Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Nikzad dkk. Jurnal Ilmu Farmasi DARU (2017) 25:3DOI 10.1186/

s40199-017-0171-3

ARTIKEL PENELITIAN Akses terbuka

Deteksi simultan DNA sapi dan

babi dalam kapsul gelatin farmasi
dengan uji PCR dupleks untuk
otentikasi Halal
Jafar Nikzad1, Soraya Shahhosseini2, Maryam Tabarzad3, Nastaran Nafissi-Varcheh4 dan Maryam Torshabi5*

Abstrak
Latar belakang: Dalam industri farmasi, kapsul cangkang keras dan lunak biasanya dibuat dari gelatin, umumnya berasal
dari sumber sapi dan babi. Untuk memastikan bahwa produk farmasi mematuhi peraturan halal di negara-negara
Muslim (produk babi tidak diperbolehkan), pengembangan pengujian yang valid, andal, cepat, dan yang paling penting,
hemat biaya adalah yang paling penting.
Metode: Kami mengembangkan uji reaksi berantai polimerase (PCR) dupleks spesifik spesies yang menargetkan 149 bp
babi dan 271 bp DNA mitokondria sapi (mtDNA) untuk secara bersamaan mendeteksi DNA babi dan sapi (dalam satu reaksi
pada saat yang sama) dalam gelatin. Beberapa tes PCR simpleks tambahan (menargetkan 126 bp bovine dan 212 bp
porcine mtDNA) dan PCR real-time menggunakan kit yang tersedia secara komersial (untuk identifikasi DNA babi)
digunakan untuk memverifikasi selektivitas dan sensitivitas PCR dupleks kami. Setelah optimalisasi ekstraksi DNA dan
metode PCR, kapsul gelatin farmasi keras/lunak (mengandung obat) diuji keberadaan DNA babi dan/atau sapi.

Hasil: Duplex PCR mendeteksi keberadaan DNA babi 0,1%, yang lebih akurat daripada kit yang tersedia secara
komersial. Dari semua kapsul gelatin yang diuji (n = 24), 50% mengandung DNA babi (gelatin babi murni sendiri
atau dalam kombinasi dengan gelatin sapi).
Kesimpulan: Duplex PCR menghadirkan metode yang mudah diikuti, cepat, berbiaya rendah, dan andal untuk mendeteksi DNA babi
dan sapi secara bersamaan (>100 bp) dalam jumlah kecil dalam produk farmasi yang mengandung gelatin yang diproses tinggi
(dengan sensitivitas 0,1% untuk DNA babi ) yang dapat digunakan untuk otentikasi halal.

Kata kunci: Gelatin, Kapsul, Sapi, Babi, Duplex PCR

Latar belakang
Makanan halal (dalam Islam), berkaitan dengan produk makanan
atau non-makanan yang halal (atau diberkati) termasuk obat-
obatan. Sementara produk makanan dipantau secara ketat selama
sertifikasi halal, tidak ada persyaratan seperti itu untuk produk
non-makanan (yaitu, obat-obatan). Gelatin merupakan protein
dengan berat molekul tinggi yang banyak digunakan sebagai
bahan kental pada kapsul keras dan lunak. Kapsul lunak terutama
diisi dengan cairan, sedangkan kapsul keras diisi dengan:
* Korespondensi: maryam_torshabi@yahoo.com; torshabi@sbmu.ac.ir
5Departemen Biomaterial Gigi, Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Ilmu
Kedokteran Shahid Beheshti, Teheran, Iran
Daftar lengkap informasi penulis tersedia di akhir artikel
bubuk, dan bervariasi baik dalam komposisi maupun proses
produksi [1]. Gelatin dihasilkan dari denaturasi parsial kolagen
yang diekstraksi dari kulit, tulang, dan jaringan ikat hewan
(yaitu sapi dan babi) [2]. Sebagian besar (90%) kapsul gelatin
berasal dari jaringan babi karena kekuatan yang lebih besar,
ketahanan terhadap stres, kemampuan menahan air, titik
leleh yang lebih tinggi, waktu produksi yang lebih pendek (30
hari dibandingkan 60-80 hari untuk gelatin sapi), dan biaya
rendah. 3, 4].
Mengidentifikasi sumber gelatin sangat penting karena
kekhawatiran tentang kemungkinan penularan penyakit
ke manusia, serta masalah agama di negara-negara
Muslim (yang secara ketat melarang produk babi) [5-7].

© Penulis. 2017Akses terbuka Artikel ini didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Internasional Creative Commons Attribution 4.0
(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media
apa pun, asalkan Anda memberikan kredit yang sesuai ke penulis asli dan sumbernya, berikan tautan ke lisensi Creative Commons,
dan tunjukkan jika ada perubahan. Pengabaian Dedikasi Domain Publik Creative Commons (http://creativecommons.org/
publicdomain/zero/1.0/) berlaku untuk data yang disediakan dalam artikel ini, kecuali dinyatakan lain.
Nikzad dkk. Jurnal Ilmu Farmasi DARU (2017) 25:3 Halaman 2 dari 11

Metode yang mengandalkan sifat fisikokimia (yaitu, presipitasi kimia dan spektroskopi inframerah transformasi Fourier) Multiplex PCR (yaitu, duplex, triplex, dll.) adalah
telah terbukti tidak cocok untuk membedakan campuran gelatin (yaitu, campuran sapi/babi) terutama karena kesamaan teknik biologi molekuler yang tersebar luas untuk
struktur dan sifat fisikokimia gelatin yang berasal dari gelatin yang berbeda. sumber [8]. Ada sejumlah teknik molekuler amplifikasi/deteksi beberapa target secara simultan
yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi asal produk gelatin seperti berbasis protein/antibodi (yaitu, kromatografi cair (dengan sepasang primer yang berbeda untuk
kinerja tinggi dan uji imunosorben terkait-enzim) [7, 9-13] dan DNA- teknik berbasis. Dilaporkan bahwa teknik analisis setiap target dalam tabung reaksi yang sama) dalam
berbasis protein untuk identifikasi spesies dalam sampel campuran secara signifikan kurang sensitif dibandingkan teknik satu percobaan PCR. Multipleks PCR memiliki
berbasis DNA untuk evaluasi bahan yang diproses secara termal (yaitu, gelatin) karena perubahan epitop tertentu [8, 14, 15]. sejumlah keunggulan. Ini memberikan lebih banyak
Metode yang digunakan untuk pengolahan dan produksi gelatin meliputi hidrolisis jaringan ikat asam/basa, ekstraksi suhu informasi dengan menggunakan sampel awal yang
tinggi menggunakan air dan sterilisasi. Oleh karena itu, gelatin mengandung sejumlah kecil DNA yang sangat terdegradasi lebih sedikit, hemat biaya dan menghemat waktu
[16]. Faktanya, DNA merupakan molekul yang relatif stabil, yang lebih tahan terhadap proses panas dan dapat dideteksi (lebih sedikit reagen/langkah) dan sangat akurat
meskipun dalam bentuk terfragmentasi [14]. Deteksi DNA dapat membantu para ilmuwan dan lembaga regulasi mendeteksi (lebih sedikit kesalahan, peningkatan normalisasi
pengotor dan mengidentifikasi asal produk gelatin [17]. Ini bervariasi dari bahan ke bahan. Oleh karena itu, sensitivitas yang data). Karena bovine (jenis gelatin yang paling
tinggi diperlukan untuk mendeteksi kotoran di dalam produk. ekstraksi suhu tinggi menggunakan air dan sterilisasi. Oleh banyak digunakan di negara-negara Muslim) dan
karena itu, gelatin mengandung sejumlah kecil DNA yang sangat terdegradasi [16]. Faktanya, DNA merupakan molekul yang gelatin babi adalah jenis gelatin yang paling umum
relatif stabil, yang lebih tahan terhadap proses panas dan dapat dideteksi meskipun dalam bentuk terfragmentasi [14]. digunakan dalam produksi kapsul farmasi, deteksi
Deteksi DNA dapat membantu para ilmuwan dan lembaga regulasi mendeteksi pengotor dan mengidentifikasi asal produk simultan dari bovine dan porcine dapat berguna,
gelatin [17]. Ini bervariasi dari bahan ke bahan. Oleh karena itu, sensitivitas yang tinggi diperlukan untuk mendeteksi menghemat waktu, dan biaya. efektif.
kotoran di dalam produk. ekstraksi suhu tinggi menggunakan air dan sterilisasi. Oleh karena itu, gelatin mengandung

sejumlah kecil DNA yang sangat terdegradasi [16]. Faktanya, DNA merupakan molekul yang relatif stabil, yang lebih tahan

terhadap proses panas dan dapat dideteksi meskipun dalam bentuk terfragmentasi [14]. Deteksi DNA dapat membantu para Metode
ilmuwan dan lembaga regulasi mendeteksi pengotor dan mengidentifikasi asal produk gelatin [17]. Ini bervariasi dari bahan Persiapan sampel
ke bahan. Oleh karena itu, sensitivitas yang tinggi diperlukan untuk mendeteksi kotoran di dalam produk. Deteksi DNA dapat Bubuk gelatin sapi murni (180–200 g) dan babi
membantu para ilmuwan dan lembaga regulasi mendeteksi pengotor dan mengidentifikasi asal produk gelatin [17]. Ini (G2500) dibeli (masing-masing dari Faravari Darooie
bervariasi dari bahan ke bahan. Oleh karena itu, sensitivitas yang tinggi diperlukan untuk mendeteksi kotoran di dalam Gelatin Halal, Iran dan Sigma-Aldrich, Jerman) dan
produk. Deteksi DNA dapat membantu para ilmuwan dan lembaga regulasi mendeteksi pengotor dan mengidentifikasi asal digunakan. Campuran standar gelatin dibuat
produk gelatin [17]. Ini bervariasi dari bahan ke bahan. Oleh karena itu, sensitivitas yang tinggi diperlukan untuk mendeteksi dengan menambahkan 0,1, 1, 10, 50 dan 75% b/b
kotoran di dalam produk. bubuk gelatin babi ke dalam bubuk gelatin sapi
(Tabel 2). Sebanyak 24 farmasi keras (n = 12) dan
Deteksi dan kuantifikasi DNA jejak dapat dilakukan dengan lunak (n = 12) kapsul gelatin (mengandung obat) dari
menggunakan metode berbasis reaksi berantai polimerase berbagai negara (n = 8) dan internasional (n = 16)
(PCR) yang memiliki keberhasilan terbesar karena sensitivitas, perusahaan dibeli (2015-2016) dari apotek di
spesifisitas, kecepatan, dan reproduktifitas yang lebih tinggi. Teheran (Iran) dan dinilai (Tabel 3).
Di sisi lain, ekstraksi DNA berkualitas tinggi merupakan
prasyarat penting untuk teknik berbasis PCR, yang bisa ekstraksi DNA
menjadi masalah potensial jika ada kerusakan luas pada DNA DNA diekstraksi dari bubuk gelatin murni (100% b/b
setelah pemrosesan panas [18, 19]. Banyak primer telah sapi atau babi), campuran biner bubuk gelatin sapi/
dikembangkan berdasarkan gen mitokondria dan nukleus babi (0,1-75% b/b) dan kapsul farmasi menggunakan
untuk melacak DNA spesifik spesies. Analisis DNA mitokondria DNeasy Mericon Food Kit berbasis kolom (Qiagen,
menggunakan PCR menawarkan serangkaian keuntungan. Jerman). Proses ekstraksi (protokol fragmen kecil pada
Gen mtDNA hadir dalam ribuan salinan per sel; dengan 200 mg sampel awal) dilakukan dalam kondisi bebas
demikian, variabilitas mtDNA yang besar memungkinkan kontaminasi/degradasi DNA untuk meminimalkan hasil
identifikasi yang andal dari spesies yang tepat dalam semu (dari kontaminasi reagen dan lingkungan
campuran. Meskipun DNA nuklir (linier) lebih kuat, mtDNA laboratorium dan terutama dari kontaminasi silang
(sirkular) lebih stabil dari waktu ke waktu / dan juga dapat antar sampel) dan menghambat degradasi DNA yang
hadir secara intraseluler. MtDNA sebagian besar hewan diekstraksi (oleh DNA lingkungan), masing-masing.
mengkode 37 gen; salah satunya adalah gen untuk sitokrom b Pertama, isi obat dari kapsul (bubuk atau cair)
(Cyt b) [19, 20]. Ada banyak artikel yang berkaitan dengan dikosongkan dan cangkang kapsul lunak dicuci dengan
deteksi DNA babi atau sapi dalam makanan; tetapi sampai air deionisasi ultra violet-treated (UV) yang diautoklaf.
sekarang hanya sedikit yang menggunakan metodologi PCR Selanjutnya, cangkang dicincang menggunakan
[yaitu, PCR konvensional, PCR waktu nyata, hibridisasi PCR- pemutih 10% dan gunting yang diberi perlakuan UV;
selatan dan PCR-restriction fragment length polymorphism kemudian 200 mg dipindahkan ke dalam tabung
(RFLP)] untuk mendeteksi DNA babi atau sapi dalam cangkang mikrosentrifugasi bebas DNase 2 mL steril. Ekstraksi
kapsul gelatin [4, 6 , 9, 21–23]. DNA dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik dengan
beberapa modifikasi untuk memaksimalkan pemulihan
Nikzad dkk. Jurnal Ilmu Farmasi DARU (2017) 25:3
fragmen DNA pendek. Pertama, 1 mL buffer lisis dan 25
L larutan proteinase K ditambahkan ke tabung
(mengandung 200 mg bubuk standar atau cangkang
kapsul cincang) dan diinkubasi selama 30 menit pada
suhu 60 ° C dalam inkubator mandi kering (INC- 13,
NAMSA, AS). Selanjutnya, larutan didinginkan sampai
suhu kamar di atas es selama kurang lebih 15 menit
dan disentrifugasi (Hettich, Jerman) selama 5 menit
pada 2.500 g. Selanjutnya, supernatan bening (700 L)
dipindahkan ke tabung mikrosentrifus 2 mL baru, yang
berisi 500 L kloroform (Merck, Jerman), dan
disentrifugasi pada 14.000 g selama 15 menit. Setelah
selesai, 250 L fase berair bagian atas ditambahkan ke
tabung mikrosentrifugasi 2 mL segar yang
mengandung 1 mL buffer pengikat dan dicampur
dengan tangan secara menyeluruh. Untuk mencapai
hasil DNA yang lebih tinggi, langkah ini diulangi
dengan 250 L fase berair bagian atas lainnya (500 L
cairan berair bagian atas). Selanjutnya, 600 L campuran
dipipet ke dalam kolom spin dan ditempatkan dalam
tabung koleksi 2 mL dan disentrifugasi pada 17.900 g
selama 2 menit; kemudian flow-through kemudian
dibuang. Langkah ini diulang 2 kali lagi (total 600 L)
untuk meningkatkan hasil DNA yang diekstraksi.
Setelah itu, 500 L buffer pencuci ditambahkan ke kolom
spin dan disentrifugasi pada 17.900 g selama 2 menit;
kemudian flow-through dibuang. Tabung koleksi
disentrifugasi lagi pada 17.900 g selama 4 menit untuk
mengeringkan membran. Akhirnya, kolom spin
dipindahkan ke tabung mikrosentrifugasi 1,5 mL segar,
dan 30 L buffer elusi ditambahkan ke membran dan
diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar; dan
kemudian disentrifugasi lagi pada 17, 900 g selama 2
menit lagi. Proses ini diulang sekali lagi. Proses
ekstraksi DNA diulang dua kali untuk setiap sampel
gelatin. Kami menjalankan proses ekstraksi pada buffer
lisis saja (yang tidak mengandung gelatin), sebagai
kontrol negatif (kosong). Solusi DNA yang diekstraksi
disimpan pada suhu -20 ° C untuk analisis lebih lanjut.
Tabel 1 Primer oligonukleotida spesifik spesies yang digunakan dalam penelitian ini
Jenis Urutan Primer (5- > 3)
babi F: ATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACC R:
CTACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG
F: GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA R:
ATGAAAGAGGGCAAATAGATTTTCG F:
Termasuk keluarga sapi ATGATCTTATCAATATTCTTGACCC R:
CCTTCAAGGGGTGTTTTGTTTTAA F:
GCCATATACTCTCCTTGGTGACA R:
GTAGGCTTGGGAATAGTACGA
Halaman 3 dari 11
Kuantifikasi dan kemurnian DNA
Kualitas dan kuantitas bahan DNA yang diekstraksi
ditentukan dengan spektrofotometri, menggunakan Nano-
Drop™ Spektrofotometer 2000/2000c (Thermo Scientific,
USA). Konsentrasi DNA ditentukan dengan absorbansi UV
pada 260 nm dan kemurnian DNA yang diekstraksi
ditentukan dengan rasio absorbansi pada 260 dan 280 nm.
PCR simpleks dan dupleks
Empat set primer spesifik untuk mtDNA sapi dan babi yang
digunakan untuk amplifikasi PCR (Bioneer, Korea Selatan)
tercantum dalam Tabel 1 [24-27]. Amplifikasi PCR simpleks
dilakukan pada 20 L total volume reaksi yang
mengandung 2 L ekstrak DNA, 10 L Taq DNA polimerase
master mix red (1,5 mM Mg2+) (Ampliqon, Denmark), dan
hanya satu pasang primer maju dan mundur (0,4 M primer
babi 149-F/-R, 0,15 M primer sapi 271-F/-R, 0,2 M 126-F/-R
bovine primer atau 0,2 M dari 212-F/-R porcine primer),
dan air bebas nuklease untuk mengatur volume
(CinnaGen, Iran). Amplifikasi PCR dupleks dilakukan seperti
dijelaskan di atas dengan beberapa perbedaan. Total
volume reaksi PCR dupleks (20 L) mengandung dua
pasang primer dengan konsentrasi akhir yang berbeda
yaitu 0,35 M primer babi 149-F/-R dan 0,125 M primer sapi
271-F/-R. Reaksi tanpa template DNA (NTC) dan dengan 2 L
ekstraksi DNA kontrol negatif (kosong) digunakan untuk
setiap pasangan primer dan diperiksa untuk kontaminasi
DNA dalam amplifikasi PCR dan proses ekstraksi DNA
masing-masing. Amplifikasi reaksi berantai polimerase
dilakukan dalam siklus termal (PeQlab, Jerman) dalam
kondisi berikut: Denaturasi awal pada 94 °C selama 2
menit diikuti oleh 35 siklus denaturasi pada 94 °C selama
30 detik, 60 °C selama 30 detik, dan 72 °C selama 30 detik.
Perpanjangan akhir dilakukan pada 72 ° C selama 5 menit.
Setiap reaksi diulang setidaknya dua kali untuk setiap
sampel DNA pada waktu yang berbeda.
Elektroforesis gel dan analisis semi-kuantitatif
Produk PCR yang diperkuat dianalisis menggunakan gel
agarosa 2% dalam 0,5X Tris-asetat-etilena diamina tetra asetat
Gen Target Suhu Annealing (°C) Amplikon (bp) Referensi
Cyt b 60 149 [24]
Cyt b 60 212 [25]
ATPase 8 60 126 [26]
Cyt b 60 271 [27]
Nikzad dkk. Jurnal Ilmu Farmasi DARU (2017) 25:3 Halaman 4 dari 11

buffer asam (TAE) dan pewarna aman DNA (Parstus,
Iran) sebagai agen visualisasi (berjalan selama 45 menit
pada 100-120 V). Semua gel agarosa dalam percobaan
di atas menggunakan tangga DNA 100 bp (Parstus,
Iran) sebagai penanda ukuran dan divisualisasikan
menggunakan dokumentasi gel transilluminator UV
(Vilber Lourmat, Prancis); gambar digital diperoleh. Uji
PCR (kualitatif) dupleks konvensional kemudian
dioptimalkan untuk pendekatan semi-kuantitatif untuk
menganalisis intensitas pita PCR setelah elektroforesis
gel agarosa menggunakan perangkat lunak Scion
Image (ScnImage.exe) (Scion corporation, Maryland).
Secara singkat, intensitas fluoresensi dari pita PCR yang
diperoleh dari amplifikasi simultan DNA sapi dan babi
dari campuran yang berbeda dari bubuk standar sapi
dan babi dinormalisasi.babi = sayababi/(SAYAbabi + aku
termasuk keluarga sapi), dimana Nbabi adalah intensitas pita yang
dinormalisasi untuk DNA babi, dan Ibabi dan sayatermasuk
keluarga sapi adalah intensitas pita untuk DNA babi dan
sapi, masing-masing [15].
PCR waktu-nyata menggunakan kit babi mericon
Selain PCR simpleks (amplikon babi-212 dan bovine-126 bp),
kami menggunakan Mericon Pig Kit komersial (Qiagen,
Jerman) untuk mengonfirmasi PCR dupleks yang
dikembangkan (amplikon babi-149/bovine-271 bp) dalam
penelitian ini. Pengujian menggunakan protokol berbasis PCR
real-time. Amplifikasi protokol berbasis PCR real-time ini
dilakukan dalam 20 L total volume reaksi yang mengandung
9,6 L DNA sampel (2 L ekstrak DNA dari bubuk standar atau
kapsul farmasi dan 7,6 L buffer pengenceran asam nukleat
QuantiTect) dan 10,4 L uji Mericon yang dilarutkan,
mengandung campuran master multipleks PCR
HotStarTaq®Plus DNA polimerase, buffer PCR multipleks real-
time dan dNTP), uji Mericon mengandung primer dan probe
spesifik target dan kontrol internal dan pewarna ROX. Dalam
beberapa sampel dengan pita babi samar dalam PCR dupleks
tetapi tidak ada
hasil positif menggunakan kit, reaksi diulang dengan 4 dan
9,6 L DNA yang diekstraksi. Amplifikasi dilakukan pada ABI
StepOne™ sistem deteksi (Applied Biosystem Instruments,
USA) menggunakan kondisi siklus termal berikut: tahap
pra-PCR pada 60 °C selama 30 detik, denaturasi pada 95 °C
selama 10 menit (tahap holding), diikuti oleh 45 siklus
denaturasi pada 95 ° C selama 15 detik, anil dan ekstensi
pada 60 °C selama 1 menit (tahap siklus), dan tahap pasca-
PCR pada 60 °C selama 30 detik. Menurut instruksi kit,
saluran FAM (fluorescein) dan VIC digunakan untuk
mendeteksi DNA target (babi) dan kontrol internal (untuk
mengkonfirmasi keberhasilan PCR). Setiap percobaan
diulang setidaknya 3 kali untuk setiap template DNA.
Reaksi tanpa templat DNA (NTC) dan dengan 2 L ekstraksi
DNA kontrol negatif (kosong) digunakan untuk setiap
pasangan primer untuk memeriksa kontaminasi DNA
dalam amplifikasi PCR dan proses ekstraksi DNA, masing-
masing. Reaksi dengan DNA babi [9. 6 L kontrol positif
yang disediakan oleh kit dan 2 L ekstrak DNA dari 50% (b/
b) campuran bubuk standar sapi/babi] dianggap sebagai
kontrol positif. Plot amplifikasi sinyal fluoresen yang
dinormalisasi (delta Rn) versus siklus dianalisis
menggunakan StepOne™ perangkat lunak versi 2.1
(Instrumen Biosistem Terapan, AS).
Hasil
Analisis kuantitatif DNA yang diekstraksi
Kuantitas dan kemurnian ekstrak DNA dari 200 mg
bubuk gelatin standar (Tabel 2) dan cangkang kapsul
gelatin keras/lunak (dari kapsul yang mengandung
obat) (Tabel 3) diperiksa dengan spektrofotometri.
Rasio A260/A280 berkisar antara 1,7 dan 1,8. Hasil
DNA berkisar antara 6,5 dan 131 ng/μL.
PCR sederhana
Pada tahap awal percobaan ini, uji PCR simpleks
dengan spesifik babi (149 dan 212) dan

Meja 2 Deteksi DNA babi dan sapi dalam bubuk standar gelatin (campuran sapi murni, babi murni dan sapi/babi) menggunakan PCR
dupleks, PCR simpleks (untuk konfirmasi hasil PCR dupleks) dan PCR real-time menggunakan kit deteksi DNA babi komersial (untuk
konfirmasi dari hasil PCR dupleks) (2 L ekstraksi DNA/20 L reaksi PCR)
Gelatin (bubuk standar) DNA yang diekstraksi Produk PCR dupleks Produk PCR Simpleks Mericon Kit Babi
(DNA babi)
Termasuk keluarga sapi babi Konsentrasi (ng/μL) 149 bp band 271 bp band 212 bp band 126 bp band
(% b/b) (% b/b) [260/280 (rasio)] (babi) (termasuk keluarga sapi) (babi) (termasuk keluarga sapi)

100.0 0,0 131.0 [1.8] - + - + -

99,9 0.1 118.0 [1.7] + (pingsan) + + (pingsan) + -
99,0 1.0 130.5 [1.8] + + + + - (+)A

90.0 10.0 109.0 [1.8] + + + + +

50.0 50.0 86.5 [1.7] + + + + +
25.0 75.0 52.0 [1.7] + + + + +
0 100.0 34.0 [1.7] + - + - +
APositif dengan 4 L DNA yang diekstraksi/20 L reaksi PCR
Nikzad dkk. Jurnal Ilmu Farmasi DARU (2017) 25:3 Halaman 5 dari 11

Tabel 3 Deteksi DNA babi dan sapi dalam kapsul gelatin farmasi keras (no. 1-12) dan lunak (no. 13-24) (dari perusahaan yang
berbeda) menggunakan PCR dupleks, PCR simpleks (untuk konfirmasi hasil PCR dupleks) dan waktu nyata PCR menggunakan kit
deteksi DNA babi komersial (untuk konfirmasi hasil PCR dupleks) (2 L ekstraksi DNA/20 L reaksi PCR)
Farmasi DNA yang diekstraksi Produk PCR dupleks Produk PCR Simpleks Mericon Kit Babi
kapsul gelatin (DNA babi)
Nomor (tidak.) Isi Konsentrasi (ng/μL) 149 bp band 271 bp band 212 bp band 126 bp band
[260/280 (rasio)] (babi) (termasuk keluarga sapi) (babi) (termasuk keluarga sapi)

1 Omeprazol 15.5 [1.7] - + - + -

2 Pankreatin 6.5 [1.7] + - + - +
3 Omeprazol 18.0 [1.7] + (pingsan) + + + - (+)A

4 Piroksikam 53.0 [1.8] - + - + -

5 Venlafaxin 85.0 [1.8] - + - + -
6 Diklofenak 44.0 [1.8] - + - + -
7 Levodopa 57.0 [1.8] - + - + -
8 Mebeverine 93.0 [1.8] - + - + -
9 Duloxetin 23.0 [1.8] + (pingsan) + + (pingsan) + - (+)B
10 Klindamisin 43.0 [1.8] - + - + -
11 celecoxib 55.0 [1.8] - + - + -
12 Lansoprazol 124,5 [1,8] + + + + +
13 Ibuprofen 15.6 [1.7] - + - + -
14 Multivitamin 10.8 [1.7] + - + - +
15 Parasetamol 55.0 [1.8] + + + + +
16 Dingin Dewasa 58.0 [1.8] + + + + +
17 Magnesium 14.0 [1.7] - + - + -
18 Minyak Hati 15.0 [1.7] + - + - +
19 Minyak Primrose 17.0 [1.8] - + - + -
20 Multivitamin 16.0 [1.7] + - + - +
21 Mineral 14.0 [1.7] + - + - +
22 Multivitamin 30.0 [1.7] + - + - +
23 Multivitamin 22.5 [1.7] - + - + -
24 Minyak ikan 15.0 [1.7] + - + - +
Total Kapsul Positif untuk DNA Porcine (%) 12 (50%)

Total Kapsul Negatif untuk DNA Porcine (%) 12 (50%)

APositif dengan 4 L ekstraksi DNA/20 L reaksi PCR, BPositif dengan 9,6 L ekstraksi DNA/20 L reaksi PCR

primer khusus sapi (126 dan 271) digunakan. Seperti yang
ditunjukkan pada Gambar. 1a dan Tabel 2, PCR simpleks
mendeteksi sedikitnya 0,1% DNA babi (149 bp). PCR simpleks
yang menghasilkan produk DNA babi 212 bp digunakan untuk
konfirmasi dan sensitivitas yang sama diamati untuk
mendeteksi DNA babi 212 bp (0,1% babi) (Gbr. 1b, Tabel 2).
Juga, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2b dan Tabel 3,
elektroforesis gel dari produk amplifikasi PCR simpleks
menunjukkan pita yang diharapkan dari 212 bp untuk babi
dan 126 bp untuk kapsul gelatin sapi (konfirmasi hasil PCR
dupleks pada Gambar. 2a).
PCR dupleks
Dalam penelitian ini, duplex PCR digunakan untuk mengamplifikasi dua
sekuens DNA sapi dan babi yang berbeda secara bersamaan.
(dalam satu campuran reaksi pada waktu yang sama). Primer
(empat set) digunakan berpasangan (babi/sapi: 149/271, 149/126,
212/271, 212/126) dalam berbagai kondisi reaksi (yaitu, primer
yang berbeda atau Mg2+ konsentrasi, suhu/waktu anil yang
berbeda, siklus yang berbeda) untuk pemilihan dan optimalisasi
pasangan primer yang paling cocok untuk amplifikasi PCR dupleks
yang dapat diterima (data tidak ditampilkan). Hanya satu pasang
(149-F/-R babi dan 271-F/-R sapi) yang menunjukkan hasil yang
dapat diterima (yaitu, pita spesifik yang tajam). Setelah
mengoptimalkan teknik menggunakan referensi campuran bubuk
gelatin babi / sapi biner, dimungkinkan untuk mendeteksi
keberadaan DNA babi 0,1% dalam campuran (Gbr. 1a dan Tabel 2)
serta dalam kapsul gelatin (Gbr. 1a dan Tabel 2). 2a dan Tabel 3),
dengan menggunakan amplifikasi simultan dari mitokondria cyt b
untuk DNA babi dan sapi. Juga,
Nikzad dkk. Jurnal Ilmu Farmasi DARU (2017) 25:3 Halaman 6 dari 11

Gambar 1 (Lihat legenda di halaman berikutnya.)

Nikzad dkk. Jurnal Ilmu Farmasi DARU (2017) 25:3 Halaman 7 dari 11

(Lihat gambar di halaman sebelumnya.)

Gambar 1 A: Elektroforesis gel agarosa produk PCR simpleks dan dupleks (149 bp untuk babi dan 271 bp untuk mtDNA sapi) yang dihasilkan dari ekstraksi
DNA (2 L/20 L reaksi PCR) bubuk standar sapi dan babi murni (100%) dan campuran referensi sapi /bubuk babi [0,1, 1, 10, 50 dan 75% (b/b) babi]. L100:
tangga 100 bp; Kosong: Kontrol negatif ekstraksi DNA; NTC: Kontrol negatif reaksi PCR; nBabi: Intensitas pita yang dinormalisasi untuk DNA babi dihitung
dengan perangkat lunak analisis citra. Pita samar ditandai dengan panah.B: Elektroforesis gel agarosa dari produk PCR simpleks (212 bp untuk babi dan
126 bp untuk mtDNA sapi) dari sampel DNA di atas (2 L) untuk konfirmasi hasil PCR dupleks. C: Plot amplifikasi (Delta Rn vs Siklus) PCR real-time dari
sampel DNA di atas (2 dan 4 L) menggunakan merconkit babi untuk mengonfirmasi hasil PCR dupleks. Kurva merah dan hijau menampilkan DNA target
(babi) dan kontrol internal (IC), masing-masing

seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1a adalah mungkin untuk
mendapatkan intensitas pita normal yang dapat diterima untuk
DNA babi [Nbabi = sayababi/(SAYAbabi + akutermasuk keluarga sapi)] dalam
campuran sapi-babi. Dengan menurunkan jumlah siklus PCR dari
40 menjadi 37 dan selanjutnya menjadi 35, menurunkan
konsentrasi primer bovine 271-F/-R dari 0,25 menjadi 0,15 dan
selanjutnya menjadi 0,125 M, serta menurunkan konsentrasi babi
149-F/-R primer dari 0,4 hingga 0,35 M, dimungkinkan untuk
menjatah (0,0, 0,08, 0,17, 0,28, 0,56, 0,78 dan 1,0 untuk 0,0, 0,1, 1,
10, 50, 75 dan 100% b/b) babi (DNA) kontaminasi, masing-masing
(dengan sensitivitas 0,1%).
PCR waktu nyata
Untuk mengkonfirmasi keandalan dan sensitivitas PCR
dupleks, semua sampel DNA dari bubuk gelatin standar
dan kapsul dievaluasi menggunakan kit deteksi DNA
babi komersial. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar.
1c dan 2c, amplifikasi pengendalian internal (kurva
hijau) positif pada semua sampel (tidak ada PCR yang
gagal) sedangkan amplifikasi DNA babi target (kurva
merah) negatif pada kontrol negatif (kosong dan NTC;
tidak ada kontaminasi pada proses ekstraksi DNA dan
reaksi PCR). Amplifikasi DNA babi positif pada kontrol
positif [DNA babi disediakan dalam kit dan DNA
diekstraksi dari 50% (b/b) campuran bubuk gelatin sapi/
babi]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1c dan
Tabel 2, amplifikasi PCR real-time DNA babi dalam
campuran bubuk gelatin sapi-babi (2 L DNA yang
diekstraksi per 20 L reaksi PCR) positif dengan adanya
10-75% (b/b) DNA babi dalam campuran, tetapi negatif
dalam 0,1 dan 1% kontaminasi babi (DNA). Dengan
meningkatkan volume DNA yang diekstraksi menjadi 4
L (pada reaksi PCR 20 L), hasilnya menjadi positif pada
sampel yang mengandung DNA babi 1% tetapi hasilnya
tidak menjadi positif pada sampel dengan DNA babi
0,1% bahkan setelah volume ditingkatkan menjadi 9,6 L
(setengah dari total volume reaksi PCR). Hasil deteksi
DNA babi dalam 6 kapsul gelatin (3 keras dan 3 lunak)
dengan kit komersial ditunjukkan pada Gambar 2c dan
Tabel 3. Hasil deteksi 18 kapsul gelatin lainnya
ditunjukkan pada Tabel 3. Hasil untuk sebagian besar
sampel sesuai dengan yang diperoleh dari PCR
simpleks dan dupleks. Namun, untuk dua sampel (no. 3
dan 9) dengan pita DNA babi yang samar terdeteksi
pada PCR konvensional, hasilnya negatif dengan 2 L DNA
yang diekstraksi (per 20 L reaksi PCR) dan menjadi positif
setelah meningkatkan konsentrasi DNA yang diekstraksi
sebanyak dua (no. 3) menjadi lima (no. 9) lipatan (4 dan 9.6
L).
Diskusi
Identifikasi asal produk hewani yang digunakan dalam farmasi
merupakan tantangan bagi laboratorium pengawasan obat dan
lembaga halal. Khususnya, negara-negara Muslim berusaha
mengidentifikasi keberadaan bahan terlarang (non-halal) dalam
produk makanan, obat-obatan, dan persediaan kecantikan [28-30].
Oleh karena itu, diperlukan metode yang dapat diandalkan, cepat,
dan sangat sensitif untuk mendeteksi keberadaan zat tersebut
(misalnya, produk babi). Di negara-negara Muslim, agar-agar yang
digunakan dalam industri makanan/farmasi terutama berasal dari
sumber sapi. Oleh karena itu, penting untuk mendeteksi
kemungkinan kontaminasi gelatin sapi dengan gelatin babi.
Gelatin adalah produk protein yang sangat diproses, biasanya
diekstraksi dari kulit, tulang dan jaringan ikat hewan (yaitu, babi,
sapi, ikan, kuda atau unggas). Sebagai hasil dari metode yang
digunakan dalam produksi dan pemrosesan gelatin, gelatin
umumnya hanya mengandung sejumlah kecil DNA yang sangat
terdegradasi (berasal dari sel hewan). Sejak teknik berbasis PCR
(menggunakan primer spesifik spesies) efektif dalam
mengidentifikasi potongan-potongan kecil DNA, mereka telah
menerima perhatian yang signifikan dalam beberapa tahun
terakhir. Jumlah salinan DNA mitokondria per sel yang tinggi dan
kemungkinan stabilitasnya di bawah kondisi pemrosesan yang
berbeda memastikan amplifikasi produk PCR yang diharapkan
bahkan dalam sampel yang mengandung sejumlah kecil DNA [31].
Namun, perlu dicatat bahwa prasyarat penting untuk amplifikasi
PCR adalah untuk mendapatkan jumlah yang cukup dari DNA yang
diekstraksi berkualitas tinggi untuk analisis. Dalam penelitian ini,
setelah ekstraksi DNA dioptimalkan, Ekstrak DNA dari 200 mg
cangkang kapsul gelatin cincang (dari kapsul farmasi yang
mengandung obat) memiliki hasil dan kualitas yang dapat
diterima untuk dianalisis lebih lanjut dengan PCR. Ini
menunjukkan kecukupan protokol ekstraksi yang digunakan untuk
kapsul gelatin. Selanjutnya, kami mengembangkan uji PCR
dupleks (dengan 149 primer spesifik babi dan 271 primer spesifik
sapi) untuk deteksi simultan DNA babi dan sapi. Untuk mengatasi
variasi yang mungkin terjadi selama ekstraksi DNA, amplifikasi
dan gel
Nikzad dkk. Jurnal Ilmu Farmasi DARU (2017) 25:3 Halaman 8 dari 11

Gambar 2 (Lihat legenda di halaman berikutnya.)

Nikzad dkk. Jurnal Ilmu Farmasi DARU (2017) 25:3 Halaman 9 dari 11

(Lihat gambar di halaman sebelumnya.)

Gambar 2. A: Elektroforesis gel agarosa produk PCR dupleks (149 bp untuk babi dan 271 bp untuk mtDNA sapi) yang dihasilkan dari ekstraksi
DNA (reaksi PCR 2 L/20 L) dari tiga hard (no. 1, 2 dan 3) dan tiga soft (no. 13, 14 dan 15) kapsul gelatin farmasi (Jumlahnya sesuai dengan angka
pada Tabel 3). L100: tangga 100 bp. Kosong: Kontrol negatif ekstraksi DNA; NTC: Kontrol negatif reaksi PCR; PC: Kontrol positif (campuran
bubuk sapi/babi); pita samar ditandai dengan panah.B: Elektroforesis gel agarosa dari produk PCR simpleks (212 bp untuk babi dan 126 bp
untuk mtDNA sapi) dari sampel DNA di atas (2 L) untuk mengonfirmasi hasil PCR dupleks. C: Plot amplifikasi (Delta Rn vs Siklus) PCR real-time
dari sampel DNA di atas (2 L untuk nomor 1, 2, 13, 14 dan 15–2 dan 4 L untuk nomor 3) menggunakan merconpig kit untuk konfirmasi hasil
Duplex PCR. Kurva merah dan hijau menampilkan DNA target (babi) dan kontrol internal (IC), masing-masing

persiapan, intensitas band target dinormalisasi. Dengan PCR dupleks yang dikembangkan/dioptimalkan ini, dari kit tersebut bervariasi [4]. Hasil kami dengan jelas
kandungan gelatin babi (sebagai sampel gelatin babi murni atau sebagai pengotor/kontaminasi dalam sampel menunjukkan bahwa PCR dupleks konvensional cukup sensitif
gelatin sapi) terdeteksi serendah 0,1%. Karena laporan yang kontradiktif tentang spesifisitas primer dalam untuk mendeteksi persentase gelatin sapi dan babi yang
studi deteksi spesifik spesies, kami menggunakan dua metode tambahan untuk mengonfirmasi PCR dupleks. sangat rendah.
Untuk memverifikasi selektivitas dan sensitivitas teknik ini, kami menggunakan PCR simpleks dengan primer Polimorfisme panjang fragmen pembatasan PCR (RFLP)
spesifik sapi dan babi; selain itu, kami menggunakan kit deteksi DNA babi yang tersedia secara komersial [21] dan real-time PCR [6, 22] teknik yang digunakan untuk
(berdasarkan PCR kuantitatif real-time TaqMan). Shabani dkk. menggunakan PCR simpleks dengan 212 primer identifikasi kapsul gelatin. Dibandingkan dengan PCR-RFLP
spesifik babi dan 271 sapi (secara terpisah) untuk mendeteksi DNA babi dan sapi dalam gelatin, makanan yang (proses 3 langkah: reaksi PCR, pencernaan enzimatik
mengandung gelatin, dan cangkang kapsul [8]. Menurut hasil mereka, sedikitnya 0,1% b/b gelatin babi dan produk PCR dan elektroforesis produk pencernaan), PCR
sapi terdeteksi menggunakan teknik ini. Hasil PCR simpleks kami dari primer yang sama konsisten dengan dupleks (proses 2 langkah: reaksi PCR dan elektroforesis
hasil mereka. Soares dkk. menggunakan duplex PCR untuk deteksi simultan DNA babi (dengan 149 primer produk PCR berikutnya) secara bersamaan dapat
spesifik babi) dan unggas (dengan 183 bp spesifik primer unggas) dalam daging [15]. Mereka melaporkan mendeteksi keberadaan babi dan DNA sapi (penguatan
deteksi DNA babi 149 bp dengan sensitivitas 0,1%. Hasil PCR simpleks dan dupleks kami menggunakan primer kedua produk dalam satu campuran reaksi pada waktu
yang sama untuk DNA babi (149 bp) konsisten dengan hasilnya. Pada tahun 2005, Tasara dkk. melaporkan yang sama) dalam sampel yang sangat kecil (200 mg) lebih
bahwa tes PCR konvensional menargetkan subunit 8 mitokondria ATP sintase (ATPase8) di beberapa sampel cepat (perlu langkah yang lebih sedikit). Selain itu, yang
gelatin berhasil mendeteksi DNA sapi tanpa reaktivitas silang dengan sampel gelatin dari hewan lain [26]. Kami terakhir lebih hemat biaya (membutuhkan lebih sedikit
menggunakan primer yang sama untuk verifikasi PCR dupleks dan hasil kami sesuai dengan mereka. Juga, reagen). PCR real-time sensitif dan cukup spesifik untuk
kami menggunakan kit deteksi DNA babi komersial (berdasarkan PCR kuantitatif real-time) untuk verifikasi PCR melacak sejumlah kecil DNA target. Namun, karena
dupleks. Meskipun kit komersial mengkonfirmasi hasil PCR dupleks dan simpleks konvensional di sebagian mahalnya biaya peralatan dan reagen real-time, tidak
besar sampel kami, sensitivitasnya adalah 1% untuk DNA babi, yang lebih rendah dari sensitivitas 0,1% dari semua laboratorium dapat menerapkan metode ini.
metode PCR dupleks semi-kuantitatif kami. Kit komersial mendeteksi DNA babi dengan meningkatkan jumlah Meskipun sensitivitas amplifikasi PCR multipleks diketahui
ekstrak DNA sebanyak 2 atau 5 kali lipat. Pada tahun 2012, Sahilah dkk. membandingkan dua kit berbasis PCR lebih rendah daripada amplifikasi PCR simpleks,
komersial untuk mendeteksi DNA babi dalam kapsul farmasi dan menunjukkan bahwa tingkat deteksi kami menggunakan PCR dupleks yang dioptimalkan kami
menggunakan kit deteksi DNA babi komersial (berdasarkan kuantitatif real-time PCR) untuk verifikasi duplex mencapai tingkat sensitivitas yang sama (0,1%) untuk
PCR. Meskipun kit komersial mengkonfirmasi hasil PCR dupleks dan simpleks konvensional di sebagian besar mendeteksi DNA babi seperti yang kami miliki dengan PCR
sampel kami, sensitivitasnya adalah 1% untuk DNA babi, yang lebih rendah dari sensitivitas 0,1% dari metode simpleks. Di sisi lain, hasil kami sebanding dan bahkan
PCR dupleks semi-kuantitatif kami. Kit komersial mendeteksi DNA babi dengan meningkatkan jumlah ekstrak lebih sensitif daripada yang diperoleh dengan
DNA sebanyak 2 atau 5 kali lipat. Pada tahun 2012, Sahilah dkk. membandingkan dua kit berbasis PCR menggunakan kit PCR real-time yang tersedia secara
komersial untuk mendeteksi DNA babi dalam kapsul farmasi dan menunjukkan bahwa tingkat deteksi kami komersial (hanya deteksi DNA babi bukan sapi). Perlu
menggunakan kit deteksi DNA babi komersial (berdasarkan kuantitatif real-time PCR) untuk verifikasi PCR dicatat bahwa teknik berbasis PCR (batas ukuran produk)
dupleks. Meskipun kit komersial mengkonfirmasi hasil PCR dupleks dan simpleks konvensional di sebagian tidak cocok untuk identifikasi target DNA yang sangat
besar sampel kami, sensitivitasnya adalah 1% untuk DNA babi, yang lebih rendah dari sensitivitas 0,1% dari pendek (15-30 bp), yang dapat bertahan bahkan di bawah
metode PCR dupleks semi-kuantitatif kami. Kit komersial mendeteksi DNA babi dengan meningkatkan jumlah kondisi pemrosesan jaringan yang paling keras [32].
ekstrak DNA sebanyak 2 atau 5 kali lipat. Pada tahun 2012, Sahilah dkk. membandingkan dua kit berbasis PCR Menurut hasil kami, fragmen DNA yang lebih panjang dari
komersial untuk mendeteksi DNA babi dalam kapsul farmasi dan menunjukkan bahwa tingkat deteksi 100 bp dapat dengan mudah diamplifikasi menggunakan
sensitivitas 1% dari metode PCR dupleks semi-kuantitatif kami. Kit komersial mendeteksi DNA babi dengan teknik PCR simpleks dan dupleks konvensional yang
meningkatkan jumlah ekstrak DNA sebanyak 2 atau 5 kali lipat. Pada tahun 2012, Sahilah dkk. membandingkan dijelaskan dalam penelitian ini.
dua kit berbasis PCR komersial untuk mendeteksi DNA babi dalam kapsul farmasi dan menunjukkan bahwa

tingkat deteksi sensitivitas 1% dari metode PCR dupleks semi-kuantitatif kami. Kit komersial mendeteksi DNA

babi dengan meningkatkan jumlah ekstrak DNA sebanyak 2 atau 5 kali lipat. Pada tahun 2012, Sahilah dkk. Kesimpulan
membandingkan dua kit berbasis PCR komersial untuk mendeteksi DNA babi dalam kapsul farmasi dan Dalam studi ini, metodologi PCR dupleks konvensional (semi-
menunjukkan bahwa tingkat deteksi kuantitatif) terbukti menjadi alat yang andal dan sensitif untuk
mendeteksi fragmen DNA babi (lebih dari 100 bp) yang ada
dalam cangkang kapsul gelatin keras dan lunak (bahkan
dalam kapsul yang mengandung obat) dengan sensitivitas
Nikzad dkk. Jurnal Ilmu Farmasi DARU (2017) 25:3
0,1% menggunakan PCR dupleks 35 siklus. Artinya dengan
menggunakan teknik ini, kita dapat mendeteksi sedikitnya
0,1% kontaminasi/pengotor DNA babi dalam kapsul gelatin
sapi. Metodologi yang diusulkan adalah alternatif yang mudah
diikuti, murah, andal, dan sensitif untuk kit deteksi komersial
yang mahal, yang digunakan untuk memantau produk
makanan dan farmasi.
Singkatan
ABI: Instrumen biosistem terapan; ATPase 8: Subunit 8 dari ATP sintase
mitokondria; cytb: Sitokrom b; IC: Pengendalian internal; mtDNA: DNA
mitokondria; NTC: Tidak ada kontrol template (DNA); PC: Kontrol positif; PCR:
Reaksi berantai polimerase; RFLP: Pembatasan panjang fragmen polimorfisme;
TAE: Asam tris–asetat–etilen diamina tetra asetat;
UV: Ultraviolet
Pengakuan
Penulis ingin mengucapkan terima kasih dan persembahkan makalah ini kepada
Dr. Nastaran Nafissi-Varcheh yang telah meninggal dunia.
Pendanaan
Makalah ini berasal dari tesis Pharm.D dari penulis pertama dan didukung
secara finansial oleh School of Pharmacy, Universitas Ilmu Kedokteran
Shahid Beheshti, Teheran, Iran (Hibah no. 6119).
Ketersediaan data dan bahanSilakan
hubungi penulis untuk permintaan data.
Kontribusi penulis
JN menyiapkan sampel dan melakukan ekstraksi DNA. SS berpartisipasi dalam
merancang studi dan interpretasi data. MT (Maryam Tabarzad) berpartisipasi
dalam merancang penelitian, interpretasi data dan membantu menyusun naskah.
NN mengusulkan ide utama proyek ini dan berpartisipasi dalam interpretasi data.
MT (Maryam Torshabi) melakukan eksperimen PCR, mengawasi penelitian dan
menyelesaikan naskah. Semua penulis membaca dan menyetujui naskah akhir.
Kepentingan bersaing
Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki kepentingan yang bersaing.
Persetujuan untuk publikasiTak
dapat diterapkan.
Persetujuan etika
Penelitian ini telah memperoleh persetujuan dari Komite Etika Penelitian
Universitas Ilmu Kedokteran Shahid Beheshti (Nomor Kode:
SBMU2.REC.1394.31).
Detail penulis
1Sekolah Farmasi, Universitas Ilmu Kedokteran Shahid Beheshti, Teheran,
Iran. 2Departemen Kimia Farmasi, Sekolah Farmasi, Universitas Ilmu
Kedokteran Shahid Beheshti, Teheran, Iran. 3Pusat Penelitian Teknologi
Protein, Universitas Ilmu Kedokteran Shahid Beheshti, Teheran, Iran.
4Departemen Bioteknologi Farmasi, Sekolah Farmasi, Universitas Ilmu
Kedokteran Shahid Beheshti, Teheran, Iran. 5Departemen Biomaterial Gigi,
Sekolah Kedokteran Gigi, Universitas Ilmu Kedokteran Shahid Beheshti,
Teheran, Iran.
Diterima: 15 Desember 2016 Diterima: 9 Februari 2017
Referensi
1. Stegemann S, Bornem C. Kapsul gelatin keras hari ini dan besok.
Perpustakaan kapsul. 2002:1–23
2. Liu D, Nikoo M, Boran G, Zhou P, Regenstein JM. Kolagen dan gelatin. Annu
Rev Food Sci Technol. 2015;6:527–57.
3. Venugopal J, Low S, Choon AT, Ramakrishna S. Interaksi sel dan perancah
nanofiber dalam rekayasa jaringan. J Biomed Mater Res B Appl
Biomater. 2008;84(1):34–48.
Halaman 10 dari 11
4. Sahilah Mohd AM, Fadly L, Norrakiah AS, Aminah A, Wan Aida WM, Ma'aruf Mohd
AG, Khan A. Pengawasan pasar halal kapsul gel lunak dan keras pada produk
farmasi menggunakan PCR dan hibridisasi selatan pada analisis biochip . Int
Food Res J. 2012;19(1):371–5.
5. Sudjadi Wardani HS, Sepminarti T, Rohman A. Analisis DNA Gelatin babi dalam
cangkang kapsul komersial menggunakan reaksi berantai polimerase
waktu nyata untuk otentikasi halal. Int J Food Prop. 2016;19(9): 2127–34.
6. Ballin NZ. Otentikasi daging dan produk daging. Ilmu Daging. 2010;
86(3):577–87.
7. Raraswati MA, Triyana K, Rohman A. Diferensiasi gelatin sapi dan gelatin babi
dalam soft candy berdasarkan profil asam amino dan kemometrik.
J Food Farmasi Sci. 2013;2(1):1–6.
8. Shabani H, Mehdizadeh M, Mousavi SM, Dezfouli EA, Solgi T, Khodaverdi M, dkk.
Keaslian halal gelatin menggunakan PCR spesifik spesies. Kimia Makanan.
2015;184:203–6.
9. Grundy HH, Reece P, Buckley M, Solazzo CM, Dowle AA, Ashford D,
dkk. Metode spektrometri massa untuk penentuan spesies asal
gelatin dalam makanan dan produk farmasi. Makanan
Kimia 2016;190:276–84.
10. Flaudrops C, Armstrong N, Raoult D, Chabrière E. Penentuan asal daging
dan gelatin hewani oleh MALDI-TOF-MS. J Kompos Makanan Anal.
2015;41:104–12.
11. Tukiran NA, Ismail A, Mustafa S, Hamid M. Pengembangan uji
imunosorben terkait-enzim antipeptida untuk penentuan gelatin dalam
produk gula-gula. Int J Food Sci Technol. 2016;51(1):54–60.
12. Chen FC, Hsieh YH. Deteksi daging babi dalam produk daging yang diproses panas dengan
ELISA berbasis antibodi monoklonal. J AOAC Int. 2000;83(1):79–85.
13. Masiri J, Benoit L, Barrios-Lopez B, Thienes C, Meshgi M, Agapov A, dkk.
Pengembangan dan validasi sistem uji cepat untuk mendeteksi daging
babi dan residu kolagen. Ilmu Daging. 2016;121:397–402.
14. Hird H, Goodier R, Hill M. Deteksi cepat ayam dan kalkun dalam produk daging yang
dipanaskan menggunakan reaksi berantai polimerase diikuti dengan visualisasi
amplikon dengan vistra green. Ilmu Daging. 2003;65:1117–23.
15. Soares S, Amaral JS, Mafra I, Oliveira MB. Deteksi kuantitatif pemalsuan daging unggas
dengan babi dengan uji PCR dupleks. Ilmu Daging. 2010;85(3):531–6.
16. Boran G, Regenstein JM. Agar-agar ikan. Adv Food Nutr Res. 2010;60:119–43.
17. Hsieh MK, Shih PY, Wei CF, Vickroy TW, Chou CC. Deteksi produk sampingan hewan yang
tidak dideklarasikan dalam makanan kaleng komersial: analisis komparatif dengan ELISA
dan PCR-RFLP yang digabungkan dengan elektroforesis gel slab atau elektroforesis gel
kapiler. J Sci Pangan Pertanian. 2016;96(5):1659–65.
18. Mohamad NA, Mustafa S, El Sheikha AF, Khairil Mokhtar NF, Ismail A, Ali ME.
Modifikasi interaksi gelatin-DNA untuk ekstraksi DNA yang optimal dari
gelatin dan kapsul gelatin. J Sci Pangan Pertanian. 2016;96(7):2344–51.
19. Avise JC. Penanda molekuler, sejarah alam dan evolusi. New York:
Chapman dan Hall; 2012.
20. Montiel-Sosa JF, Ruiz-Pesini E, Montoya J, Roncalés P, LópezPérez MJ, Pérez-
Martos A. Deteksi langsung dan sangat spesifik spesies daging babi dan
lemak dalam produk daging dengan amplifikasi PCR DNA mitokondria. J
Pertanian Makanan Kimia. 2000;48:2829–32.
21. Malik A, Sutantyo ML, Hapsari I, Sinurat AV, Purwati EM, Jufri M, dkk. Identifikasi dan
verifikasi simultan jenis gelatin dalam cangkang kapsul dengan elektroforesis dan
reaksi berantai polimerase. Investigasi J.Pharm. 2016; 46(5):475–85.
22. Cai H, Gu X, Scanlan MS, Ramatlapeng DH, Lively CR. Uji PCR real-time untuk
deteksi dan kuantisasi DNA babi dan sapi dalam campuran gelatin dan
kapsul gelatin. J Kompos Makanan Anal. 2012;25(1):83–7.
23. Mutalib SA, Muin NM, Abdullah A, Hassan O, Mustapha WAW, Sani NA,
dkk. Sensitivitas reaksi berantai polimerase (PCR)-hibridisasi selatan dan
analisis PCR konvensional untuk otentikasi Halal kapsul gelatin. LWT-
Food Sci Technol. 2015;63(1):714–9.
24. Dooley JJ, Paine KE, Garrett SD, Brown HM. Deteksi spesies daging menggunakan uji
TaqMan real-time PCR. Ilmu Daging. 2004;68(3):431–8.
25. Lahiff S, Glennon M, O'Brien L, Lyng J, Smith T, Maher M, dkk. Speciesspecific
PCR untuk identifikasi jenis ovine, porcine dan chicken pada meta and bone
meal (MBM). Probe Sel Mol. 2001;15(1):27–35.
26. Tasara T, Schumacher S, Stephan R. Pendekatan berbasis PCR konvensional
dan real-time untuk deteksi molekuler dan kuantisasi bahan spesies sapi
dalam gelatin yang dapat dimakan. J Makanan Prot. 2005;68(11):2420–6.
27. Tartaglia M, Saulle E, Pestalozza S, Morelli L, Antonucci G, Battaglia PA.
Deteksi DNA mitokondria sapi dalam pakan ternak ruminansia: molekul
Nikzad dkk. Jurnal Ilmu Farmasi DARU (2017) 25:3 Halaman 11 dari 11

pendekatan untuk menguji keberadaan bahan yang berasal dari sapi. J Makanan Prot.
1998;61(5):513–8.
28. Chaudry MM. Hukum makanan Islam: dasar filosofis dan implikasi
praktis: dasar agama dan filosofis pilihan makanan. Teknologi
Pangan. 1992;46(10):92–3.
29. Nakyinsige K, Man YB, Sazili AQ. Masalah keaslian halal dalam daging dan produk
daging. Ilmu Daging. 2012;91(3):207–14.
30. Aziz NA, Majdina H, Hassan Y, Zulkifly HH, Wahab MS, Aziz MS, dkk. Penilaian
status kehalalan produk farmasi pernapasan di rumah sakit. Procedia Soc
Perilaku Sci. 2014;19(121):158–65.
31. Rodriguez MA, Garcia T, González I, Asensio L, Hernandez PE, Martin R. Identifikasi PCR daging
sapi, domba, kambing, dan babi dalam campuran daging mentah dan yang diberi
perlakuan panas. J Makanan Prot. 2004;67(1):172–7.
32. Ali ME, Kashif M, Uddin K, Hashim U, Mustafa S, Man YBC. Metode
otentikasi spesies dalam makanan dan pakan: forensik halal saat ini,
masa lalu, dan masa depan. Metode Anal Makanan. 2012;5(5):935–55.

Kirimkan naskah Anda berikutnya ke BioMed Central dan kami

akan membantu Anda di setiap langkah:

• Kami menerima pertanyaan pra-pengajuan

• Alat pemilih kami membantu Anda menemukan jurnal yang paling relevan

• Kami menyediakan dukungan pelanggan sepanjang waktu

• Pengiriman online yang nyaman

• Tinjauan sejawat yang menyeluruh

• Penyertaan dalam PubMed dan semua layanan pengindeksan utama

• Visibilitas maksimum untuk penelitian Anda

Kirimkan naskah Anda di

www.biomedcentral.com/submit