Jurnal Mikrobiologi Brasil (2011) 42: 1560-1568

ISSN 1517-8382

ISOLASI DAN BUDIDAYA GARIS JAMUR DARI SEL IN VITRO DUA LAUT

SPONS (PORIFERA: HALICHONDRIDAAND HAPLOSCLERIDE)

Enrique E. Rozas 1, 4, Rodolpho M. Albano dua, Gisele Lobo-Hajdu dua, Werner EG Müller 3, Heinz-C. Schröder3, Márcio R.

pemelihara 4*

1Pusat Energi, Lingkungan dan Keanekaragaman Hayati, Sekolah Ilmu Kesehatan, Universitas Negeri Amazonas, Manaus, AM,

Brasil; duaInstitut Biologi Roberto Alcântara Gomes, Universitas Negeri Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil; 3Institut für

Physiologische Chemie, Abt Angewandte Molekularbiologie, Johannes Gutenberg-Universität, Mainz,

Jerman; 4Departemen Fisiologi Umum, Institut Biosains, Universitas São Paulo, São Paulo, SP, Brasil.

Dikirim: 01 Maret 2011; Kembali ke penulis untuk koreksi: 30 Maret 2011; Disetujui: 16 Mei 2011.

ABSTRAK

Meskipun sejumlah besar laporan menggambarkan asosiasi spons-mikroba, pengetahuan terbatas tersedia tentang jamur terkait dan hubungannya dengan inang. Dalam karya ini, strain

jamur spesifik diperoleh langsung dari kultur sel spons in vitro (primmorphs) dan sel spons tunggal (cytospins) dan dibandingkan dengan yang diperoleh dari preparat jaringan utuh.

Sebanyak 27 strain jamur diisolasi dari spons laut Hymeniacidon heliophila dan Haliclona melana. Lima belas galur, sembilan dari H. heliophila dan enam dari H. melana, diperoleh dari

seluruh jaringan dan dianggap sebagai jamur yang berasosiasi dengan mesohyl atau sementara. Dua belas galur diisolasi dari kultur sel spons in vitro (primmorph) dan oleh karena itu

dianggap sebagai sel yang berasosiasi. Dari ini, lima strain berbeda diperoleh dari H. heliophila mengisolasi sel, sementara lima diidentifikasi dari cytospins dan dua dari primmorphs dari

H. melana. Strain jamur yang diperoleh dari kultur sel dari kedua spesies spons berbeda, dan tidak ada satupun yang terdeteksi pada seluruh preparat jaringan dari spesies yang sama.

Sembilan H. heliophila dan tujuh strain H. melana menunjukkan kesamaan yang rendah dengan urutan yang tersedia di database publik dan termasuk spesies baru yang berpotensi. Ini

adalah laporan pertama dari jamur yang diisolasi langsung dari sel spons, yang memungkinkan pengamatan dan pemilihan galur spesifik yang mungkin tidak akan diperoleh dengan

teknik yang bergantung pada kultur biasa. dan tidak satupun dari mereka yang terdeteksi di seluruh jaringan preparat dari spesies yang sama. Sembilan H. heliophila dan tujuh strain H.

melana menunjukkan kesamaan yang rendah dengan urutan yang tersedia di database publik dan termasuk spesies baru yang berpotensi. Ini adalah laporan pertama dari jamur yang

diisolasi langsung dari sel spons, yang memungkinkan pengamatan dan pemilihan galur spesifik yang mungkin tidak akan diperoleh dengan teknik yang bergantung pada kultur biasa.

dan tidak satupun dari mereka terdeteksi di seluruh jaringan preparat dari spesies yang sama. Sembilan H. heliophila dan tujuh strain H. melana menunjukkan kesamaan yang rendah

dengan urutan yang tersedia di database publik dan termasuk spesies baru yang berpotensi. Ini adalah laporan pertama dari jamur yang diisolasi langsung dari sel spons, yang

memungkinkan pengamatan dan pemilihan galur spesifik yang mungkin tidak akan diperoleh dengan teknik yang bergantung pada kultur biasa.

Kata kunci: Spons laut, primmorph, cytospins, deteksi jamur

PENGANTAR sistem, dari daerah tropis ke Daerah Kutub (10). Mereka adalah

organisme pemakan filter sessile yang mempengaruhi proses

Spons laut (Porifera) merupakan salah satu hewan bentik dan pelagis dengan mentransfer sejumlah besar

multiseluler tertua yang masih ada (20). Lebih dari 8.000 material dari kolom air ke dasar laut (25). Tubuh spons

spesies yang dijelaskan menghuni berbagai laut dan air tawar sederhana, dibentuk oleh lapisan epitel luar (pinacocytes)

* Penulis yang sesuai. Alamat surat: Rua do Matão. Trav. 14, tidak. 101. 05508-900. Sao Paulo-SP. Brazil.; Telp: 55 11 3091-7611 Faks: 55 11 3091-8095.; Surel:
mcust@usp.br

1560
Rozas, EE dkk. Strain jamur dari kultur sel in vitro dari dua spons laut

melampirkan mesohyl, dibentuk oleh sel khusus, diisolasi dari lingkungan laut menunjukkan profil metabolit

matriks ekstraseluler dan jaringan saluran dan ruang. Dalam sekunder yang berbeda jika dibandingkan dengan yang dari

ruang ini, air dipompa terus menerus oleh sel-sel berflagel habitat darat. Misalnya, beberapa spesies laut Penicillium

(koanosit) dan mikroorganisme dan partikel organik menghasilkan metabolit sekunder yang tidak diketahui oleh galur

dipertahankan dan difagosit (29). yang terkait erat dengan asal terestrial (15).

Dalam 20 tahun terakhir, spons telah dianggap sebagai Selain mikrobiota terkait, seperti substrat laut lainnya,

salah satu sumber produk alami yang paling produktif (lihat 1, spons juga terpapar sejumlah besar mikroorganisme yang

dan ulasan sebelumnya dari seri ini). Beberapa senyawa telah berbeda dari lingkungan. Hewan-hewan ini dapat menyaring

diisolasi dan diuji, menunjukkan berbagai aktivitas air laut dalam jumlah besar, menahan lebih dari 80% partikel

farmakologis seperti antimikroba, sitotoksik, antimalaria, tersuspensi (23), dan oleh karena itu mikrobiota sementara

antitumor, antivirus, dan antiinflamasi. Keragaman kimia selalu ada di saluran, jaringan, dan permukaannya.

penting, termasuk nukleosida yang tidak biasa, terpene, (24). Kehadiran komunitas ini, seringkali dalam jumlah besar,

peptida siklik dan alkaloid (31). Namun, banyak dari zat ini membuat studi tentang galur tertentu menjadi sangat kompleks.

diproduksi oleh mikroorganisme terkait, dan bukan oleh spons Mungkin sulit untuk membedakan antara mikroorganisme yang

itu sendiri. Baru-baru ini, isolasi, identifikasi dan budidaya berhubungan dengan spons dan yang berasal dari lingkungan

mikrobiota ini telah menjadi tren dalam pencarian senyawa kontaminan, bahkan dengan bantuan teknik molekuler. Selain itu, ada

baru (1). kemungkinan bahwa beberapa galur tidak akan diperoleh dengan

Kebanyakan spons menampung sejumlah besar simbion, yang pendekatan yang bergantung pada kultur biasa karena pertumbuhan

meliputi bakteri, cyanobacteria, alga uniseluler, archaea dan jamur, berlebih oleh mikroorganisme lain. Untuk menghindari masalah ini,

kadang-kadang terdiri dari 40 hingga 60% dari total biomassa (9, dalam pekerjaan ini kami menggunakan kultur sel spons in vitro dan sel

16). Dalam banyak kasus, komunitas ini bersifat spesifik spesies dan tunggal sebagai bahan awal untuk mendapatkan kultur jamur.

tidak bergantung pada galur yang tersedia di lingkungan (17, 42). Pendekatan ini menghilangkan sebagian besar mikroorganisme yang

Dari organisme yang berbeda, bakteri adalah yang paling diselidiki terkait dan sementara mesohyl, dan memungkinkan fokus pada isolasi

secara menyeluruh dan biasanya dilaporkan berpartisipasi dalam dan kultur strain yang secara khusus terkait dengan sel spons.

pertahanan kimia atau proses fisiologis inangnya (32,

35, 37).

Di sisi lain, pengetahuan tentang keanekaragaman dan fungsi METODE

dari cendawan yang berpotensi berasosiasi dengan spons masih

terbatas. Meskipun semakin banyak galur yang diidentifikasi dari spons

sampel spons (17, 18, 22, 40), sedikit bukti telah diterbitkan untuk Sebanyak 12 sampling dilakukan di kawasan Praia Grande (23

mendukung gagasan simbiosis sejati. Contoh terbaik dari HAI49'23.76"S, 45HAI25'01.79”W, São Sebastião, Brasil). Pada setiap

hubungan tersebut diwakili oleh ragi tak dikenal yang kesempatan, empat individu Hymeniacidon heliophila Parker, 1910

ditransmisikan secara vertikal dalam tiga spesies Chondrilla (19). (Halichondrida: Halichondriidae) dan empat dari Haliclona melana

Selain itu, beberapa jamur yang diisolasi dari spons dan substrat Muricy dan Ribeiro, 1999 (Haplosclerida: Chalinidae) dikumpulkan.

laut lainnya diidentifikasi sebagai genus terestrial. Akibatnya, Spesimen individu ditempatkan secara terpisah ke dalam kantong

bahkan perdebatan tentang asal laut yang sebenarnya dari galur plastik dan dibawa ke laboratorium dalam kotak berpendingin es

ini masih terbuka (26, 40). Secara umum, strain jamur fungal (18-20HAIC). Spesies ini telah digunakan

1561
Rozas, EE dkk. Strain jamur dari kultur sel in vitro dari dua spons laut

dalam karya sebelumnya tentang biologi sel spons (5, 6), dan menunjukkan dibudidayakan selama 21 hari kemudian didisosiasi dengan CMFSW+E.

respons yang baik terhadap kondisi kultur. Identifikasi taksonomi dilakukan Suspensi sel dihitung menggunakan ruang Neubauer, dan dilekatkan

oleh MR Custodio, menggunakan metode standar (21). dengan kepadatan rendah pada kaca penutup kaca steril menggunakan

cytocentrifuge (80 xg / 5 menit, 1,5 x 104 sel per titik. sitospin

Kultur sel spons (Primmorphs) 248, FANEM). Coverlips dibiarkan mengering dalam tudung aliran

Disosiasi sel dan pembentukan primamorf mengikuti protokol yang laminar steril selama 3 jam dan kemudian dipindahkan ke pelat

dijelaskan di tempat lain (6). Jaringan spons dibersihkan dari epibion yang enam sumur yang diisi dengan media DY, dengan permukaan sel

lebih besar menggunakan forsep, dipotong menjadi potongan 3 sampai 4 menghadap media overlay. Untuk setiap pelat, satu sumur dengan

mm, dicuci dengan air laut dan diinkubasi dengan CMFSW+E (air laut bebas kaca penutup yang dibuat dengan CMFSW+E digunakan sebagai

kalsium dan magnesium dengan EDTA: 460 mM NaCl, 7). kontrol. Pengamatan kultur dilakukan menggunakan mikroskop

mM NaduaHANYA4, 10 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM EDTA, pH fase kontras terbalik (Eclipse TE300, NIKON), sampai miselia

8.2. Sigma) selama 30 menit dalam pengocok putar kecepatan rendah. NS menjadi terlihat dengan mata telanjang. Strain yang berbeda

supernatan kemudian dibuang, dan fragmen disuspensikan secara morfologi dikumpulkan dan dipindahkan ke agar DY untuk

kembali dalam larutan CMFSW+E segar. Setelah pengocokan terus memverifikasi kemurnian kultur, dan kemudian dibudidayakan

menerus selama 45 menit, supernatan dikumpulkan dan disaring seperti dijelaskan di atas. Untuk membedakan antara strain yang

melalui mesh 40 m. Sel-sel dipelet dengan sentrifugasi pada 250 terkait dengan sel dan yang secara kebetulan ada di permukaan

xg / 10 menit dan disuspensikan kembali dalam air laut alami yang dan saluran spons, kultur jamur dibuat dari seluruh jaringan spons.

disaring steril (0,22 m) dari tempat pengumpulan yang sama, Fragmen spons dicuci dengan CMFSW+E steril (5 menit) untuk

dilengkapi dengan antibiotik (kanamisin 100 mg/L, gentamisin 50 melepaskan sel-sel perifer dan akhirnya jamur sementara,

mg/L dan tetrasiklin 10 mg/L L, Calbiochem) dan phenol red (16 mg/ dikompresi dengan lembut dan bahan yang dihasilkan

L, Sigma). Media ini digunakan untuk pemeliharaan primmorph. dikumpulkan dalam labu dengan air laut steril. Kemudian, 100 l

Pada minggu pertama, itu diperbarui setiap hari dan pada minggu- alikuot suspensi ini disebarluaskan dalam DY dan isolat dimurnikan

minggu berikutnya, masing-masing tiga hari. dengan seleksi berturut-turut dan dibudidayakan mengikuti

prosedur yang dijelaskan di atas.

Isolasi dan kultur strain jamur

Primmorf diamati setiap hari pada mikroskop terbalik, dan Ekstraksi DNA dan amplifikasi reaksi berantai polimerase (PCR)

hifa jamur yang muncul di permukaan diambil dan diinkubasi

dalam tabung dengan media DY (Dextrose 1% dan Yeast DNA diisolasi dari sampel segar (25 mg) miselia dari kultur
jamur menggunakan PureLinkTM
Nitrogen base 1% (Fluka) dalam air laut alami). Setelah 24 jam,

100 l setiap suspensi disebarluaskan dalam agar DY (media DY Kit DNA genom (Invitrogen). DNA yang diekstraksi dianalisis

dengan agar 2%) untuk memverifikasi kemurnian kultur. Jamur dalam gel agarosa-Tris-borat-EDTA 1% untuk mengetahui

dipilih secara hati-hati menurut karakteristik morfologi (7, 13), kualitas dan jumlah DNA yang diperoleh. Amplifikasi gen 18S

dipindahkan ke labu Erlenmeyer 125 ml dengan 60 ml media rRNA dilakukan menggunakan primer spesifik EF3 (5'-

DY dan diinkubasi pada suhu 20HAIC. Setelah 15 hari, kultur TCCTCTAAATGACCCAAGTTTG-3'), EF4 (5'GGAAGGG [G/A]

diambil sampelnya untuk ekstraksi DNA dan identifikasi. TGTATTATTAG-3') dan Fung5 (5'GTAAAAGTCCTGGTTCCCC-3')

(32 ). Satu mikroliter dari setiap sampel DNA (100 ng)

Untuk mendapatkan jamur terkait sel, primmorph digunakan untuk amplifikasi PCR.

1562
Rozas, EE dkk. Strain jamur dari kultur sel in vitro dari dua spons laut

Set primer EF4/EF3 dan EF4/Fung5 digunakan untuk langsung
amplifikasi urutan 18S rDNA dari DNA jamur yang diekstraksi.
Campuran PCR (50 l) untuk kedua set terdiri dari 1x PCR
penyangga (Invitrogen), 2 mMMgCldua, 0,2 mM campuran dNTP, 50 ng
masing-masing primer dan 0,3 l Platinum Taq Polymerase (5 u/µl,
Invitrogen). Pola thermocycling berikut digunakan: 94HAIC selama 3
menit (1 siklus); 94HAIC selama 1 menit; 48HAIC adalah 1 menit; 72HAIC
selama 3 menit (35 siklus); dan 72HAIC selama 10 menit (1 siklus). Produk
PCR dipisahkan pada gel Agarose-Tris-borat-EDTA 1%.
Urutan parsial gen 18S rRNA jamur
Produk PCR dimurnikan dengan DNA PCR Illustra GFX dan
Kit Pemurnian Gel Band (GE Healthcare) dan digunakan dalam
reaksi pengurutan siklus dengan kit terminator DYENAMIC ET
(GE Healthcare). Fragmen 0,5 Kb diperoleh dari
setiap strain jamur, sesuai dengan wilayah yang diperkuat oleh
set primer EF4/EF3 diurutkan dengan primer EF4. Reaksi
sekuensing dianalisis dengan elektroforesis kapiler pada
platform sekuensing MEGABACE 1000 (GE Healthcare). Urutan
konsensus diperoleh dengan menggunakan Program Perakitan
Urutan CAP3 (10). Urutan kemudian diedit secara manual dan
dianalisis dengan pencarian BLAST di National Center for
Biotechnology Information (NCBI, diakses pada Juli 2010).
Penjajaran urutan fragmen 0,5 Kb dan pohon filogenetik
disiapkan dengan POY v4.1.2 (39), menggunakan 60
pengulangan penambahan urutan acak dan pertukaran cabang
TBR menggunakan kriteria hemat. Urutan dari jamur anamorfik
Acremonium cellulolyticus (nomor aksesi BA474750) digunakan
sebagai outgroup. Semua urutan disimpan di GenBank,

Tabel 1. Strain jamur diisolasi dan dibudidayakan dari seluruh jaringan, sel tunggal dan primmorph Hymeniacidon heliophila (Hy)
dan Haliclona melana (Ha). Nomor aksesi (AN) dan skor (%) diberikan. Urutan terdekat cocok dengan BLAST teratas
rekor skor (diakses pada Juli 2010).
Hymeniacidon heliophila
seluruh tisu Pertandingan Urutan Terdekat SEBUAH %
Hai 1 (FJ477281) Penicillium waksmanii MMA12 (HM231102) 100
Hai 2 (FJ477282) Penicillium sp. HB-92 (AB521044) 99
Hy3 (FJ477279) Penicillium waksmanii MMA12 (HM231102) 99
Hy4 (FJ477283) Penicillium sp. HB-92 (AB521044) 97
Hy5 (FJ477284) Penisilium sp. HB-92 (AB521044) 99
Hai 6 (FJ477293) Penisilium sp. HB-92 (AB521044) 99
Hai 7 (FJ477286) Penisilium sp. HB-92 (AB521044) 98
Hai 8 (FJ477278) Penisilium sp. ASR-151 (GU973852) 98
Hai 9 (FJ477287) Penicillium sp. HB-92 (AB521044) 96

sel tunggal
Hai aku (FJ477273) Kontaminan jamur yang tidak (EF053580) 94
Hai II (FJ477272) dikultur Cryptosphaeria sp. (FJ430577) 98
Hai III (FJ477274) MYA-4414 Paraphaeosphaeria sp. (GQ253350) 98
Hai IV (FJ477276) B19 Ascomycota sp. Mo19 (EU887770) 98
HyV (FJ477277) Cryptosphaeria sp. MYA-4414 (FJ430577) 97

Haliklon Melana
seluruh tisu
ha 1 (FJ477280) Penisilium sp. ASR-302 (GU973859) 97
Ha 2 (FJ477292) Penicillium sp. HB-92 (AB521044) 99
Ha 3 (FJ477291) Penisilium sp. HB-92 (AB521044) 96
Hah 4 (FJ477288) Penisilium sp. HB-92 (AB521044) 99
Hah 5 (FJ477289) Emericella nidulans (AB008403) 97
ha 6 (FJ477290) Penisilium sp. HB-92 (AB521044) 99

sel tunggal
Ha aku (FJ477269) Cladosporium cladosporioides (AB521051) 99
Ha II (FJ477267) Cladosporium cladosporioides (AB521051) 98
Ha III (FJ477268) Cladosporium cladosporioides (AB521051) 99
Ha IV (FJ477270) Xylaria polymorpha (AB274816) 97
Ha V (FJ477266) Jamur Tidak Berbudaya FAS 62 (GU072561) 98

Primmorf 1563
Ha VI (FJ477271) Escovopsis aspergilloides (AY172598) 97
Ha VII (FJ477275) Penicillium sp. YW01 (GU944770) 99
Rozas, EE dkk. Strain jamur dari kultur sel in vitro dari dua spons laut

HASIL sudah seperti miselia kecil yang tumpang tindih atau dekat

dengan sel spons. Ketika diinkubasi dalam media cair, strain

Isolasi dan budidaya jamur jamur ini terdeteksi 15 hari setelah persiapan cytospins (36 hari

Lima strain diperoleh dari sel tunggal (c ytospins) dari setelah awal kultur sel spons), mencapai ukuran maksimum

setiap spons (Tabel 1). Hifa dari dua jamur ini, Ha IV dan Ha V dalam lima hari tambahan. Namun, strain secara nyata

(Gbr. 1a-f), terdeteksi pada tahap awal, selalu berasosiasi atau mengurangi kecepatan pertumbuhan setelah tiga subkultur

dekat dengan inti sel spons. Keduanya muncul sebagai berturut-turut, dan ukuran maksimum dicapai hanya setelah 28

kelompok kecil bulat, struktur terang dari mana miselia dewasa hari.

berasal (Gbr. 1a, e). Dalam Ha IV, sejumlah besar bahan hialin Menggunakan primmorph, dua strain diperoleh dari H.

tidak larut yang tidak diketahui sifatnya dapat diamati di sekitar melana, tetapi tidak ada dari H. heliophila (Tabel 1). Jamur yang

hifa bahkan pada tahap awal (Gbr. 1b, c). Dalam strain ini, hifa berasosiasi dengan primmorph selalu muncul sebagai hifa kecil

selalu tertanam dalam zat ini, di mana beberapa kristal yang menempel pada permukaan agregat setelah 45 hari

terbentuk pada tahap selanjutnya (Gbr. 1d). Di Ha V, hifa dalam kultur. Dengan menggunakan preparat jaringan utuh,

awalnya tumbuh mengikuti margin sel inang (Gbr. 1e) dan sembilan galur yang berbeda secara morfologis diisolasi dari H.

kemudian membentuk miselium tiga dimensi bercabang (Gbr. heliophila, meskipun dua (Hy 1 dan Hy 7) tidak dapat

1f). Tahap awal strain lain seperti itu tidak terdeteksi, dan dibudidayakan hingga pertemuan. Dari seluruh jaringan

mereka diamati preparat H. melana, enam galur diisolasi dan dibudidayakan.

Gambar 1. Pertumbuhan strain Ha IV

dan Ha V dari sel H. melana dalam
kultur. (a, b, c) Hifa Ha IV tumbuh dari
sel spons tunggal yang direndam
dalam media cair DY (b dan c: bidang
yang sama). Pengendapan bahan
hialin tidak larut yang belum
diketahui sifatnya sudah terlihat sejak
tahap awal pertumbuhan (n: nuklei).
( d ) Miselium Ha IV direndam dalam
media cair DY, 24 jam setelah strain
mulai tumbuh dari sel spons. Deposit
besar bahan hialin mengelilingi hifa
dan termasuk kristal (panah). (e) Hifa
Ha IV (panah) tumbuh dari sel spons
tunggal. (f) Ha IV miselium, 24 jam
setelah galur mulai tumbuh dari sel
spons.

1564
Rozas, EE dkk. Strain jamur dari kultur sel in vitro dari dua spons laut

Identifikasi jamur VII) ditemukan pada H. melana (Penicillium sp. YW01. GU944770).

Identifikasi jamur tentatif berdasarkan database NCBI yang Pada kedua spons, semua galur yang diperoleh dari bahan turunan

paling cocok dan nomor aksesi untuk galur yang diperoleh dalam sel berbeda dari galur yang diisolasi dari preparasi jaringan utuh

pekerjaan ini dirangkum dalam Tabel 1. Semua jamur yang diisolasi dari individu yang sama. Selain itu, strain turunan sel yang berbeda

dari seluruh jaringan preparat dari kedua spons termasuk dalam diperoleh dari masing-masing spesies spons. Pohon filogenetik

genus Penicillium, dengan satu-satunya pengecualian dari satu yang disimpulkan dengan sekuens 18S rRNA parsial menunjukkan

galur terkait dengan Emericella nidulans (AB008403) di H. melana. bahwa semua galur turunan sel terkait (Gbr. 4b).

Sebaliknya, genus ini kurang terwakili dalam bahan yang diperoleh 2), kecuali Ha VII (Penicillium sp. YW01).

dari kultur sel, dengan hanya satu strain (Ha

Gambar 2. Pohon filogenetik yang menggambarkan hubungan antar strain yang diisolasi dari seluruh jaringan dan preparat kultur sel dari

H. heliophila (Hy) dan H. melana (Ha). Urutan kecocokan terbaik GenBank diberikan (tanda bintang: galur yang diperoleh dari sumber laut).

1565
Rozas, EE dkk. Strain jamur dari kultur sel in vitro dari dua spons laut

DISKUSI strain terkait dengan Penicillium, yang diwakili dalam kultur yang

diturunkan sel hanya dengan satu strain (Ha VII: Penicillium sp.

Di antara semua Filum laut, Porifera dianggap sebagai YW01). Dominasi ini tercermin dalam analisis filogenetik (Gbr. 2),

salah satu sumber terpenting jamur penghasil metabolit (26, yang mengelompokkan semua strain jaringan secara keseluruhan

36), dan dalam dekade terakhir kami semakin menjadi target berlawanan dengan garis turunan sel.

dalam pencarian strain baru dengan potensi bioteknologi (14, Yang menarik adalah kenyataan bahwa dua strain (Ha IV dan

27). Pendekatan yang berbeda telah digunakan untuk mengisolasi dan Ha V) diamati terhubung langsung ke sel spons tunggal, muncul 15

mengolah mikroorganisme ini, kebanyakan menggunakan homogenat hari setelah sitospin ditempatkan di media DY dan 36 hari setelah

utuh atau sampel jaringan yang dibedah (misalnya 12, 22, 26, 41). Studi kultur spons. Ada kemungkinan bahwa jamur ini diperoleh dari

semacam itu telah memperoleh sejumlah besar galur yang berbeda dan lingkungan laut asli atau menempel pada permukaan sel spons

meningkatkan pengetahuan tentang keragaman jamur yang selama manipulasi. Namun, ketika diisolasi dari sitospin dan

berasosiasi dengan spons. Namun, rincian tentang mekanisme dan diinokulasi dalam media DY segar, mereka mencapai ukuran

interaksi dengan inangnya masih langka (17), dan kemungkinan maksimum hanya dalam lima hari. Hal ini menunjukkan bahwa

beberapa galur terlewatkan oleh pertumbuhan berlebih atau gangguan jamur memang tertutup dalam sel spons, mirip dengan apa yang

kompetitif oleh spesies lain. Dengan menggunakan kultur sel spons in telah diamati di Chondrilla (18), dan selang waktu pertumbuhan

vitro dan sel tunggal (sitospin), fokus pada penelitian ini adalah untuk awal adalah karena latency dari jamur tertutup. Kondisi ini akan

memilih hanya strain yang secara khusus terkait dengan spons. terganggu setelah kematian sel spons, memaksa jamur untuk

tumbuh menuju media nutrisi. Lebih-lebih lagi, setelah tiga

Dari semua galur jamur yang diisolasi dari H. heliophila dan H. subkultur berturut-turut, galur tersebut mengurangi kecepatan

melana, hanya dua yang memiliki urutan kecocokan terbaik yang pertumbuhannya secara nyata. Hal ini menunjukkan kurangnya

serupa dengan jamur yang telah diperoleh dari sumber laut (lihat Tabel komponen diduga dipasok oleh sel spons - faktor pertumbuhan

1). Jadi Hy IV terkait dengan strain Ascomycota yang dikumpulkan di atau nutrisi - dan menunjukkan ketergantungan fakultatif. Proses

ventilasi termal laut dalam (2), dan Ha V mirip dengan jamur laut yang serupa dapat menyebabkan munculnya akhir (45 hari) dari dua

tidak dibudidayakan yang diisolasi dari sedimen Laut Arab (Jebaraj et al. galur yang diperoleh dari primmorph H. melana. Primmorf adalah

tidak dipublikasikan). Untuk semua galur lainnya, urutan kecocokan agregat tiga dimensi yang dikelilingi oleh pinacoderm kontinu, di

terbaik menunjukkan spesies terestrial yang terkenal, sebagian besar mana sel sepenuhnya mampu melakukan proses fisiologis seperti

termasuk dalam genus Penicillium dan Cladosporium. Namun, dalam pengenalan alogenik (5, 43) dan sekresi spikula (3). Tergantung

beberapa tahun terakhir bukti telah terakumulasi yang menunjukkan pada spesiesnya, mereka dapat disimpan di air laut biasa tanpa

keberadaan jamur terestrial ini (dan lainnya) di mana-mana di nutrisi tambahan selama beberapa hari atau bahkan berbulan-

lingkungan laut (17, 26, 30). bulan, setelah itu mereka merosot dan mati (33, 38). Setelah 45 hari

Menariknya, tak satu pun dari galur yang diisolasi dari dalam kultur, primmorph H. melana telah memulai proses

kultur sel in vitro ditemukan di seluruh jaringan dari hewan penurunan ini, dan tidak lagi mempertahankan aspek awal dari

yang sama. Selain itu, komunitas jamur asal seluler masing- massa sel yang bulat dan padat dengan permukaan yang halus.

masing spesies spons berbeda. Sebaliknya, galur yang Ada kemungkinan bahwa pada tahap ini, jamur tertutup dilepaskan

diperoleh dari seluruh persiapan jaringan H. heliophila dan H. dari dormansi, dengan cara yang sama seperti yang diamati pada

melana tidak spesifik spesies, menunjukkan profil mikroba sel-sel terisolasi.

yang serupa. Dalam hal ini, jamur yang dominan

1566
Rozas, EE dkk.
Kemungkinan jamur tersebut diterima
kehidupan intraseluler melalui endositosis tergantung
pada adaptasi patogen (28). Hilangnya virulensi dan
produksi zat anti-fagositosis akan memungkinkan
awalnya parasit intraseluler menjadi endosimbion (4,
8). Sebagai alternatif, banyak jenis sel spons adalah fagosit (29),
dan spora jamur dapat masuk ke dalam sel melalui proses ini
tanpa mengganggu membran sel. Dalam pengertian ini,
infestasi biasa yang diikuti oleh fagositosis akan menjelaskan
mengapa jamur hadir di dalam sel dan tidak di seluruh
jaringan. Namun, itu tidak akan menjelaskan mengapa strain
ini tidak difagosit dan dihilangkan selama kultur sel spons in
vitro (21 hari). Ini berarti hilangnya sebagian kemampuan
untuk mengenali komponen non-diri, yang tampaknya tidak
mungkin. Dengan demikian, hasil menunjukkan adanya
setidaknya dua spesies intraseluler: Ha VI dan Ha VII, dari H.
melana, dan spesifisitas strain lain yang diisolasi dari sel
tunggal dan primmorph.
Identifikasi yang diperoleh dengan urutan kecocokan terbaik di
GenBank bersifat sementara, dan hanya dapat menunjukkan afinitas dari
galur jamur yang diperoleh. Dari semua galur yang diperoleh dalam
pekerjaan ini, sembilan dari H. heliophila dan tujuh dari H. melana
menunjukkan identitas urutan yang sama atau kurang dari 98%
dibandingkan dengan yang tersedia di GenBank, menunjukkan beberapa
kemungkinan spesies baru. Selain itu, lima dari strain identitas rendah dari H.
heliophila dan empat dari H. melana diperoleh langsung dari sel spons dalam
kultur. Pada titik ini, data tambahan, seperti
menghubungkan secara morfologi pengamatan dengan NS lagi
analisis molekuler yang komprehensif diperlukan untuk memastikan
identifikasi yang benar. Meskipun demikian, ini adalah laporan pertama
dari strain jamur yang diisolasi menggunakan kultur sel spons in vitro,
dan orang dapat membayangkan pendekatan serupa dapat digunakan
untuk mikroorganisme lain seperti bakteri. Data kami menunjukkan
bahwa primmorph dan bahkan sel tunggal dapat digunakan sebagai
bahan awal untuk kultur, yang memungkinkan pengamatan terperinci
tentang kemunculan dan pertumbuhan galur tertentu dan pemilihan
galur yang tidak dapat diperoleh dengan teknik biasa.
Strain jamur dari kultur sel in vitro dari dua spons laut
saya UCAPAN TERIMA KASIH
NS
Pekerjaan ini didanai oleh Dewan Nasional
NS
Perkembangan Ilmiah dan Teknologi dan NS
NS
Bundesministerium für Bildung und Forschung (Kerjasama
JermanBrasil dalam Ilmu Kelautan - CNPq 590004/2005-0; BMBF
03F0451). Penulis berterima kasih kepada Dr. Fernando PL
Marques (Departemen Zoologi. IB/USP) atas bantuannya dalam
analisis filogenetik.
REFERENSI
1. Tumpul, JW; Polisi, BR; Hu, WP; Munro, MHG; Northcote, PT;
Prinsep, MR (2009). Hasil laut alami. Nat. Rep.26, 170-
244.
dua. Burgaud, G.; Le Calvez, Th.; Arzur, D.; Vandenkoornhuyse, Ph.; Barbier,
G. (2009). Keanekaragaman jamur berfilamen laut yang dapat
dibudidayakan dari ventilasi hidrotermal laut dalam. Mengepung.
3. Mikrobiol. 11, 1588-1600. Cao, X.; Fu, W.; Yu, X.; Zhang, W. (2007).
Dinamika produksi spikula pada spons laut Hymeniacidon perlevis
selama kultur sel in vitro dan perkembangan musiman di lapangan. Sel.
Tis. Res.329, 595-608.
4. Corsaro, D.; Venditti, D.; Padula, M.; Valassina, M. (1999). Kehidupan
Intraseluler. Kritis. Pdt. Mikrobiol. 25, 39-79.
5. Penjaga, MR; Haji, E.; Muricy, G. (2002). Studi in vivo tentang pembentukan
mikrosklera pada bunga karang dari genus Mycale (Demospongiae,
Poecilosclerida). Zoomorfologi 121, 203-211.
6. Penjaga, MR; Haji, E.; Muricy, G. (2004). Dinamika seluler dari
reaksi alogenik in vitro Hymeniacidon heliophila (Demospongiae:
Halichondrida). Maret Biol. 144, 999-1010.
7. Dugan, FM (2006). Identifikasi jamur. Pers Masyarakat Fitopatologi
Amerika, Saint Paul.
8. Gobel, W.; Kotor, R. (2001). Strategi kelangsungan hidup intraseluler
prokariota mutualistik dan parasit. TREN Mikrobiol. 9, 267-274.
9. Hentschel, U.; Usher, KM; Taylor, MW (2006). Spons laut sebagai
fermentor mikroba. Mikrobiol FEMS. Ekologi 55, 167-177.
10. Hooper, JNA; van Soest, RWM (2002). Systema Porifera: panduan
untuk klasifikasi spons. Penerbit Kluwer Academic/Plenum, New
York.
11. Huang, X.; Madan, A. (1999). CAP3, Program perakitan urutan DNA.
Res. Genom 9, 868-877.
12. Kennedy, J.; Coding, C.; Jones, B.; Dobson, A.; Marchesi, J. (2008).
Keanekaragaman mikroba yang terkait dengan spons laut, Haliclona
simulans, diisolasi dari perairan Irlandia dan identifikasi poliketida
1567
Rozas, EE dkk.
gen sintase dari metagenom spons. Mengepung. Mikrobiol. 10,
1888-1902.
13. Kohlmeyer, J. (1984). jamur laut tropis. Mar.Ekol. 5, 329-378.
14. Konig, G.; Kehraus, S.; Seibert, S.; Abdel-Lateff, A.; Muller, D. (2006).
Produk alami dari organisme laut dan mikroba terkait.
ChemBioChem 7, 229-238.
15. Lang, G.; Wiese, J.; Schmaljohann. R.; Imhoff, J. (2007). pentaenes baru
dari jamur laut yang diturunkan dari spons Penicillium rugulosum:
penentuan struktur dan studi biosintetik. Tetrahedron 63, 11844-11849.
16. Lee, Y.; Lee, J.; Lee, H. (2001). Simbiosis mikroba pada spons laut.
J. Mikrobiol. 39, 254-264.
17. Li, Q.; Wang, G. (2009). Keanekaragaman isolat jamur dari tiga spons
laut Hawaii. Mikrobiol. Res.164, 233-241.
18. Liu, WC; Li, CQ; Zhu, P.; Yang, JL; Cheng, KD (2009). Keragaman
filogenetik jamur budaya yang terkait dengan dua spons laut:
Haliclona simulans dan Gelliodes carnosa, dikumpulkan dari
perairan pesisir Pulau Hainan di Laut Cina Selatan. 42
(1), 1-15.
19. Maldonado, M.; Cortadella, N.; Trila, MI; Rutzler, K. (2005). Ragi
endosimbiotik ditularkan secara maternal dalam spons laut. Biol.
Banteng. 209, 94-106.
20. Muller, WEG (1998). Asal Metazoa: spons sebagai fosil hidup.
Naturwissenschaften 85, 11-25.
21. Muricy, G.; Hajdu, E. (2006) Porifera Brasilis: Panduan identifikasi untuk
spons laut yang paling umum di Brasil Tenggara. Museum Nasional.
Seri Buku 17. Rio de Janeiro.
22. Perdamaian, Z.; Komon-Zelazowska, M.; Druzhinin, IS; Aveskamp, MM;
Shnaderman, A.; tawas, Y.; Karmeli, S.; Ilan, M.; Yarden, O. (2010).
Keanekaragaman dan sifat antijamur potensial dari jamur yang terkait
dengan spons Mediterania. Penyelam Jamur. 42, 17-26.
23. Pfannkuchen, M.; Fritz, GB; Schlesinger, S.; Bayer, K.; Brumer, F.
(2009). Aktivitas pemompaan in situ dari spons Aplysina aerophoba,
Nardo 1886. J. Exp. Mar. Biol. Ekologi 369, 65-71.
24. Tumpukan, AJ; Patterson, M.; Witman, J. (1996). Penggembalaan in situ pada plankton
<10 mikron oleh spons boreal Mycale lingua. Mar.Ekol. Program Menjadi.
141, 95-102.
25. Tumpukan, AJ; Muda, CM (2006). Makanan alami spons hexactinellid:
kopling bentik-pelagis dalam jaring makanan mikroba laut dalam.
Resolusi Laut Dalam 53, 1148-1156.
26. Proksch, P.; Ebel, R.; Edrada, R.; Riebe, F.; Liu, H.; Diesel, A.; Bayer,
M.; Li, X.; Lin, WH; Grebenyuk, V.; Muller, WEG; Draeger, S.;
Zuccaro, A.; Schulz, B. (2008). Jamur terkait spons dan senyawa
bioaktifnya: kasus Suberites. Bot. 51 Maret 209-218.
27. Raghukumar, C. (2008). Bioteknologi jamur laut: perspektif ekologis.
Penyelam Jamur. 31, 19-35.
28. Selvin, J.; Ninawe, AS, Kiran, GS, Lipton, AP (2010). Interaksi
sponsmikroba: Implikasi ekologis dan bioprospeksi
Semua isi jurnal, kecuali dinyatakan lain, dilisensikan di bawah a Creative Commons
Strain jamur dari kultur sel in vitro dari dua spons laut
jalan. Kritis. Pdt. Mikrobiol. 36, 82-90.
29. Simpson, TL (1984). Biologi sel spons. Springer-Verlag, New York.
30. Singh, P.; Raghukumar, C.; Verma, V.; Souche, Y. (2010). Keragaman filogenetik
jamur budaya dari sedimen laut dalam Cekungan India Tengah dan
karakteristik pertumbuhannya. Penyelam Jamur. 40, 89-102.
31. Sipkema, D.; Franssen, MCR; Osinga, R.; Tramper, J.; Wiffes, HR
(2005). Spons laut sebagai apotek. Mar. Bioteknologi. 7, 142-162.
32. Sipkema, D.; Holmes, B.; Nicols, SA; Blanch, HW (2009). Karakterisasi
biologis Haliclone (?gellius) sp.: spons dan mikroorganisme terkait.
Mikrob. Ekologi 58, 903-920.
33. Sipkema, D.; Van Wielink, R.; Van Lammeren, AAM; Tramper, J.;
Osinga, R.; Wiffels, RH (2003). Primmorf dari tujuh spons laut:
pembentukan dan struktur. J.Biotek. 100, 127-139.
34. Smith, E.; Leeflang, P.; Glandorf, B.; Van Elsas, J.; Wernars, K. (1999). Analisis
keragaman jamur di rizosfer gandum dengan sekuensing kloning gen yang
diperkuat PCR yang mengkode 18s rRNA dan elektroforesis gel gradien
suhu. aplikasi Mengepung. Mikrobiol. 65, 2614-2621.
35. Thakur, NL; Anil, AC; Muller, WEG (2004). Epibakteri yang dapat dikultur dari
spons laut Ircinia fusca: variasi temporal dan kemungkinan perannya dalam
pertahanan epibakteri inang. air. Mikrob. Ekologi 37, 295-
304.
36. Thomas, TRA; Kavlekar, DP; LokaBharathi, PA (2010). Obat laut dari
asosiasi spons-mikroba: ulasan. Mar. Narkoba 8, 1417-
1468.
37. Vacelet, J.; Duport, E. (2004). Penangkapan mangsa dan pencernaan pada
spons karnivora Asbestopluma hypogea (Porifera: Demospongiae).
Zoomorfologi 123, 179-190.
38. Valisano, L.; Bavestrello, G.; Giovine, M.; Cerrano, C. (2006). Dinamika
pembentukan primmorph: penyaringan di antara spons
Mediterania. Maret Biol. 149, 1037-1046.
39. Varon, A.; Le Sy, V.; Wheeler, WC (2010). POY versi 4, analisis
filogenetik menggunakan homologi dinamis. Kladistik 26 (1), 72-
85.
40. Wang, G. (2006). Keanekaragaman dan potensi bioteknologi dari konsorsium
mikroba terkait spons. J.Ind. Mikrobiol. Bioteknologi. 33, 545-
551.
41. Wang, G.; Li, Q.; Zhu, P. (2008). Keragaman filogenetik jamur budaya
yang terkait dengan spons Hawaii Suberites zeteki dan Gelliodes
fibrosa. Antonie Leeuwenhoek 93, 163-174.
42. Webster, N.; Negri, A.; Munro, M.; Battershill, CN (2004). Beragam
komunitas mikroba menghuni spons Antartika. Mengepung. Mikrobiol.
6, 288-300.
43. Wiens, M.; Perovic-Ottstadt, S.; Muller, IM; Muller, WEG (2004).
Domuncula suberites dikendalikan oleh ekspresi diferensial gen
apoptosis. Imunogenetik 56, 597-610.
1568