Minda Azhar-eLaporan Penelitian 2015
Minda Azhar-eLaporan Penelitian 2015
LAPORAN AKHIR
PENELITIAN PERCEPATAN PROFESOR
iii
ABSTRAK
Bakteri pendegradasi inulin dari rizosfer umbi dahlia merupakan sumber potensial
gen dan enzim inulinase yang digunakan untuk pembuatan fruktosa dari inulin. Isolat
bakteri pendegradasi inulin telah ditemukan dari rizosfer umbi tanaman dahlia yang
tumbuh di Padang Panjang tetapi belum diidentifikasi secara molekuler. Tujuan utama
penelitian adalah ditemukan nama genus dan spesies isolat bakteri pendegradasi inulin
melalui identifikasi molekuler gen 16S rRNA. Metoda penelitian yang digunakan untuk
mengidentifikasi isolat bakteri pendegradasi inulin secara molekuler adalah dengan
mengkarakterisasi gen 16S rRNA melalui langkah mengisolasi DNA genom bakteri,
mengamplifikasi gen 16S rRNA dengan metoda PCR dan sekuesing gen 16S rRNA
menggunakan metoda dideoxy-Sanger. Data sekuens gen 16S rRNA bakteri dianalisis
dengan program BLASTn pada National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Berdasarkan identifikasi secara molekuler melalui sekuens parsial gen 16S rRNA, isolat
bakteri RZ-01 memiliki kekerabatan terdekat dengan kelompok genus Klebsiella dan
spesies Klebsiella pneumoniae.
.
Key words : inulin degrading bacteria, inulinase, 16S rRNA gene, inulin, fructose
iv
BAB I
PENDAHULUAN
2
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Inulin
Inulin adalah polimer alami kelompok karbohidrat dengan monomer fruktosa.
Antara monomer fruktosa pada inulin dihubungkan oleh ikatan (21) residu -D-
fructofuranosyl (Kulminskaya et al., 2003). Tiap ujung pereduksi untai polimer inulin
dapat hadir glukosa (Franck, 2003). Dengan demikian, hidrolisis sempurna inulin
menghasilkan fruktosa dan sedikit glukosa, jika diasumsikan tiap ujung molekul inulin
terikat satu residu glukosa.
Inulin terdapat pada umbi tanaman dahlia, akar chicory, dan umbi Jerusalem
artichoke dalam jumlah besar (Franck, 2003; Marchessault et al., 1980). Tanaman
chicory, Jerusalem artichoke tumbuh baik di Amerika Utara, sedangkan tanaman dahlia
dapat tumbuh baik di dataran tinggi Indonesia. Inulin sukar larut dalam air dingin dan
pelarut organik, sebaliknya inulin mudah larut dalam air panas. Kelarutan inulin dalam
air tergantung pada cara bagaimana inulin tersebut direkristalisasi. Inulin yang
direkristalisasi dengan etanol lebih besar kelarutannya dibandingkan dengan inulin yang
direkristalisasi dengan air (Phelps, 1965).
6
2.3 Bakteri Pendegradasi Inulin
Sekarang telah diketahui bahwa bakteri pendegradasi inulin mengekpresikan
inulinase dengan tipe exo- atau endo-. Beberapa bakteri pendegradasi inulin mampu
tumbuh pada suhu tinggi. Allais et al. telah mengisolasi dan mengkarakterisasi strain
bakteri yang mempunyai aktivitas inulinase dari sampel tanah yang ternyata
diidentifikasi sebagai Flavobacterium multivorum (Allais et al., 1986). Bacillus
polymyxa merupakan bakteri mesofilik dari tanah yang mengekspresikan exoinulinase
optimal aktif pada suhu 35ºC dan pH 7 (Kwon et al., 2003). Paenbacillus polymyxa ZJ-
9 diisolasi dari sampel tanah. Bakteri ini mengeskpresikan exoinulinase yang aktiv
maksimum pada suhu 25ºC, pH 6 (Gao et al., 2014).
Bakteri termofilik pertama, Geobacillus stearothermophilis KP1289 yang gen
pengkode exoinulinase telah diisolasi dari DNA genomnya dilaporkan pada tahun 2003
(Tsujimoto et al., 2003). Gen inuA (exoinulinase) bakteri ini terdiri dari 1482 pb yang
mengkode protein dengan 493 residu asam amino. Enzim ini aktif antara suhu 30C dan
75C dengan suhu optimum 60C. Inulinase termostabil dari Actinomycete nicardiopsis
sp.DN-K15 yang diisolasi dari sedimen laut Jiaozhou Bay China merupakan alkali
toleran yang mempunyai aktivitas optimum pada suhu 60ºC, pH 8 dan mempunyai
range aktivitas yang baik dari pH 5-11 (Lu et al., 2013). Bakteri pendegradasi inulin
dari sumber air panas Bukik Kili Solok Sumatera Barat diindentifikasi secara molekuler
melalui gen 16S rRNA merupakan Bacillus licheniformis (Azhar et al., 2013),
sedangkan dari sumber air panas Padang Balimbiang di Solok diidentifikasi sebagai
Bacillus subtilis (Azhar et al, 2011). Beberapa bakteri potensial pendegradasi inulin
untuk pembuatan fruktosa telah dieksplorasi dari sumber air panas: Batu Bajanjang,
Bukik Gadang dan Sapan Maluluang, serta rizosfer umbi dahlia (Azhar, et al, 2014).
Sampai saat ini, bakteri pendegradasi inulin yang mengekspresikan exoinulinase
yang gennya telah ditemukan adalah Geobacillus stearothermophilis, Paenibacillus
polymyxa, Pseudomonas mucidolens, Vibrio coralliilyticus ATCC BAA-450, Bacillus
subtilis, Bacillus sp snu-7 dan Paenibacillus sp. Aloe-11, Bacillus licheniformis,
Burkhoderia sp, Arthobacter siccitolerans (http://www.ncbi.nlm.gov/, pada 26 Maret
2015). Bakteri pendegradasi inulin yang mengekspresikan endoinulinase yang gennya
telah ditemukan adalah Arthrobacter sp. S37, Rhodopirellula baltica SH 1,
Paenibacillus mucilaginosus KNP414, Paennibacillus elgii B69, Pseudomonas
mucidolens (http://www.ncbi. nlm.gov/, pada 26 Maret 2015).
7
2.4 Studi Pendahuluan yang Telah Dilakukan
Penelitian aktivitas inulinase yang diekstrak dari umbi dahlia telah diteliti dengan
judul “Aktivitas enzim inulinase umbi dahlia hasil fraksinasi dengan etanol” (Dana
HED-JICA, 2006) dan telah dipublikasi pada Jurnal Sainsteks (terakreditasi) Vol.x,
No.1, 2007. Inulinase tumbuhan sangat sulit diisolasi dalam jumlah cukup. Oleh sebab
itu, mikroorganisme adalah pilihan untuk mengisolasi enzim dalam jumlah banyak.
Enzim ini dapat diperoleh dari bakteri pendegradasi inulin. Bakteri termofilik
pendegradasi inulin Bacillus licheniformis UBCT-007 dan Bacillus subtilis UBCT-030
yang masing-masing telah diskrining dari sumber air panas Bukik Kili dan Padang
Balimbiang di Solok (Azhar et al, 2013; Azhar dkk, 2011). Aktivitas enzim
ekstraseluler pada substrat inulin kecil. Gen pengkode enzim pendegradasi inulin yang
ditemukan pada B. licheniformis UBCT-007 adalah gen pengkode levanase (Azhar,
2013). Beberapa bakteri potensial pendegradasi inulin untuk pembuatan fruktosa telah
dieksplorasi dan diskrining dari sumber air panas Batu Bajanjang, Bukik Gadang dan
Sapan Maluluang Solok dan dari rizosfer umbi dahlia danau atas dan danau bawah
(Azhar, et al, 2014). Bakteri pendegradasi inulin juga telah diisolasi dari rizosfer umbi
tanaman dahlia yang tumbuh di Padang Panjang.
9
BAB 4
METODE PENELITIAN
10
4.3.2 DNA
DNA yang digunakan pada penelitian ini adalah DNA kromosom bakteri
pendegradasi inulin sebagai templat untuk amplifikasi gen 16S rRNA dengan metoda
PCR. Oligonukleotida sebagai primer PCR. DNA 1 kb ladder sebagai marker pada
elektroforesis gel agarosa. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA
adalah BactF1, UniB1 dan 519F.
4.3.3 Bakteri
Bakteri pada penelitian ini adalah isolat bakteri yang berasal dari rizosfer umbi
tanaman dahlia yang tumbuh di Padang Panjang.
4.3.4 Inulin
Inulin diekstraksi dari umbi tanaman dahlia.
11
rRNA diamplifikasi dengan metoda PCR. Komposisi master mix sebagai berikut: 2,5
µL 10x Dream Taq bufer, 2,5 µL dNTP mix 2mM, 1 µL MgCl2 2,5mM, 0,5 µL primer
BactF1 20 µM, 0,5 µL primer UniB1 20 µM, sampel 0,4 µL (150ng/µL), 0,125 µL
Dream Taq polymerase, ddH2O ditambahkan sampai volume 25 µL. Proses PCR
dilakukan pada denaturasi awal 94C selama 2 menit, denaturasi 94C selama 0,3 menit,
annealing 48C selama 30 detik, elongasi 72C selama 1,5 menit, elongasi akhir 72C
selama 5 menit. Siklus PCR dilakukan 29 kali. Amplikon dielektroforesis pada gel
agarosa. (3). Pengecekan amplikon pada gel agarosa. Amplikon dielektroforesis
menggunakan gel agarosa 0,8%. Agarosa dilarutkan dengan bufer TAE 1x dan
dipanaskan sampai mendidih. Setelah larutan agarosa agak dingin (40C) ditambahkan
EtBr, dituang dalam tray dan dipasang sisir. Setelah gel membeku tray berisi gel
diletakkan pada bejana elektroforesis yang telah berisi bufer TAE 1x, kemudian sisir
dicabut dengan pelan. Sampel DNA dicampur dengan loading buffer bromphenol blue
(Fermentas) dan dimasukkan pada sumur gel. Sebagai penanda ukuran dan penentuan
perkiraan konsentrasi DNA digunakan DNA marker 1 kb ladder (Fermentas).
Elektroforesis dilakukan pada tegangan 80 volt selama 35 menit. Hasil elektroforesis
diamati di bawah sinar UV.; (4). Pemurnian amplikon PCR. Amplikon dimurnikan
sesuai prosedur pada Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit (Geneaid).
(5).Sekuensing. Amplikon gen 16S rRNA murni 25 ng/µL, primer BactF1 dan UniB1
masing-masing dengan konsentrasi 10 µM dikirim ke Macrogen di Korea. Amplikon
gen 16S rRNA disekuensing menggunakan primer BactF1, UniB1, dan 519F.
4.4.3 Bioinformatika
Analisis sekuen gen 16S rRNA menggunakan program BLASTn pada NCBI.
12
BAB 5
HASIL DAN PEMBAHASAN
5.2 Isolasi DNA Genom Bakteri dan Amplifikasi Gen 16S rRNA
Isolat bakteri pendegradasi inulin dari rizosfer umbi dahlia yang tumbuh di Padang
Panjang dua buah yaitu isolat warna koloni putih dengan kode isolat RZ-01 dan isolat
warna koloni agak kecoklatan dengan kode isolat RZ-02. Identifikasi bakteri isolat RZ-01
telah dilakukan secara molekuler. Identifikasi molekuler gen 16S rRNA bakteri isolat RZ-
01 diawali dengan mengisolasi DNA genom. DNA genom bakteri hasil isolasi dimuat
pada Gambar (6a). DNA genom ini dijadikan template untuk mengamplifikasi gen 16S
rRNA menggunakan metoda PCR. Gen 16S rRNA dari isolat RZ-01 telah berhasil
diamplifikasi secara PCR. Amplikon sejajar dengan marker DNA 1 kb ladder ukuran
1500 bp (Gambar 6b). Ukuran amplikon sekitar 1500 bp diperoleh karena posisi primer
BacF1 adalah basa ke-8 sampai ke-27, sedangkan posisi primer UniB1 adalah basa ke-
1510 sampai ke-1492 posisi pada gen 16S rRNA E.coli (Baker et al., 2003). ). Dengan
demikian, ukuran amplikon yang diperkirakan 1500 bp tepatnya adalah 1485 bp pada
pada gen 16S rRNA E.coli. Konsentrasi amplikon diperkirakan 100 ng/µL. Gen 16S
rRNA terdapat dalam multi kopi dalam kromosom bakteri ini. Gen 16S rRNA di dalam
kromosom bakteri terdapat 1 sampai 15 kopi. Sekitar 62% bakteri mempunyai lebih dari
1 kopi gen 16S rRNA (Case et al, 2007).
13
a b
Gambar 6. a. Elektroforesis DNA genomik bakteri dari isolat RZ-01
(lajur 1, marker DNA 1 kb, lajur 2 dan 3, DNA genomik)
b. Fragmen Gen 16S rRNA Hasil PCR.
(lajur 1, amplikon, lajur 2, marker DNA 1 kb)
15
Hasil sekuensing parsial gen 16S rRNA menggunakan primer BactF1
disambungkan dengan hasil sekuensing parsial gen 16S rRNA primer UniB1. Kedua
sekuens tersebut tumpang tindih sebanyak 383 bp. Sekuans gen 16S rRNA hasil
gabungan dimuat pada Gambar l0. Dengan demikian, urutan basa nukleotida fragmen
gen 16S rRNA isolat bakteri RZ-01 yang berhasil ditemukan adalah 1337 pb.
Gambar 10. Hasil sekuensing parsial gen 16S rRNA isolat RZ-01
menggunakan primer Bact F1, 519F dan UniB1
16
5.4. Identifikasi Molekuler Isolat RZ-01 Bakteri Pendegradasi Inulin
Identifikasi bakteri secara molekuler dilakukan dengan membandingkan urutan
basa nukleotida parsial gen 16S rRNA dari isolat RZ-01 dengan urutan basa nukleotida
gen 16S rRNA dari berbagai bakteri yang dimuat pada basis data GenBank menggunakan
program BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov pada 06 April 2016). Hasil BLASTn
dimuat pada Gambar 11. Fragmen gen 16S rRNA isolat RZ-01 mempunyai kemiripan
yang tinggi dengan 100 buah gen 16S rRNA bakteri pada basis data GeneBank.
Kebanyakan bakteri tersebut adalah Klebsiella. Dengan demikian dapat disimpulkan
bahwa isolat RZ-01 termasuk kelompok genus Klebsiella dengan spesies Klebsiella
pneumoniae. Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri gram negatif. Metoda
nonstaining menggunakan larutan KOH 3% pada isolat RZ-01 juga menunjukkan bakteri
gram negatif. Elektroferogram parsial gen 16S RNA isolat RZ-01 menggunakan primer
BactF1 dimuat pada Lampiran 2.
Gambar 11. Hasil BLASTn sekuens parsial gen 16S rRNA isolat RZ-01
17
BAB 6
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan
Isolat RZ-01 adalah salah satu isolat bakteri pendegradasi inulin yang telah
ditemukan dari rizosfer umbi tanaman dahlia yang tumbuh di Padang Panjang.
Berdasarkan identifikasi secara molekuler melalui sekuens parsial gen 16S rRNA, isolat
RZ-01 memiliki kekerabatan terdekat dengan kelompok genus Klebsiella dan spesies
Klebsiella pneumoniae.
6.2 Saran
Identifikasi isolat RZ-01 berdasarkan parsial gen 16S rRNA adalah sebagai
kelompok genus Klebsiella dan spesies Klebsiella pneumoniae. Sekuens genom
Klebsiella pneumoniae tersedia pada basis data GenBank. Alur penelitian selanjutnya
yang dapat dilakukan adalah melacak gen penderadasi inulin pada isolat RZ-01. Selain itu
diperlukan uji biokimia isolat RZ-01.
18
DAFTAR PUSTAKA
Allais, JJ; Kammoun,S; Blanc, P; Girard, C; Baratti, JC. (1986). Isolation and
Characteriztion of Bacterial Strain with Inulinase Activity. Applied and
Enviromental Microbiology. Vol.52.No5. 1086-1090.
Amann, RI; Ludwig,W; Schleifer, KH (1995). Phylogenetic identification and in situ
detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiology Reviews,
59:143-169.
Armougom, F; Raoult, D (2009). Exploring microbial diversity using 16S rRNA high-
throughput methods. JCSB, 2:074-092’
Azhar, M; Oktavia, B (2014). Eksplorasi bakteri pendegradasi inulin yang potensial untuk
pembuatan fruktosa dari sumber air panas di Solok dan rizosfer umbi dahlia.
Laporan Penelitian. Universitas Negeri Padang.
Azhar, M; Syukur, S; Natalia, D; Vovien; Jamsari; Munaf, E (2013) Characterization of
extracellular enzyme and identification of inulin degrading bacteria from hot spring
West Sumatra. International Journal of Chemistry
Azhar, M; Syukur, S; Natalia, D; Vovien; Jamsari (2011). Skrining dan identifikasi
bakteri pendegradasi inulin dari sumber air panas Padang Balimbiang di Solok.
Jurnal Riset Kimia. vol.5.no.1: 32-39.
Baker, GC; Smith, JJ; Cowan, DA (2003) Review and re-analysis of domain-specific
16S primers. Journal of Microbiological Methods, 55:541-555
Case RJ, Boucher Y, Dahllof I, Holmstrom C, Doolittle WF, Kjelleberg S (2007). Use
16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for microbial ecology studies.
Applied and Environmental Microbiology, 73:278-288.
Castro GR, Baigori MD, Sineriz, F (1995) A plate technique for screening of inulin
degrading microorganisms. Journal of Microbiological Methods, 22:51-56.
Franck, A; Leenheer, LD (2003). “Inulin”. Email: ann.franck@orafti.com. Diakses 25
Maret 2004
Gao, J; Xu, YY; Yang, HM; Xu, H; Xue, F; Li, S; Feng, XH (2014). Gene Cloning,
Expression, and Characterization of an Exo-inulinase from Paenbaccillus polymyxa
ZJ-9. App. Biochem Biotechnol.
Kwon HJ, Jeon SJ, You DJ, Kim KH, Jeong YK, Kim YH, Kim YM, Kim BW (2003).
Cloning and Characterization of exoinulinase from Bacillus polymyxa.
Biotechnology Letter 25:155-159.
Kulminskaya,AA; Arand,M; Eneyskaya, EV; Ivanen, DR; Shabalin, KA; Shishlyannikov,
SM; Saveliev, AN; Korneeva, OS; Neustroev, KN.(2003). Biochemical
Characterization of Aspergillus awamori Exoinulinase: Substrate Binding
Characteristics and Regio Selectivity of Hydrolysis. Biochimica et Biophysica Acta
1650.22-29.
Li, AX; Guo, LZ; Fu, Q; Lu, WD (2013). A simple and rapid plate assay for screening of
inulin-degrading microorganisms using Lugo’s iodine solution. African Journal of
Biotechnology. Vol.10(46); 9518-9521.
Lu, WD; Li, AX; Guo, QL (2013). Production of novel alkalitolerant and thermostable
inulinase from marine actinomycete Nocardiopsis sp DN-K15 and inulin hydrolysis
by the enzyme.
Madigan, MT; Martinko, JM (2006). Brock biology of microorganism. Pearson Education
Inc.USA.
Marchessault, RH; Bicha, T; Deslandes, Y; Revol, JF.(1980) Can. J.Chem, 58:2415.
19
Phelps,CF (1965). The Physical Properties of Inulin Solution. Biochem.J 95:41-47.
Sirisansaneeyakul, S; Worawuthiyanan, N; Vanichsriratana, W; Srinophakum,P; Chisti,
Y (2007). Production of Fructose from Inulin Mixed Inulinases from Aspergllus
niger and Candida guilliermondii. Word J Microbial Biotechnol 23:543-552.
Stackebrandt, E; Goebel, BM (1994). Taxonomic note: A place for DNA-DNA
reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present spesies definition in
bacteriology. International Journal of Systematic Bacteriology, 44:846-849.
Tsujimoto,Y; Watanabe, A; Nakano,K; Watanabe,K; Matsui,H; Tsuji,K; Tsukihara,T;
Suzuki, Y. (2003). Gene Cloning, Expression, and Crystallization of a
Thermostable Exo-inulinase from Geobacillus stearothermophilus KP1289. Appl
Microbiol Biotechnol 62:180-185.
Tohamy, EY (2006). Purification and characterization of exoinulinase enzyme from
Sterptomyces grisenus. Pakistan Journal of Biological Sciences, 9:911-916.
Zittan, L. (1981). Enzymatic Hydrolysis of Inulin an Alternative Way to Fructose
Production. Starch, 33:373-377.
20
Lampiran 1. Daftar Riwayat Hidup Peneliti
A. Identitas Diri
1 Nama Lengkap dengan Gelar Dr. Minda Azhar, M.Si
2 Jenis Kelamin Perempuan
3 Jabatan Fungsional / Gol Lektor kepala/ IV-c
4 NIP. 196411241991122001
5 NIDN 00-2411-6406
6 Tempat dan Tanggal Lahir Bukittinggi, 24 November 1964
7 E-mail minda@fmipa.unp.ac.id ; minda_azhar@yahoo.com
8 No HP 081267225154
9 Alamat Kantor Jurusan Kimia FMIPAUniversitas Negeri Padang
Jl.Prof.Dr.Hamka Air Tawar Padang
10 No. Telepon 0751 7057420
11 Lulusan yang telah dihasilkan S1= +40 , S2= 0, S3=0
12 Matakuliah yang diampu 1. Biokimia (S1 dan S2)
2. Bioteknologi (S1)
3. Praktikum Biokimia (S1)
4. Kapita Selekta Biokimia (S1)
5. Seminar Literatur Kimia (S1) dan Kimia Dasar (S1)
B. Riwayat Pendidikan
S1 S2 S3
1.Nama PT IKIP Padang ITB Bandung Universitas Andalas
2.Bidang Ilmu Pendidikan Kimia Biokimia/Bioteknologi Biokimia/Bioteknologi
3.Tahun Masuk 1984 (Pra S2 :1992-1993) 2008
1993
4.Tahun lulus September 1990 Februari 1996 01 Februari 2013
5.Judul Studi perbandingan Kloning dan Karakterisasi enzim
Skripsi/Tesis/ pengajaran konsep mol penentuan urutan ekstraseluler pada substrat
Disertasi dengan cara faktor- nukleotida mutan inulin dan molekuler gen
label dan cara rumus sal4-13Saccharomyces levanase dari bakteri
terhadap hasil belajar cerevisiae termofilik Bacillus
siswa kelas I di SMA licheniformis UBCT-007
Negeri 2 Padang Isolat Lokal Sumatera Barat
21
D. Pengalaman Pengabdian kepada Masyarakat (2 terakhir)
No Tahun Judul pengabdian kepada mayarakat Pendanaan
Sumber Jumlah (Rp)
1 2015 Pelatihan pengembangan media pembelajaran berbasis DIPA 15 juta
ICT dengan pola penyajian penalaran induktif bagi UNP
guru-guru kimia di SMA Payakumbuh (Ketua)
2 2014 Penerapan bioteknologi sederhana pada pengolahan DIPA 10 juta
buah kelapa menjadi VCO dan nata de Coco bagi UNP
masyarakat Kelurahan Bulakan Balai Kandi Kecamatan
Payakumbuh Barat (Ketua)
22
23