Hanandayu W., M.Si.

Prodi D-III ANAFARMA Poltekkes Kemenkes Malang

Faktor Penting dalam Analisis
TIDAK
Campuran
MENGABSORPSI
REM PADA λ
PENGUKURAN

Syarat Pelarut

• Tidak mengandung sistem terkonjugasi pada

struktur molekulnya → TIDAK BERWARNA
• Tidak berinteraksi dg molekul senyawa yg
diukur
• Mempunyai kemurnian tinggi
 Apabila senyawa yg akan
dianalisis merupakan larutan
tak berwarna maka perlu
ditambahkan reagen yang
akan menghasilkan senyawa
turunan yg mampu menyerap
REM.
➢Contoh :
➢Larutan Mn2+ (violet pucat)

Periodat / persulfat

permanganat
 KALIBRASI
➢ suatu proses menghubungkan sinyal analitik yang diukur (respon
alat) dengan konsentrasi analit.
➢ merupakan proses verifikasi bahwa suatu alat ukur sesuai dengan
rancangannya.

Metode Kalibrasi
➢ Kurva Baku / Standar
➢ Metode Adisi Standar
➢ Metode Standar Internal
Metode Kalibrasi Alat
A. KURVA KALIBRASI
Sejumlah larutan baku dengan dengan variasi
konsentrasi disiapkan, kemudian diukur menggunakan
instrumen, dan respon instrumen dicatat.
Larutan Baku – Larutan analit yg telah diketahui
konsentrasinya. Larutan baku dibuat agar
dalam pengukuran menggunakan
instrumen tidak melampaui batas linearitas
(LOL = Limit of Linearity) dari instrumen.

Kurva Kalibrasi – Plot konsentrasi baku (X) versus respon

instrumen (Y).
Hubungan antara konsentrasi baku dan
respon instrumen adalah linier.
Larutan Baku Pembanding

• Dibuat dari senyawa murni.

• Larutan yang digunakan sebagai
komparator visual dalam proses
pengukuran menggunakan
spektrofotometer.
• Semakin pekat warna larutan, semakin
tinggi konsentrasi senyawa terlarut.
• Umumnya untuk kalibrasi alat.
Larutan Baku Pembanding

• Dibuat dalam beberapa konsentrasi

dengan akurasi dan presisi tinggi →
Kurva Baku

• Kurva Baku WAJIB MEMENUHI Hk.

Lambert-Beer
SPEKTROFOTOMETER
Metode Kalibrasi Alat
A. KURVA KALIBRASI
1. Penyiapan Kurva Kalibrasi
Konsentrasi Respon Instrumen (RI) RI terkoreksi (Si – Sbl)
0,00 0.013 0.000
6.01 0.101 0.088
31.80 0.811 0.798
63.50 1.498 1.485
88.90 2.094 2.081
Sampel 0.924 0.875
2.5
Kurva Kalibrasi
RI terkoreksi

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
0 20 40 60 80 100
Konsentrasi
Metode Kalibrasi Alat
A. KURVA KALIBRASI
1. Penyiapan Kurva Kalibrasi
Gunakan metode regresi linier untuk menghitung persamaan fitting y
= ax + bx y x2 y2 xy
i i i i i i
Concentration IR Corr. IR
0.000 0.013 0.000 0.000000 0.000000 0.000000
6.010 0.101 0.088
S xx =  (xi −0.636804
36.120100
x ) =  x25.376400
0.007744 (
0.528880 xi )
2

i −
2 2
31.800 0.811 0.798 1011.240000 S yy
N
( x)
−2  i 2.205225 94.297500 S yy =  ( y
2

xx =  ( xi − x )
S 63.500 1.498 2 1.485 =  xi24032.250000 −
88.900 2.094 2 2.0812 (7903.210000
xi ) N
4.330561 185.000900 ( yi )2 i

= S =  ( x − x ) =  x − S =  ( y − y ) 2
=  y 2
−
Mean
190.210
38.042
xx i 4.452
0.890
i 12982.820100
N 7.180334
yy
S
305.203680
xy =
i
 ( xi − x )( y
i
i − y ) =  Nx y
i
S xy =  ( xi − x )( yi − y ) =  xi yi − 
xi 
S xy =  ( xi − x )( yi − y ) =  xi yi −  i  i
x y
m = S xy S xx (Slope)
N b= y-
m = S xy S xx (Slope) b = y -x m (Y - in
m = S xy S xx (Slope) b = y -x m (Y - intercept)
S xy
S xy r=
S xy r = S xx  S yy
r= S xx  S yy
S xx  S yy
Metode Kalibrasi Alat
A. KURVA KALIBRASI
1. Penyiapan Kurva Kalibrasi
Metode Kalibrasi Alat
A. KURVA KALIBRASI
2. Interpretasi Kurva Kalibrasi
Gunakan persamaan fitting y = mx + b untuk menghitung konsentrasi sampel

m = 0.0236 & b = -0.0078

y = 0.0236x – 0.0078

Sehingga:
x = (y – b)/m
x = (y + 0.0078)/0.0236

dan:
x (konsentrasi sampel) = (0.875+0.0078)/0.0236
= 37.4
Metode Kalibrasi Alat
B. METODE ADISI STANDAR
• Digunakan untuk analit dalam matriks yang kompleks →
munculnya interferensi dalam respon instrumen (RI).
Contoh: darah, sedimen, serum, dll.
• Sering disebut juga metode SPIKING.
• Metode: 1. Siapkan beberapa aliquot identik, Vx, dari sampel.
2. Tambahkan sejumlah volume tertentu secara
bervariasi, Vs, larutan baku yang telah diketahui
konsentrasinya, cs, pada tiap aliquot.
3. Encerkan masing2 larutan hingga volume tertentu,
Vt
4. Ukurlah dengan instrumen untuk mendapatkan
respon instrumen, S
5. Hitung konsentrasi sampel, cx, dengan persamaan
berikut:
Metode Kalibrasi Alat
B. METODE ADISI STANDARD
kVs cs kVxcx
• Persamaan Adisi Standar S= +
Vt Vt

S= sinyal atau respon instrumen

k = konstanta proporsionalitas
Vs = volume standard yg ditambahkan
cs = konsentrasi standard
Vx = volume aliquot sampel
cx = konsentrasi sample
Vt = volume total pengenceran
Metode Kalibrasi Alat
B. METODE ADISI STANDARD
• Plot respon instrumen (S) vs volume standard (Vs)

m = D y/ D x
Respons Instrumen ( S )

b = y-intercept

(V s ) 0

Vs

S = mVs + b
Metode Kalibrasi Alat
B. METODE ADISI STANDARD
• Hitung konsentrasi sampel.
• Kombinasikan:
kVs cs kVxcx
S = mVs + b dan S= +
Vt Vt

bcs
cx =
mVx
Metode Kalibrasi Alat
B. METODE ADISI STANDARD
Contoh: Metode Adisi Standard
Arsenik in suatu sampel biologi ditetapkan dengan metode adisi standard.
10 mL aliquot sample dipipet ke dalam 5 buah labu takar 100 mL. Variasi
volume dari standard 22.1 ppm ditambahkan ke dalam 4 labu takar, masing 2
diencerkan hingga batas. Absorbansi masing2 larutan ditentukan.

Sample (mL) Standard (mL) Absorbance

10.0 0.00 0.156
10.0 5.00 0.195
10.0 10.00 0.239
10.0 15.00 0.276
10.0 20.00 0.320

Hitung konsentrasi sampel!

Metode Kalibrasi Alat
B. METODE ADISI STANDARD

Contoh: Metode Adisi Standard

b.cs
Adisi Standard Arsenik
cx =
0.45 m.Vx
0.40
m = 0.00818
(0.1554 )(22.1)
Absorbance

cx =
0.35
b = 0.1554
Sm = 0.000119
0.30
S = 0.001463
(0.00818)(10)
0.25

0.20
cx = 41.98 ppm
0.15

0.10

0.05

0.00
0 5 10 15 20

Volume Standar (V) s

Metode Kalibrasi Alat
B. METODE ADISI STANDARD
Contoh: Metode Adisi Standard
• Penggunaan Adisi Standard untuk menghitung konsentrasi sampel

1) Buat 2 larutan yg mengandung aliquot sampel yg sama, tambahkan

standar pada salah satu larutan. Encerkan hingga batas (100 mL)
2) Ukurlah respon instrumennya (absorbansi) pada kedua larutan.
3) Hitung konsentrasi sampel dengan persamaan berikut:

S1csVs
cx =
(S2 − S1 )Vx
dimana: S1 = respon instrumen sampel
S2 = respon instrumen sampel + spike
Metode Kalibrasi Alat
B. METODE ADISI STANDARD
Contoh: Standard Addition 2 titik
Sebanyak 25.0 mL aliquot larutan quinine diencerkan hingga
50.0 mL dan diukur absorbansinya, mempunyai absorbansi
0.416 pada 348 nm diukur dalam kuvet setebal 1.00 cm.
Sebanyak 25 mL aliquot kedua dicampur dengan 10.0 mL
larutan yg mengandung 23.4 ppm quinine. Setelah diencerkan
hingga50.0 mL, larutan ini memiliki absorbansi 0.610 (kuvet
1.00 cm pada panjang gelombang yg sama). Hitung
konsentrasi (ppm) quinine dalam sampel.
S1 = 0.416
S1csVs
S2 = 0.610 cx =
Vs = 10 mL (S2 − S1 )Vx
cs = 23.4 ppm (0.416)(23.4)(10.0)
cx = = 20.07 ppm
Vx = 25.0 mL (0.610 − 0.416)(25.0)
Metode Kalibrasi Alat
C. METODE STANDARD INTERNAL
• Umumnya digunakan dalam GC dan HPLC
• Suatu senyawa reference/pembanding (standard internal) dengan
volume/massa yg konstan ditambahkan ke dalam larutan standar
dan sampel.
• Rasio analit terhadap standard internal digunakan sebagai sumbu
Y dalam plot kurva kalibrasi dan untuk menetapkan sampel.
Metode Kalibrasi Alat
C. METODE STANDARD INTERNAL
Hexane Calibration Curve

2.50E+06

2.00E+06 y = 31641x + 142659

R2 = 0.8171
1.50E+06
Peak Area

1.00E+06

5.00E+05

0.00E+00
0 10 20 30 40 50 60

Conc. (ppt hexane)

Metode Kalibrasi Alat
C. METODE STANDARD INTERNAL
Hexane/Octane Calibration Curve

2.5

y = 0.0359x + 0.0772
2 R2 = 0.9998
Heaxne/Octane Peak Area

1.5

0.5

0
0 10 20 30 40 50 60

Conc. (ppt hexane)

Syarat Kurva Standar yg Baik
• Deret kadar larutan kerja yg berbeda secara
proporsional → instrument memberikan respon
proporsional
• Persamaan linier yg muncul dituliskan sbb :
y = b + mx
y = absorbansi
x = kadar/konsentrasi analit
b = intercept
m = slope

• PS: Notasi umum utk pers. linier di kalkulator adalah y = a + bx

Syarat Kurva Standar yg Baik

• Kurva baku yang ideal seharusnya nilai

intercept-nya (b) adalah 0 karena saat
larutan blanko diukur diharapkan tidak
ada respon instrument yg muncul.
Penyebab muncul respon saat pengukuran blanko
:
• Interaksi
• Interferensi
• Noise
• kontaminasi
Syarat Kurva Standar yg Baik

• Slope atau kemiringan (m) merupakan ukuran

sensitifitas dari suatu metode pengujian.

• m >>> sensitifitas tinggi; respon instrument

kuat thd perubahan konsentrasi analit

• Linieritas (r) memenuhi batas keberterimaan.

Linieritas Kurva

Korelasi antara kadar analit (x) dengan

absorbansi (y) diterjemahkan sebagai
koefisien korelasi yg dilambangkan dg (r)
dan dirumuskan sbg berikut :
r = koefisienregresi linier
xi = kadaranalitke – I
𝑥ҧ = rata-rata kadaranalit
yi = absorbansike– I
𝑦ത = rata-rata absorbansi
Linieritas Kurva

Koefisien korelasi (r) bervariasi dari -1

hingga 1 yang berarti bahwa :

a. r = 1 → korelasi linier positif sempurna

b. r = 0 → tidak berkorelasi secara linier
c. r = - 1 → korelasi linier negatif sempurna
Linieritas Kurva
Pembuatan Kurva Standar yg Baik
• Digunakan beberapa larutan kerja yg berbeda
konsentrasi (proporsional) dan blanko sbg
control.
• Jumlah deret larutan kerja HARUS SESUAI
dengan metode yg digunakan
• Jika tidak disyaratkan, pertimbangkan efisiensi
kerja namun tetap memperhatikan batas
keberterimaan.
• Secara statistik → 3 larutan kerja (beda
proporsional)
• Umum di lab → 5 larutan kerja  GUNAKAN!!
Pembuatan Kurva Standar yg Baik

• Kons. larutan kerja tertinggi → 2 – 5x

perkiraan kons. analit sampel yg diuji dan
tetap pada rentang daerah kerja metode
pengujian.
• Kons. Larutan kerja terendah → sesuai
limit deteksi
Kurva Baku yg memenuhi Hk. LB

1,2
Kurva Standar Fosfat Kons Fosfat Absorbansi
1 (mg/L) (A)
0,8
y = 1,0673x - 0,0177
0 0
Absorbansi (A)

R² = 0,9953
0,6
0.1 0.1
0,4
0.2 0.2
0,2
0.4 0.41
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
0.6 0.59
-0,2
Konsentrasi Fosfat (mg/L)
0.8 0.8
 ☺ LATIHAN ☺
• Penentuan fosfat dalam sampel air dilakukan dengan
metode molibdat-SnCl2 menggunakan Spektrofotometer
Sinar Tampak. Bila dari hasil pengukuran diketahui
absorbansi larutan sampel (triplo) sebesar 0,3467;
0,3660; dan 0,3456, berapakah konsentrasi fosfat dalam
sampel tersebut?
• Data Kurva Standar
[Larutan Fosfat] Absorbansi
(mg/L)
0,0 0,0000
0,2 0,2011
0,4 0,3846
0,8 0,7998
1,0 1,0874
 ANALISIS MULTIKOMPONEN

• Dilakukan apabila sampel mengandung

komponen – komponen senyawa yang
sama-sama mampu menyerap REM pd λ
yang sama.
• Absorbsi total analit pada λ tertentu =
jumlah tiap komponen yg ada
 ANALISIS MULTIKOMPONEN

Suatu analat dapat mengandung > dari 1 komponen yang bisa

diukur dengan cara spektrofotometri UV-Vis

komponen-komponen yang tercampur

 hasil reaksi kesetimbangan salah satu komponen
tidak berinteraksi satu sama lainnya
mengikuti hukum Lambert-Beer → asumsinya bahwa
absorbans terukur merupakan jumlah absorbans dari
masing-masing komponen
A1 = Ax,1 + Ay,1 + Az,1 …. = x1bCX + y1bCY + z1bCZ ….
A2 = Ax,2 + Ay,2 + Az,2 …. = x2bCX + y2bCY + z2bCZ ….

Spektrum absorbsi tiap komponen perlu diketahui → menentukan

komposisinya dalam analat
 ANALISIS MULTIKOMPONEN
Ada 3 kemungkinan spektrum absorpsi dua atau lebih senyawa yang
bercampur yaitu: (1) terpisah, (2) bertumpang tindih sebagian, dan (3)
bertumpang tindih sempurna
A

1 2  (nm)
Spektrum absorpsi terpisah dari zat-zat yang tercampur
A1 = kX,1CX
2 kurva standar
A2 = kY,2CY
 ANALISIS MULTIKOMPONEN
A

1 2  (nm)
Spektrum absorpsi bertumpang tindih sebagian dari
senyawa yang bercampur

A1 = kX,1CX + kY,1CY

A2 = kY,2CY 3 kurva standar
 ANALISIS MULTIKOMPONEN
A

1 2  (nm)
Spektrum absorpsi bertumpang tindih sempurna dari
senyawa yang bercampur

A1 = kX,1CX + kY,1CY

A2 = kX,2CX + kY,2CY 4 kurva standar
Analisis Multi Komponen

• Karena absorbansi total merupakan

jumlah sumbangan dari komponen
penyerap pada larutan itu, maka :
Analisis Multi Komponen

❑Yg ditentukan hanya Cx dan Cy dalam

kedua persamaan itu.
❑Nilai ε harus diketahui dari pengukuran thd
larutan murni X dan Y pada kedua panjang
gelombang tsb.
Analisis Multi Komponen
CONTOH :
Suatu sampel larutan yang akan dianalisis diketahui
mengandung komponen Co(II) dan Cr(III) yang
mempunyai spektrum absorpsi bertumpang tindih
sempurna. Penentuan konsentrasi dua komponen tersebut
dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis secara
simultan. Serapan maksimum Co terjadi pada 510 nm dan
serapan maksimum Cr pada 575 nm (konsentrasi larutan
terukur masing2 adalah 0,2 ppm). Absorbansi Co pada
510 nm = 0,21867; Abs. Co pd 575 nm = 0,13167; Abs. Cr
pd 510 nm = 0,072; Abs. Cr pada 575 nm = 0,229.
Absorbansi larutan campuran pd λmaks Co = 0,161 dan
pd λmaks Cr = 0,477. Hitung kons. masing2 komponen
dalam sampel.
TERIMA
KASIH