue

Alat dan bahan yang digunakan adalah 1 buah wadah plastik bertutup,
Staining Solution (100 ml) yang dibuat dari Coomassie Briliant Blue 0,25
gr, Methanol 40 ml, Asam Acetat Glacial 10 ml, dan ditambah dengan DI
water sampai 100 ml. Adapun prosedurnya adalah sebagai berikut : Gel
direndam dalam staining solution Coomasie Brilliant Blue kemudian
diletakkan di dalam shaker selama 30 menit.

D. Destaining
Alat dan bahan yang digunakan adalah 1 buah wadah plastik bertutup,
Destaining Solution (100 ml) yang dibuat dari Methanol 20 ml, Asam
Acetat Glacial 10 ml, dan ditambah DI water sampai 100 ml. Adapun
prosedurnya adalah gel direndam dalam destaining solution ± 1 – 2 jam
sambil tetap di shaker sampai gel kelihatan bersih. Gel siap dianalisa
hasilnya.
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil
Setelah gel distaining dan di analisis dengan Gel Doc EZ Imager (Bio-Rad),
didapatkan band-band protein yang terbentuk pada tiap sumuran seperti tampak di
bawah ini.

Perhitungan berat molekul (BM) dari masing- masing protein didasarkan pada
marker yang tersedia. Perhitungan dilakukan dengan mengukur total jarak tracking
dari stacking gel ke separating gel, dilanjutkan dengan mengukur jarak tracking dari
stacking gel ke masing-masing band protein yang terbentuk, kemudian dari BM
masing-masing band marker di log kan, kemudian dicari retardation factor (RF)
dengan membagi jarak tracking masing-masing band dengan jarak tracking total.
Setelah itu dimasukkan Rumus:
BM sampel = anti log BM sampel
log BM sampel = (RF kecil – RF sampel) x (log BM besar – log BM kecil) + log BM kecil
(RF kecil – RF besar)
Karena pada saat praktikum Analisis gel Electroforesis SDS PAGE
menggunakan Sofware gel-analyzer maka line dan band dapat di deteksi secara
otomatis, Kalibrasi Rf untuk memperbaiki distorsi gel run, perhitungan kuantitas
dan berat molekul akurat dengan 4 jenis kurva kalibrasi yang berbeda.

Hasil pembacaan band pada sumuran ditampilkan dalam tabel di bawah ini :
Marker/sampel BM Band % RF Volume Ket
(kDa) (int)
Marker band 1 245 10,6 0.031746 423.072
band 2 180 3,3 0.079365 131.508
band 3 135 7,5 0.095238 298.428
band 4 100 8,4 0.126984 335.010
band 5 75 21 0.18254 835.536
band 6 63 1,7 0.222222 68.874
band 7 48 4,6 0.269841 182.676
band 8 35 5,4 0.349206 216.060
band 9 25 3,5 0.452381 138.840
band 10 20 34 0.634921 1.353.924
Sampel band 1 245,0 1,6 0,014 193.128
5 band 2 245,0 1,9 0,037 229.476
band 3 245,0 2,7 0,063 327.054
band 4 37.41 1,3 0,117 160.914
band 5 245,0 1,7 0,132 209.508
band 6 245,0 0 0,196 1.326
band 7 245,0 0,3 0,255 32.448
band 8 245,0 5,4 0,298 651.534
band 9 245,0 0,4 0,328 46.878
band 10 245,0 0,4 0,342 47.502
band 11 245,0 0,9 0,362 105.846
band 12 245,0 0,7 0,385 81.666
band 13 245,0 0,4 0,414 43.134
band 14 149,4 0,1 0,443 14.430
band 15 136,1 0,8 0,462 95.004
band 16 129,8 1,4 0,477 164.736
band 17 123,8 1,8 0,494 218.478
band 18 110,0 0,3 0,535 40.326
band 19 100,0 0,7 0,569 79.872
band 20 93,7 0,1 0,595 11.310
band 21 76,7 11,4 0,675 1.390.818
band 22 63,6 11,3 0,709 1.380.990
band 23 53,8 9,9 0,732 1.207.674
band 24 36,5 13,9 0,798 1.695.408
band 25 30,0 10,7 0,824 1.300.260
band 26 20,6 10,7 0,900 1.302.756
band 27z 20,0 9,4 0,913 1.139.112
3.2 Pembahasan
Pada elektroforesis vertical ini digunakan metode SDS PAGE dengan gel
berbahan dasar polikrilamida karena sampel yang digunakan adalah sampel protein.
Pemilihan komposisi stacking gel dan separating gel didasarkan pada berat
molekul protein yang akan di – running, bila sampel protein yang akan di running
belum diketahui berat molekulnya, maka digunakan gel dengan komposisi 12,5%
terlebih dahulu, jika kemudian saat running terjadi loss protein, maka komposisi gel
dinaikkan menjadi 25% dan seterusnya.
Komposisi gel berpengaruh terhadap hasil running sampel protein. Gel berperan
sebagai pori atau saringan yang akan menyaring protein berdasarkan ukuran
molekul. Protein dengan berat molekul kecil akan turun terlebih dahulu dengan
cepat menuju ke dasar gel dan protein dengan berat molekul besar akan tertahan di
gel bagian atas. Jika komposisi gel yang digunakan tidak sesuai, misalnya
komposisi gel terlalu kecil maka pori dari gel menjadi longgar sehingga protein
dengan berat molekul kecil akan terus turun, sedangkan jika komposisi gel terlalu
besar maka pori dari gel menjadi rapat sehingga protein dengan berat molekul besar
akan tertahan di atas.
Aliran listrik yang digunakan sebesar 90 – 120 V berfungsi untuk memberi
muatan pada protein untuk bergerak melewati pori gel dan bergerak dari atas ke
bawah gel sesuai dengan berat molekul sampel protein tersebut. Protein dengan
berat molekul kecil akan bergerak terlebih dahulu dengan cepat melewati pori
sampai batas di mana pori tidak cukup besar untuk melewati pori gel. Batas tersebut
lah yang terlihat sebagai band pada gel. Aliran muatan listrik mengalir ke protein
lewat running buffer yang diisikan pada kit elektroforesis. Setelah itu dilakukan
staining dengan menggunakan Coomasie Brilliant Blue dalam waterbath agar band
yang timbul tampak jelas dan kemudian dilakukan destaining agar band dapat
diamati. Berat molekul protein sampel dihitung dengan menggunakan Sofware gel-
analyzer.
 BAB IV
KESIMPULAN

4.1 Kesimpulan
Berdasarkan dari hasil dan pembahasan maka dapat disimpulkan bahwa:
1. Elektroforesis gel adalah teknik memisahkan protein berdasarkan
perbedaan berat molekulnya dengan menggunakan medium gel, prinsip
kerja elektroforesis gel adalah protein akan bermigrasi menuju kutub
positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di
dalamnya, prosedur kerja elektroforesis gel meliputi pembuatan gel,
elektroforesis, staining dan destaining.
2. Hasil praktikum pada sampel 5 didapatkan protein dengan berat molekul
(kDa) mulai dari band 1-27 adalah 245, 245, 245,0, 37.41, 245,0, 245,0,
245, 245, 245, 245, 245, 245, 245, 149.4, 136.1, 129.8, 123.8, 110, 100,
93.7, 76.7, 63.6, 53.8, 36.5, 30, 20.6, dan 20
 DAFTAR PUSTAKA

Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga

: Jakarta.
Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical
Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA
fragment analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2):
351-354 (2010).
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech
Publisher : Rijeka, Croatia.
Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked
Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen
Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011.

View publication stats