Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Bab 15

humanisasi dan afinitas antibodi

Pematangan Menggunakan Tampilan Phage

Jonathan S. Marvin dan Henry B. Lowman

Isi

15.1 Pendahuluan ................................................... ................................................................... 347

15.2 Humanisasi Menggunakan Tampilan Phage .................................................. ................ 350
15.2.1 Pilihan Perancah Manusia .................................................. .................... 351
15.2.2 Desain Perpustakaan Humanisasi ......................................... ........ 351
15.2.3 Optimalisasi Lebih Lanjut dari Antibodi yang Dimanusiakan ............... 352
15.3 Pematangan Afinitas Antibodi In Vitro.............................................. ....... 355
15.3.1 Ukuran Pustaka ................................................... ........................................ 358
15.3.2 Posisi Penargetan untuk Mutagenesis Acak .................................. 359
15.3.3 Metode Mutagenesis............................................ ......................... 361
15.3.4 Keanekaragaman dan Degenerasi Kodon ......................................... .......... 363
15.3.5 Metode Seleksi Antigen-Binding ........................................ ......364
15.3.6 Hasil Penggabungan dari Pustaka Terpisah ........................................ 365
15.3.7 Format Antibodi.................................................. .................................. 366
15.4 Pendekatan yang Muncul ................................................... ................................... 367
15.5 Kesimpulan........................................................ ................................................................... .367
Referensi ................................................. ................................................................... ........... 368

15.1 PENDAHULUAN

Tiga perkembangan signifikan dalam biologi molekuler telah menjadi pusat dalam
mempromosikan peran antibodi yang berkembang sebagai alat untuk penelitian biokimia dan biologi
dan sebagai kelas molekul yang signifikan untuk pengembangan obat. Pertama, mengikuti
pembentukan metode yang andal untuk menghasilkan afinitas tinggi, spesifisitas tinggi

347
348 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

antibodi monoklonal dari respon imun alami tikus dan spesies lain [1], teknik DNA
rekombinan telah memungkinkan untuk mengisolasi DNA komplementer (cDNA) yang
sesuai yang mengkode antibodi ini, menentukan urutannya, dan dengan bantuan
informasi struktural, mengoptimalkan antibodi tersebut. sifat pengikatan antigen melalui
manipulasi gen mereka. Kedua, pendekatan kombinatorial untuk rekayasa protein seperti
tampilan fag [2] telah memungkinkan untuk mengeksplorasi lebih banyak varian antibodi
daripada yang biasanya dapat diakses dalam pendekatan mutagenesis terarah-situs.
Ketiga, penjelasan struktur molekul resolusi tinggi antibodi telah mengungkapkan
beberapa fitur umum yang diperlukan untuk stabilitas struktural dan pengenalan antigen
[3,4]. Pendekatan ini tidak hanya menyediakan sarana untuk optimasi cepat sifat
pengikatan antigen antibodi yang ada seperti yang dibahas dalam bab ini tetapi juga
sarana untuk penemuan kekhususan antibodi baru dari sumber keanekaragaman yang
diimunisasi, tidak diimunisasi (naif), atau sintetis. Humanisasi antibodi bukan manusia
dan pematangan afinitas antibodi dari hibridoma atau sumber keragaman-library adalah
dua bidang optimasi antibodi yang seringkali paling efisien ditangani menggunakan
tampilan antibodi-fag.
Secara umum, tampilan antibodi pada fag mirip dengan yang dijelaskan untuk
protein lain. Tampilan polivalen mungkin berguna untuk identifikasi antibodi pengikat
antigen dari perpustakaan naif antibodi-fag [5]. Namun, tampilan monovalen dapat
menawarkan keuntungan dengan mengurangi efek aviditas selama pemilihan
pengikatan antigen [6,7]. Dua format yang disukai telah digunakan untuk menampilkan
domain variabel antibodi pada fag, seringkali dalam bentuk vektor fag [7-9]: (1) Fab-fag,
di mana variabel (VH) dan konstanta pertama (CH1) domain rantai berat menyatu dengan
sebagian genAKU AKU AKU protein (gIIIp) dari fag berfilamen, sedangkan domain
variabel (VL) dan konstanta (CL) dari rantai ringan diekspresikan sebagai rantai larut dari
vektor yang sama, menghasilkan ekspresi fragmen pengikatan antigen lengkap (Fab),
dan (2) fragmen variabel “rantai tunggal” (scFv)-fag, di mana domain VL dan VH
dihubungkan dan digabungkan ke bagian gIIIp sebagai polipeptida tunggal,
menghasilkan ekspresi scFv. Keuntungan dari metode sebelumnya mungkin untuk
mempertahankan bentuk monomer antibodi untuk seleksi pengikatan yang lebih efisien
(Bagian 15.3.7), sedangkan keuntungan dari yang terakhir adalah pembentukan diabodi
[10], yang dapat meningkatkan aviditas ( afinitas nyata) di bawah kondisi yang sesuai,
yang mengarah ke pemulihan pengikat afinitas rendah yang lebih efisien [6,7].
Pada bagian pertama bab ini, kami menjelaskan penerapan tampilan fag
pada humanisasi, seringkali merupakan langkah kunci dalam proses konversi
antibodi monoklonal dari spesies nonmanusia menjadi kandidat obat farmasi.
Kebutuhan akan humanisasi disorot oleh pengalaman klinis awal dengan
antibodi murine dan chimeric (yaitu, mengandung variabel murine dan domain
konstan manusia). Respon imunogenik pada manusia terhadap antibodi yang
berasal dari spesies lain memiliki potensi untuk membuat antibodi terapeutik
tidak efektif setelah pemberian dosis awal dan, lebih buruk lagi, dapat
menimbulkan reaksi hipersensitivitas yang berpotensi fatal (anafilaksis).
Transplantasi seluruh domain variabel ke perancah antibodi dari domain
konstan manusia, menghasilkan antibodi chimeric (Gambar 15.1), tidak
menghilangkan potensi antibodi antiframework. Sebagai contoh,
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge 349

Manusia murine

CDR-swap IgG Chimeric

Ag-
mengikat

Hebat-
Manusiawi
fag fag-fag

Ag-
mengikat

Manusiawi fag-fag
dewasa CDR
fag-fag

IgG yang dimanusiakan dan matang

Gambar 15.1 strategi untuk menggunakan tampilan fag dalam humanisasi dan pematangan afinitas
antibodi. Daerah antibodi yang diturunkan dari murine ditampilkan sebagai domain
berbayang; domain antibodi manusia ditampilkan sebagai domain terbuka. Residu murine
yang dipilih dari pustaka wilayah kerangka (Fr) digambarkan sebagai titik abu-abu, dan
mutasi yang dioptimalkan yang dipilih dari pustaka wilayah penentu komplementaritas (CDr)
digambarkan sebagai titik hitam. enam CDr ditunjukkan sebagai enam baris dalam domain
variabel (Vh dan VL) antibodi.

wilayah variabel [11], yang juga berasal dari murine dalam antibodi chimeric (Gambar 15.1). Antibodi antimanusia tikus yang

diarahkan ke antigen CAMPATH-1 juga terbukti imunogenik pada manusia, dan ini akhirnya diatasi melalui humanisasi [12,13].

Meskipun tikus transgenik yang memproduksi imunoglobulin manusia juga merupakan sumber antibodi monoklonal untuk

pengembangan terapeutik, humanisasi tetap merupakan upaya rekayasa antibodi yang penting karena kekhususan antibodi yang

luar biasa dan berbeda yang berasal dari berbagai sumber. Perbedaan tersebut dapat diterjemahkan ke dalam perbedaan

dramatis dalam aktivitas biologis untuk molekul yang dipertimbangkan untuk pengembangan obat. Memang, antibodi yang

diturunkan dengan cara yang berbeda mungkin sering berbeda dalam spesifisitasnya yang baik untuk epitop pada antigen

tertentu dan karenanya dalam efek biologisnya, seperti memblokir antigen dari reseptor yang mengikat atau mengikat silang

reseptor permukaan sel untuk menginduksi aktivitas agonis; lihat, misalnya, Ref. [14] dan [15]. Humanisasi oleh tampilan fag

mewakili kasus khusus pematangan afinitas in vitro di mana hanya residu yang dipilih dan sering kali tidak berhubungan dengan

antigen diubah untuk mengoptimalkan aktivitas, sambil menghadirkan epitop (atau paratope) pengikat antigen esensial dalam

konteks kerangka manusia dan daerah konstan. Antibodi manusiawi yang berasal dari hibridoma murine parental seperti anti-

HER2 seringkali residu yang tidak berhubungan dengan antigen diubah untuk mengoptimalkan aktivitas, sambil menghadirkan

epitop (atau paratope) pengikat antigen esensial dalam konteks kerangka manusia dan wilayah konstan. Antibodi manusiawi yang

berasal dari hibridoma murine parental seperti anti-HER2 seringkali residu yang tidak berhubungan dengan antigen diubah untuk

mengoptimalkan aktivitas, sambil menghadirkan epitop (atau paratope) pengikat antigen esensial dalam konteks kerangka

manusia dan wilayah konstan. Antibodi manusiawi yang berasal dari hibridoma murine parental seperti anti-HER2
350 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

[16], anti-IgE [17], anti-CD11a [18], dan anti-VEGF dalam bentuk IgG [19] dan Fab yang
matang afinitas [20] menunjukkan keberhasilan dalam uji klinis dan sebagai terapi yang
dipasarkan.
Di bagian kedua bab ini, kita membahas pematangan afinitas, yang, bersama dengan
humanisasi, dapat dilihat sebagai bagian dari proses terpadu optimasi antibodi (Gambar
15.1). Antibodi yang berasal dari sumber manusia, bukan manusia, atau sintetis dapat
mengambil manfaat dari optimalisasi untuk pengikatan antigen melalui substitusi pada
posisi di dalam dan di luar rangkaian posisi kontak antigen. Ini sering disebut
"pematangan afinitas in vitro" dengan analogi proses pematangan afinitas alami,
termasuk rekombinasi dan hipermutasi somatik, selama pematangan respon imun
adaptif pada vertebrata. Sebagaimana diterapkan pada antibodi terapeutik, motivasi
untuk jenis rekayasa antibodi ini mungkin mencakup kebutuhan untuk meningkatkan
potensi dan kemanjuran. Namun, relevan dengan terapi serta diagnostik, reagen, atau
penggunaan antibodi dalam industri, motivasi untuk pematangan afinitas juga dapat
mencakup pertimbangan biaya barang, kapasitas produksi, sensitivitas pengujian, atau
efisiensi katalitik. Di bagian kedua bab ini, kami mempertimbangkan pendekatan
pematangan afinitas untuk antibodi manusia, manusiawi, atau bukan manusia.

15.2 HUMANISASI MENGGUNAKAN PHAGE DISPLaY

Humanisasi antibodi yang berasal dari tikus atau spesies lain adalah proses optimasi
di mana karakteristik pengikatan antigen esensial dari antibodi monoklonal induk
(seringkali IgG murine) ditransfer ke antibodi “scaffold” manusia—yaitu, imunoglobulin
dengan konstanta (CL, CH1-CH2-CH3) dan variabel (VL, VH) kerangka wilayah (FRs) yang
berasal dari gen manusia (Gambar 15.1). Prosesnya biasanya melibatkan penggantian
enam wilayah penentu komplementaritas (CDR) dari antibodi manusia dengan yang
berasal dari antibodi induk. Terlepas dari homologi FR manusia dan bukan manusia
(misalnya, tikus atau tikus), "pertukaran CDR" langsung ini tidak selalu menghasilkan
antibodi fungsional dengan afinitas pengikatan antigen yang sama yang diamati untuk
orang tua [21]. Studi struktural antibodi menyarankan bahwa beberapa residu kunci
dalam FR dari domain variabel antibodi dapat sangat mempengaruhi konformasi loop
CDR dalam perancah yang diberikan. Memang, substitusi yang tepat dari residu orang
tua untuk residu manusia pada posisi ini dapat mengembalikan pengikatan dan aktivitas
antigen [3,12,22-24]. Humanisasi antibodi melalui mutagenesis spesifik lokasi berbasis
struktur telah dijelaskan dan ditinjau di tempat lain [25]. Upaya-upaya ini seringkali
memerlukan penyelidikan sejumlah mutasi titik yang relatif kecil; namun, karena efek
kombinasi mutasi dalam kerangka tidak selalu aditif, lebih banyak varian mungkin perlu
diuji untuk menghasilkan antibodi manusiawi dengan aktivitas serupa dengan antibodi
induk. Tampilan phage menyediakan alat untuk pembuatan perpustakaan keragaman
yang mudah dan cukup besar untuk mencakup banyak posisi kerangka kerja yang telah
ditemukan sebagai kunci untuk mencapai humanisasi. Antibodi yang dimanusiakan
kemudian dapat dipilih untuk mengikat antigen dari perpustakaan yang diacak untuk
mengandung residu orang tua (bukan manusia) atau manusia pada posisi ini (Gambar
15.1).
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge 351

15.2.1 Pilihan Perancah manusia

Beberapa pendekatan untuk pemilihan perancah untuk humanisasi telah dijelaskan.

Secara umum, ini dapat dikelompokkan sebagai berikut: (1) pemilihan perancah wilayah
variabel umum, misalnya, subkelompok III VH, subkelompok I VL kappa untuk
pencangkokan CDR, dan mutasi FR berikutnya [26,27]; (2) pemilihan wilayah FR variabel
manusia yang spesifik antibodi dengan urutan yang mirip dengan antibodi nonmanusia
asli, diikuti oleh mutasi FR spesifik [28]; dan (3) pembangunan perpustakaan variabel-
wilayah (mewakili keragaman garis germinal manusia keluarga VH dan VL) dengan
keragaman sintetis tambahan pada posisi kerangka kunci [29].
Pendekatan lain telah meninggalkan pemilihan FR inti yang mendukung hanya "pelapisan
ulang" antibodi induk dengan residu yang ditemukan pada permukaan antibodi manusia,
gagasannya adalah bahwa residu yang terpapar pelarut cenderung mendominasi reaksi
imunogenik [30]. Pendekatan lain yang menarik melibatkan murni strategi pengocokan domain
di mana domain VH dari antibodi induk pertama-tama digabungkan secara acak dengan
pustaka VL manusia dan dipilih untuk pengikatan antigen; setelah itu, domain VL manusia yang
dihasilkan juga diacak dengan pustaka domain VH manusia [31]. Meskipun jelas berhasil dalam
beberapa kasus, pendekatan ini mungkin tidak efisien secara umum dalam pelestarian epitop
antibodi orang tua [29], motivasi yang jelas untuk humanisasi yang bertentangan dengan
penemuan antibodi baru.
Di sini, kami fokus pada pendekatan perancah umum untuk humanisasi, dengan
pengacakan pada satu set kecil residu kerangka kerja untuk memberikan determinan struktural
yang diperlukan untuk presentasi CDR untuk memberikan pengenalan antigen. Pendekatan ini
menawarkan beberapa keuntungan dalam pengembangan antibodi terapeutik [16]. Pertama,
keluarga subkelompok II VH rantai berat dan subkelompok I rantai ringan VL kappa banyak
terwakili dalam repertoar manusia. Yang pasti, antibodi antimanusia telah ditemukan pada
manusia, dan bahkan antibodi antimanusia-CDR telah diketahui; namun, imunogenisitas dapat
diminimalkan dengan memilih famili garis germinal yang paling banyak diwakili sebagai
perancah humanisasi. Pengalaman klinis dengan antibodi anti-HER2, anti-IgE, anti-CD11a, dan
anti-VEGF telah membuktikan bahwa imunogenisitasnya memang rendah, mendukung
penggunaan perancah ini. Penggunaan perancah tunggal juga memfasilitasi humanisasi
antibodi baru karena CDR baru dapat dimodelkan ke perancah awal yang sama. Akhirnya,
ekspresi dan formulasi protein dan pengalaman klinis dengan perancah yang diberikan dalam
konteks berbagai indikasi menyediakan basis data yang berkembang untuk meningkatkan
pengembangan antibodi terapeutik dengan sifat kimia dan fisik yang serupa.

15.2.2 Desain Perpustakaan humanisasi

Karena humanisasi biasanya dapat dicapai dengan menukar residu kerangka kerja induk
dengan residu yang ditemukan dalam perancah manusia, keragaman pustaka kerangka kerja
yang dirancang untuk humanisasi, pada prinsipnya, dapat dibatasi pada keragaman ganda
pada setiap posisi acak (Tabel 15.1)—mengkodekan kerangka induk residu atau residu manusia
[27]. Di sisi lain, pengacakan yang sedikit lebih beragam dapat menghasilkan residu FR
alternatif yang juga mengembalikan pengikatan antigen [27].
352 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

tabel 15.1 Kumpulan khas Kodon Keragaman Terbatas untuk Pustaka Framework region (Fr)
antibodi yang Ditampilkan Phage dalam humanisasi antibodi

Rantai Konsensus kodon Degenerasi residuA

VL M4 MTg Atg, Ctg M, L
VL F71 tyC ttC, tAC F, kamu

Vh A24 ryC gCt, ACt, gtC, AtC A, t, V, i

Vh V37 rtC gtC, AtC V, saya

Vh F67 nyC AtC, gtC, CtC, ttC, ACC, i, V, L, F, t, A, p, s

gCC, CCC, tCC
Vh i69 WtC AtC, ttC Saya, F

Vh r71 CKC CgC, CtC R, L

Vh D73 rMC gAC, ACC, AAC, gCC D, t, n, A
Vh K75 rMg AAg, gCg, ACg, gAg K, A, t, e
Vh n76 Busur AAC, AgC n, S
Vh L78 syg Ctg, gCg, gtg, CCg L, A, V, p
Vh A93 Dig Atg, gtg, ttg, tCg, ACt, M, A, V, L, s, t
gCg
Vh r94 Arg AAg, Agg R, K
A pengacakan bergambar memiliki 1,6 × 106 keragaman dan mirip dengan yang dijelaskan dalam
humanisasi murine A4.6.1; namun, skema lain dimungkinkan [27]. residu Fr murine yang ditemukan
di A4.6.1 digarisbawahi.

Humanisasi antibodi menggunakan tampilan fag dilaporkan untuk antibodi VEGF antimanusia murine A4.6.1

menggunakan pendekatan perancah umum [27], dan metodologi yang dijelaskan untuk antibodi ini menggambarkan

langkah-langkah dasar dalam humanisasi menggunakan tampilan fag. Sebagai titik awal untuk perpustakaan yang

ditampilkan fag, CDR antibodi murine dimasukkan sebagai pengganti CDR kerangka konsensus manusia untuk

menghasilkan varian hu2.0 (Gambar 15.2). Bentuk Fab dari antibodi ini ditampilkan secara monovalen pada fag

menggunakan konstruksi fagemid di mana domain VH-CH1 rantai berat dikaitkan dengan domain terminal-C gIIIp, dan
domain VL-CL rantai ringan diekspresikan sebagai protein dari fagmid yang sama. Dibandingkan dengan bentuk

chimeric murine-manusia dari A4.6.1, varian humanisasi swap CDR setidaknya 4000 kali lipat berkurang dalam afinitas

pengikatan ke VEGF [27]. Mengikuti pilihan pengikatan VEGF dengan perpustakaan yang diacak secara selektif pada 13

posisi kerangka kerja, varian yang dimanusiakan (disebut hu2.10) dipilih untuk mengikat VEGF dengan afinitas sekitar

enam kali lipat lebih lemah daripada antibodi chimeric A4.6.1. Dibandingkan dengan konstruksi CDR swap asli, hu2.10

berisi substitusi yang dipilih (termasuk dua yang bukan berasal dari manusia atau murine) hanya pada delapan posisi

kerangka kerja: VL 71 dan VH 37, 71, 73, 75, 76, 78, dan 94 ; lihat Gambar 15.2. Dibandingkan dengan konstruksi CDR

swap asli, hu2.10 berisi substitusi yang dipilih (termasuk dua yang bukan berasal dari manusia atau murine) hanya

pada delapan posisi kerangka kerja: VL 71 dan VH 37, 71, 73, 75, 76, 78, dan 94 ; lihat Gambar 15.2. Dibandingkan

dengan konstruksi CDR swap asli, hu2.10 berisi substitusi yang dipilih (termasuk dua yang bukan berasal dari manusia

atau murine) hanya pada delapan posisi kerangka kerja: VL 71 dan VH 37, 71, 73, 75, 76, 78, dan 94 ; lihat Gambar 15.2.

15.2.3 Optimalisasi Lebih Lanjut dari antibodi yang dimanusiakan

Sementara pendekatan pustaka kerangka berhasil menghasilkan peningkatan >400 kali

lipat dalam afinitas pengikatan antigen dibandingkan dengan pertukaran CDR sederhana [27],
varian afinitas lebih tinggi dari anti-VEGF A4.6.1 yang dimanusiakan diidentifikasi melalui
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge 353

(A)

Gambar 15.2 urutan daerah variabel dari kappa manusia (a) subkelompok rantai ringan i
konsensus dan empat versi A4.6.1, antibodi VegF antimanusia. urutan pertama
adalah antibodi murine A4.6.1. urutan kedua sesuai dengan urutan konsensus
manusia untuk subkelompok Vh iii dan subkelompok VL i [32]. urutan ketiga,
hu2.0, mewakili versi swap CDr yang digunakan sebagai titik awal untuk pustaka
yang ditampilkan phage. urutan keempat, hu2.10, sesuai dengan urutan akhir
yang diturunkan dari fag. urutan kelima, Fab-12 [19] sesuai dengan antibodi
manusiawi akhir (dikenal dalam bentuk igg sebagai Avastin), termasuk
perubahan yang dilakukan setelah humanisasi fag. urutan keenam sesuai
dengan Fab-12 yang matang afinitas [20] dan juga dikenal sebagai Lucentis™.
urutan ketujuh sesuai dengan versi peningkatan on-rate [33]. sistem
penomorannya adalah Kabat et al. [32] dan ditunjukkan untuk menunjukkan
batas-batas dari Frs. CDr sebagaimana didefinisikan oleh kombinasi
hipervariabilitas urutan dan data struktural (lihat teks untuk detailnya)
ditampilkan dalam tanda kurung. Mutasi dalam urutan setiap versi yang
dimanusiakan dibandingkan dengan urutan sebelumnya digarisbawahi. Residu
kerangka yang sering diubah selama humanisasi antibodi lain pada perancah ini
[16-19] digarisbawahi ganda dalam urutan konsensus manusia.
(Lanjutan)
354 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

(B)

Gambar 15.2 (Lanjutan) urutan wilayah variabel dari konsensus subkelompok rantai berat
kappa manusia (b) iii dan empat versi A4.6.1, antibodi VegF
antimanusia. urutan pertama adalah antibodi murine A4.6.1.
urutan kedua sesuai dengan urutan konsensus manusia untuk
subkelompok Vh iii dan subkelompok VL i [32]. urutan ketiga, hu2.0,
mewakili versi swap CDr yang digunakan sebagai titik awal untuk
pustaka yang ditampilkan phage. urutan keempat, hu2.10, sesuai
dengan urutan akhir yang diturunkan dari fag. urutan kelima,
Fab-12 [19] sesuai dengan antibodi manusiawi akhir (dikenal dalam
bentuk igg sebagai Avastin), termasuk perubahan yang dilakukan
setelah humanisasi fag. urutan keenam sesuai dengan afinitas-
matang Fab-12 [20] dan juga dikenal sebagai Lucentis™. urutan
ketujuh sesuai dengan versi peningkatan on-rate [33]. sistem
penomorannya adalah Kabat et al. [32] dan ditunjukkan untuk
menunjukkan batas-batas dari Frs. CDr sebagaimana didefinisikan
oleh kombinasi hipervariabilitas urutan dan data struktural (lihat
teks untuk detailnya) ditampilkan dalam tanda kurung. Mutasi
dalam urutan setiap versi yang dimanusiakan dibandingkan
dengan urutan sebelumnya digarisbawahi. Residu kerangka yang
sering diubah selama humanisasi antibodi lain pada perancah ini
[16-19] digarisbawahi ganda dalam urutan konsensus manusia.
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge 355

pemodelan molekul dan mutasi titik tambahan [19]. Secara khusus, antibodi manusiawi
Fab-12 menunjukkan afinitas pengikatan antigen dalam dua kali lipat dari afinitas
chimeric A4.6.1. Antibodi ini, dalam bentuk full-length humanized IgG1, dikenal sebagai
Avastin™ (Gambar 15.2) dan sedang dipelajari untuk pengobatan tumor padat [34].
Pada akhirnya, pendekatan pematangan afinitas seperti yang dijelaskan dalam Bagian 15.3 dapat
digunakan untuk mendapatkan afinitas tertinggi untuk antigen pada epitop tertentu. Seperti yang
dibahas dalam Bagian 15.3, pendekatan ini, serta desain berbasis struktur, telah diterapkan untuk
pengoptimalan lebih lanjut dari antibodi anti-VEGF A4.6.1 yang dimanusiakan (Gambar 15.2).

15.3 Maturasi AFINITAS IN VItrO ANTIBODI

Afinitas, atau kekuatan pengikatan, protein apa pun untuk ligannya, menurut definisi,
rasio keseimbangan antibodi dan ligan yang tidak terikat dengan kompleks. Konstanta
kesetimbangan termodinamika dapat ditentukan dengan hubungan konsentrasi
komponen reaksi pengikatan yang diukur pada kesetimbangan (lihat Referensi [35] dan
[36]) atau dengan mengukur konstanta laju asosiasi dan disosiasi sebelum
kesetimbangan menggunakan metode seperti resonansi plasmon permukaan (SPR) [37].
Asosiasi fragmen pengikat antigen monomer (Ab) dari antibodi dengan antigen (Ag)
dapat dijelaskan dengan persamaan kimia berikut Persamaan 15.1:

Ab + Ag ⇆ Tas (15.1)

Untuk interaksi fragmen Fab antibodi dengan antigen serumpunnya, kita dapat
menghitung konstanta kesetimbangan (disosiasi), KD, sebagai fungsi dari konsentrasi kompleks
Fab, antigen, dan Fab-antigen pada kesetimbangan ([Ab], [Ag], dan [Ab · Ag], masing-masing),
menurut Persamaan 15.2:

[Tas]
KD = (15.2)
[Ab ⋅ Ag]

Ketika konsentrasi komponen dinyatakan dalam satuan molar (nM, pM, dll.), terlihat
bahwa KD memiliki satuan konsentrasi dan KD menurun (mendekati nol) sebagai interaksi
antibodi-antigen menjadi lebih ketat (yaitu, komponen yang lebih kompleks dan kurang
bebas pada keseimbangan).
Pendekatan kinetik juga memungkinkan perhitungan konstanta disosiasi kesetimbangan
melalui mekanika statistik (lihat Ref. [37]) menggunakan Persamaan 15.3:

KD = kD/kA (15.3)

Di Sini, kA mewakili konstanta laju asosiasi untuk pembentukan kompleks antigen-

antibodi (sering dinyatakan dalam satuan M1 S1 untuk reaksi dua komponen), dan kD
mewakili konstanta laju untuk disosiasi kompleks (sering dinyatakan dalam satuan s1).
Karenanya,KD lagi memiliki unit konsentrasi dan menurun sebagai interaksi antibodi-antigen
menjadi lebih ketat (yaitu, asosiasi lebih cepat atau disosiasi lebih lambat).
356 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

Setiap pengukuran afinitas pengikatan termodinamika juga harus mempertimbangkan stoikiometri.

Interaksi domain Fab tunggal dengan antigen serumpunnya umumnya mewakili interaksi protein-protein 1:1
atau “monovalen” di mana Persamaan 15.1 berlaku. Namun, untuk protein divalen, seperti antibodi full-length
atauluar biasa2, fragmen dengan dua situs penggabungan antigen, afinitas yang diamati sangat bergantung
pada kondisi di mana konstanta pengikatan diukur. Dalam situasi di mana afinitas ditentukan dengan
mengukur pengikatan antibodi ke permukaan yang dilapisi dengan antigen, seperti SPR, enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA), fluorescence-activated cell sorting (FACS), atau whole-cell binding assays,
afinitas yang diamati dapat ditingkatkan secara signifikan oleh efek aviditas, karena disosiasi simultan dari
kedua daerah pengikatan antigen dari antigen yang diimobilisasi permukaan lebih jarang terjadi daripada
peristiwa disosiasi tunggal [38,39]. Efek ini bisa sangat menguntungkan untuk antibodi yang mengikat antigen
yang terikat membran. Faktanya, penelitian signifikan telah difokuskan pada pemanfaatan efek aviditas
dengan menghasilkan antibodi polivalen dengan empat, enam, atau delapan daerah pengikatan antigen [40].
Namun, karena efek aviditas sangat bergantung pada kondisi pengujian [38,39], kita akan membahas
penentuan afinitas di sini dalam konteks afinitas pengikatan 1:1 dari situs penggabungan antigen antibodi
dengan situs tunggal pada antigennya. Pengukuran interaksi monovalen ini dapat dilakukan dalam konteks
IgG bivalen jika dilakukan dengan hati-hati untuk mencegah interaksi bivalen; lihat, misalnya, Ref. [37].
Pengukuran interaksi monovalen ini dapat dilakukan dalam konteks IgG bivalen jika dilakukan dengan hati-
hati untuk mencegah interaksi bivalen; lihat, misalnya, Ref. [37]. Pengukuran interaksi monovalen ini dapat
dilakukan dalam konteks IgG bivalen jika dilakukan dengan hati-hati untuk mencegah interaksi bivalen; lihat,
misalnya, Ref. [37].

Dalam sebagian besar aplikasi klinis antibodi, pembentukan kompleks antara antibodi dan
antigen serumpunnya sangat penting jika tidak identik dengan aktivitasnya. Bidang
pematangan afinitas in vitro telah dikembangkan untuk meningkatkan potensi dan kemanjuran
banyak antibodi manusia, manusiawi, dan nonmanusia generasi pertama yang mungkin
dibatasi oleh afinitas pengikatan antigen. Peningkatan afinitas pengikatan yang diukur secara
in vitro telah terbukti bermanfaat untuk potensi in vivo [41].
Selama pematangan afinitas in vitro, antibodi mengalami mutagenesis dan seleksi dengan
harapan bahwa antibodi yang "ditingkatkan" terletak di dekat antibodi induk dalam ruang urutan.
Karena tidak mungkin untuk mengambil sampel semua urutan potensial, upaya ekstensif telah
difokuskan pada pengembangan metode untuk membangun perpustakaan yang lebih efisien dan
metode yang lebih baik untuk memilih pengikat afinitas tinggi dari mereka. Di sini, kami meninjau
literatur tentang pematangan afinitas in vitro menggunakan tampilan fag (Tabel 15.2), serta teknik
tampilan lainnya, termasuk tampilan permukaan sel dan tampilan ribosom, dan membandingkan
strategi dan metode yang digunakan.
Dalam merancang eksperimen pematangan afinitas in vitro, pertimbangan utama adalah
seberapa besar perpustakaan dapat dan seharusnya; posisi asam amino mana yang harus
diacak (posisi spesifik, satu CDR tertentu, semua CDR, hanya rantai berat atau ringan); dengan
teknik apa keragaman genetik akan dihasilkan (mutagenesis terarah oligonukleotida, reaksi
berantai polimerase rawan kesalahan [PCR], pengocokan DNA); dan berapa banyak keragaman
asam amino yang diperbolehkan pada setiap posisi acak (semua 20 asam amino, hanya residu
hidrofilik, hanya asam amino yang dihasilkan dari mutasi titik tunggal). Selain itu, kita harus
mempertimbangkan format struktural untuk tampilan antibodi (Fab, scFv) dan bagaimana
perpustakaan akan dipilih (atau "digeser") untuk pengikat afinitas lebih tinggi (pengikatan dan
penangkapan larutan, antigen amobil).
tabel 15.2 laporan in Vitro affinity Maturation Disurvei dalam ulasan ini

Maksimum Maksimum
Mulai akhir ditingkatkan Menampilkan Mutagen Mutan teoretis sampel
referensi antigen KD (nM) KD (nM) (melipat) Format metode penargetan Perbedaan Perbedaan

[42] FluoresceinA 0,3 4,8 × 105 6250 scFv Campuran acak tidak ada 2 × 107
[43] dia2 16 0,013 1231 scFv oligo Fungsi 5,1 × 1011 1 × 107
[44] gp120 6.3 0,015 420 luar biasa oligo CDr 6,4 × 107 6,7 × 107
[45] iL-1β 0,5 0,050 10 luar biasa oligo CDr 1,2 × 102 1,6 × 105
[20] sayuranF 13 0.11 118 luar biasa oligo struktur 3,2 × 106 3,2 × 106
[46] gp120 2 0.2 10 scFv Pengocokan rantai CDr tidak ada 3 × 106
[47] mesothelin 11 0.2 55 scFv oligo CDrC 8 × 103 8 × 103
[48] DigoksinB 0.9 0,3 3 scFv oligo struktur 1,6 × 105 1,6 × 105
[49] αvβ3 28 0,3 92 luar biasa oligo CDr 2,6 × 103 2,6 × 103
[50] epCam 6 0.4 15 scFv Pengocokan rantai acak tidak ada 6 × 107
[51] phox 320 1.1 291 scFv Pengocokan rantai CDr tidak ada 2.2 × 106
[52] Fibronektin 110 1.1 100 scFv oligo CDr tidak ada tidak ada

[53] misalnya Fr viiii 9 2 5 scFv oligo CDr 8 × 103 8 × 103

[54] menggigit-kaproik 42 9 5 scFv pCrD acak tidak ada 4 × 104
[55] glikoforin 48,000 100 480 scFv Strain mutator acak tidak ada 1 × 1013
[56] pres1 dari hbV 8000 230 35 scFv Pengocokan rantai acak tidak ada 3,2 × 108
[57] Ars 3600 600 6 luar biasa oligo Fungsi 400 400
[58] Antigen Lewisy 9900 700 14 luar biasa oligo CDr tidak ada 1 × 108
[59] progesteron 30.000 1000 30 Luar biasa scFv pCrD acak tidak ada 5 × 106
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge

A tampilan permukaan ragi.

B tampilan permukaan bakteri.
C menggunakan hot spot DNA untuk menargetkan mutagenesis.
D menggunakan pCr rawan kesalahan untuk mutagenesis.
357
358 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

preS1 dari HBV

Progesteron
insulin sapi
Faktor jaringan

NIP-kaproik
Fluorescein

Fibronektin
mesothelin

Glikoforin
EGFR VIII
Digoksin

EpCam

LewisY
GCN4

phOx
VEGF
gp120

gp120
DIA2

IL-1B

αvβ3

Ars
1.0E-04

1.0E-05

1.0E-06

1.0E-07

1.0E-08
KD (M)

1.0E-09

1.0E-10

1.0E-11

1.0E-12

1.0E-13

1.0E-14

Gambar 15.3 hasil pematangan afinitas antibodi sangat bervariasi, baik dalam afinitas
keseluruhan (48 fM untuk fluorescein-biotin, 1 M untuk progesteron) dan
besarnya peningkatan (6250 kali lipat untuk fluorescein-biotin, 3 kali lipat untuk
digoxin). (Dikompilasi dari boder et al.,Proc Natl Acad Sci USA, 97: 10701–10705 ,
2000; Putri ps dkk.,Protein Inggris, 11:825–832, 1998; gram h dkk.,Proc Natl Acad
Sci USA, 89: 3576–3580 , 1992.)

Seperti yang terlihat pada Gambar 15.3, keberhasilan dalam pematangan afinitas in vitro
antibodi yang dilaporkan menjangkau berbagai afinitas absolut (dari 1 M hingga 48 fM) dan
peningkatan relatif dalam afinitas (dari peningkatan 2 hingga 6250 kali lipat). Afinitas awal
antibodi ini untuk antigennya berkisar dari subnanomolar hingga hampir 50 M, dengan contoh
peningkatan ratusan kali lipat di setiap rentang afinitas (Tabel 15.2). Dengan lebih dari 20
laporan studi pematangan afinitas antibodi, kita dapat mulai membandingkan pendekatan dan
metode eksperimental untuk efektivitasnya dalam mengidentifikasi antibodi yang mengikat
lebih ketat.

15.3.1 Ukuran Perpustakaan

Masalah utama dalam pematangan afinitas menggunakan keragaman kombinatorial

adalah untuk secara efisien memilih dari antara jumlah astronomis dari urutan asam amino
yang mungkin setidaknya satu urutan yang optimal untuk aplikasi tertentu. Disimpulkan bahwa
kemungkinan menemukan pengikat yang lebih baik akan meningkat dengan jumlah urutan
sampel [60]. Meskipun ada keuntungan yang jelas untuk mengambil sampel lebih banyak
ruang urutan, perpustakaan yang lebih besar tidak menjamin bahwa pengikat dengan afinitas
tertinggi akan diisolasi. Misalnya, dalam satu kasus [49], peningkatan 92 kali lipat, antibodi
subnanomolar diperoleh dari perpustakaan hanya 2592 urutan, sementara di lain [50],
perpustakaan 6 × 107 urutan ditingkatkan mengikat hanya 15 kali lipat.
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge 359

104
10–6

1000

Peningkatan lipat
10–9
Afinitas (M)

100

10–12
10

10–15
1
100 104 106 108 1010 1012 100 104 106 108 1010 1012
(A) Keanekaragaman sampel (B) Keanekaragaman sampel

Gambar 15.4 hubungan antara ukuran perpustakaan dan (a) afinitas absolut atau (b) peningkatan afinitas
relatif terhadap fragmen antibodi induk. Untuk perpustakaan dengan sampel berlebih
(lingkaran kosong), keragaman sampel adalah keragaman teoritis maksimum untuk
oligonukleotida mutagenik yang digunakan. Untuk perpustakaan yang kurang sampel
(lingkaran penuh), keragaman sampel adalah ukuran perpustakaan yang dibangun.
perpustakaan dengan 1013 anggota dibangun oleh bagian melalui strain mutator. (Dari irving
rA et al.,Imunoteknologi (Amsterdam), 2:127–143, 1996.)

Untuk mengevaluasi apakah perpustakaan yang lebih besar secara umum menghasilkan pengikat
yang lebih ketat, kami telah memplot kedua nilai ini (Gambar 15.4a dan b) sebagai fungsi dari jumlah
maksimum urutan sampel untuk setiap studi yang dilaporkan. Gambar 15.4b menunjukkan bahwa
mungkin ada beberapa tren umum menuju peningkatan peningkatan afinitas dengan peningkatan
ukuran perpustakaan. Namun, tidak ada korelasi yang jelas antara afinitas absolut dan ukuran
perpustakaan (Gambar 15.4a).
Juga diungkapkan oleh Gambar 15.4 adalah fakta bahwa tidak ada perbedaan yang jelas
antara keberhasilan perpustakaan yang terlalu banyak atau kurang sampel keragaman
maksimum teoritis perpustakaan. Oversampling memiliki keuntungan dalam memberikan
informasi yang berharga jika pengikat yang lebih baik tidak diambil dari perpustakaan—orang
yakin akan wilayah yang tepat dari ruang urutan di sekitar urutan induk yang telah dicari dan
bahwa antibodi afinitas yang lebih tinggi tidak mungkin muncul dari mencari ruang itu lagi.
Sayangnya, ini membutuhkan spektrum keragaman yang akan ditentukan sebelumnya dan
dengan demikian dibatasi oleh bias yang melekat pada desain eksperimen. Undersampling
memiliki keuntungan mengakses spektrum keragaman yang sangat luas dan tidak bias tetapi
tidak menjamin bahwa pengulangan seleksi akan menghasilkan hasil yang sama (atau bahkan
serupa). Dengan demikian, sedikit yang dipelajari dengan memperoleh hasil negatif dari
perpustakaan yang sampelnya buruk.

15.3.2 Penargetan Posisi untuk Mutagenesis acak

Aspek penting lain dari proses desain perpustakaan adalah menentukan posisi asam amino
mana yang harus diacak (Gambar 15.5; Ref. [61]). Secara intuitif, seseorang akan
360 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

(A)

(B)

Gambar 15.5 Lokasi mutasi diidentifikasi oleh pematangan afinitas in vitro dalam domain variabel
berbagai antibodi. (a) “tampak samping”. (b) "pandangan luas" dari antarmuka yang
mengikat. mutasi menguntungkan yang diidentifikasi dalam laporan yang disurvei di
sini dipetakan ke dalam struktur Fv manusiawi (1FCV). rantai ringan (VL, abu-abu) dan
rantai berat (VH, hitam) komponen dari domain variabel ditampilkan dalam bentuk pita.
Mutasi yang diperoleh melalui mutagenesis yang diarahkan oligonukleotida, terutama
di dalam CDrs, ditampilkan sebagai bola abu-abu gelap. Mutasi yang diperoleh melalui
mutagenesis acak tidak terarah ditampilkan sebagai bola abu-abu terang. gambar
yang dibuat dengan pyMol. (Dari Delano WL.Sistem Grafik Molekuler PyMOL. DeLano
ilmiah, palo Alto, CA, 2002.)

berharap bahwa posisi penargetan yang membuat kontak langsung dengan antigen
akan lebih mungkin menghasilkan peningkatan afinitas yang signifikan daripada
posisi penargetan yang jauh dari situs pengikatan antigen. Studi pematangan
afinitas awal menunjukkan bahwa kedua residu yang terlibat erat dalam kontak
antarmolekul serta yang berada di pinggiran antarmuka dapat menghasilkan
peningkatan afinitas [62]. Jika struktur kompleks antibodi-antigen tersedia,
mengidentifikasi residu kontak ini secara langsung, seperti dalam kasus antibodi
anti-VEGF, yang afinitasnya dimatangkan dengan faktor >20 kali lipat [20]. Dalam hal
ini, total empat perubahan CDR, diidentifikasi dengan menargetkan residu kontak
dan nonkontak, menghasilkan varian Y0317 yang ditingkatkan (Gambar 15.2). Varian
ini, juga dikenal sebagai Lucentis™ dalam bentuk Fab,
Tanpa struktur, desain perpustakaan dapat dipandu dengan memilih residu CDR yang terpapar
permukaan secara umum atau dengan mengidentifikasi residu yang penting untuk pengikatan.
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge 361

104
10–6

1000

Peningkatan lipat
10–9
Afinitas (M)

100

10–12
10

10–15 1
Struktur. Fungsi. CDR Acak Struktur. Fungsi. CDR Acak
(A) Penargetan mutagenesis (B) Penargetan mutagenesis

Gambar 15.6 hubungan antara (a) afinitas absolut atau (b) peningkatan afinitas relatif terhadap
fragmen antibodi induk dan pemilihan residu target untuk mutagenesis. dua studi
menggunakan informasi struktural (struct.) untuk memandu mutagenesis (ref. [20] dan
[48]), dan dua studi menggunakan analisis fungsional (Funct.) (ref. [43] dan [57]). studi
yang tersisa baik menargetkan residu CDr secara umum (CDrs) atau memperkenalkan
mutasi acak (acak) di seluruh molekul melalui pCr atau strain mutator.

(dalam aplikasi lain dari tampilan antibodi-fag) melalui mutagenesis pemindaian alanin yang
diarahkan ke situs [64] atau senapan [65]. Pendekatan ini telah menghasilkan perpustakaan yang
ditargetkan yang menghasilkan sejumlah optimasi afinitas yang sukses [57]. Dimungkinkan juga
untuk meningkatkan afinitas dengan "berjalan meskipun" CDR [44], membatasi mutasi ke satu CDR
pada satu waktu, dan menggabungkan mutasi terbaik dari masing-masing.
Atau, peningkatan afinitas yang signifikan dapat dicapai dengan
membangun perpustakaan, di rantai berat, rantai ringan, atau seluruh gen
antibodi, tanpa penargetan khusus. Faktanya, sepengetahuan kami,
antibodi dengan afinitas tertinggi yang dilaporkan (dan antibodi dengan
peningkatan afinitas terbesar) diisolasi oleh skema mutagenesis yang tidak
ditargetkan [42], dengan mutasi yang penting untuk meningkatkan afinitas
yang terletak sejauh 25 dalam a "kulit keempat" yang mengelilingi residu
kontak langsung. Semua metode ini menunjukkan tingkat keberhasilan
yang berbeda-beda, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 15.6, dengan
tidak ada satu metode pun yang secara jelas mengungguli yang lain.
Sehubungan dengan antibodi terapeutik, bagaimanapun,

15.3.3 Metode Mutagenesis

Kita juga harus mempertimbangkan apakah perpustakaan yang dibangun akan oversample atau
undersample keragaman maksimum teoritis perpustakaan. Untuk analisis statistik
362 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

sejauh mana ukuran perpustakaan yang sebenarnya harus melebihi ukuran perpustakaan maksimum
teoritis, lihat Ref. [66]. Pustaka yang disampel berlebih dapat diperoleh dengan mutagenesis terarah
oligonukleotida (baik berbasis templat atau kaset) di sejumlah situs terbatas. Mutagenesis yang
diarahkan oligonukleotida juga memungkinkan eksperimen untuk mengontrol dengan tepat di mana
mutasi diperkenalkan, sehingga mengurangi kekhawatiran tentang memperkenalkan mutasi yang
berpotensi imunogenik ke residu kerangka kerja. Metode mutagenesis nonsistematis apa pun yang
memperkenalkan mutasi pada posisi yang benar-benar acak (misalnya, melalui jalur melalui strain
mutator, PCR yang rawan kesalahan, "pengocokan DNA") tidak memerlukan informasi tentang
pentingnya setiap residu untuk mengikat dan memungkinkan pematangan antibodi tanpa bias yang
dikenakan dari eksperimen. Namun, metode tersebut juga meningkatkan keragaman maksimum
teoritis ke titik yang tidak dapat diambil sampelnya secara efektif. Meskipun beberapa dari metode ini
dapat membatasi mutagenesis ke daerah tertentu dari urutan asam amino (misalnya, dengan
menggunakan PCR rawan kesalahan untuk secara acak bermutasi hanya satu atau dua CDR), keahlian
teknis yang diperlukan dapat mengimbangi kesederhanaan dan kemudahan yang membuat
mutagenesis acak begitu menarik.
Teknik yang digunakan untuk memperkenalkan mutasi sangat terkait dengan skema
penargetan posisi. Namun, apakah berbasis oligonukleotida, PCR, atau metode lainnya

104
10–6

1000
Peningkatan lipat

10–9
Afinitas (M)

100

10–12
10

10–15 1
PCR

PCR
Rantai

Rantai
Mutator

Mutator
Beberapa

Beberapa
diarahkan

diarahkan
Oligo-

Oligo-
menyeret

menyeret
metode

metode
tekanan

tekanan
Rawan kesalahan

Rawan kesalahan

(A) Metode Mutagenesis (B) Metode Mutagenesis

Gambar 15.7 hubungan antara metode mutagenesis dan (a) afinitas absolut atau (b) peningkatan afinitas
relatif terhadap fragmen antibodi induk. Metode dijelaskan dalam teks. "Beberapa metode"
mengacu pada kombinasi strain mutator, pengocokan rantai, dan pCr. Untuk perpustakaan
dengan sampel berlebih (lingkaran kosong), keragaman sampel adalah keragaman teoritis
maksimum untuk oligonukleotida mutagenik yang digunakan. Untuk perpustakaan yang
kurang sampel (lingkaran penuh), keragaman sampel adalah ukuran perpustakaan yang
sebenarnya dibangun. (Dari boder et al.,Proc Natl Acad Sci USA, 97: 10701–10705 , 2000.)
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge 363

digunakan, metode mutagenesis saja tidak berkorelasi dengan keberhasilan seleksi

antibodi (Gambar 15.7).

15.3.4 Keanekaragaman dan Degenerasi Kodon

Pematangan afinitas in vivo bergantung pada mutasi somatik dan rekombinasi CDR,
namun semua antibodi alami berasal dari set yang relatif kecil dari gen domain variabel
garis germinal, yang dengan sendirinya muncul dari duplikasi gen evolusi. Ada dua aliran
pemikiran tentang seberapa dekat proses pematangan afinitas in vitro harus paralel
dengan proses in vivo. Satu perspektif adalah bahwa jika antibodi dengan afinitas tinggi
diturunkan in vivo oleh mutasi somatik, yang memperkenalkan terutama mutasi titik
nukleotida tunggal (dan bukan penggantian kodon tiga nukleotida), maka antibodi
afinitas tinggi harus dipilih secara in vitro dari perpustakaan yang dibangun oleh metode
yang memperkenalkan terutama mutasi titik nukleotida tunggal. Perspektif lain adalah
bahwa tidak ada alasan termodinamika intrinsik untuk keragaman genetik dari
perpustakaan in vitro menjadi bias oleh sejarah evolusi kode genetik, dan dengan
demikian semua 20 asam amino harus terdiri dari perpustakaan. Meskipun kedua
perspektif didasarkan pada hipotesis yang menarik, survei tentang peningkatan afinitas
yang dilaporkan menunjukkan bahwa peningkatan afinitas yang signifikan dapat
diperoleh melalui salah satu pendekatan (Gambar 15.8).

104
10–6

1000
Peningkatan lipat

10–9
Afinitas (M)

100

10–12
10

10–15 1
Mut tunggal. Mut penuh. Mut tunggal. Mut penuh.

(A) Bias kodon (B) Bias kodon

Gambar 15.8 hubungan antara (a) afinitas absolut atau (b) peningkatan afinitas relatif terhadap
fragmen antibodi induk dan setiap bias kodon yang mungkin dihasilkan dari metode
mutagenesis. dalam mutagenesis terarah nonoligonukleotida (pCr rawan kesalahan
atau pengocokan), diasumsikan bahwa sebagian besar perubahan asam amino timbul
dari mutasi titik nukleotida tunggal (single mut.) dan dengan demikian akan bias
terhadap asam amino yang lebih dekat hubungannya dalam kode genetik dengan
asam amino tipe liar pada posisi tertentu. mutagenesis diarahkan oligonukleotida
menggabungkan asam amino dengan hanya bias degenerasi kode genetik (Full mut.).
364 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

15.3.5 Metode Seleksi Pengikatan antigen

Setelah perpustakaan dirancang, dibangun, dan diubah menjadi Escherichia coli, itu harus
dikenakan seleksi pengikatan antigen untuk antibodi dengan afinitas lebih tinggi daripada
induknya. Bergantung pada bagaimana perpustakaan dirancang, ada kemungkinan bahwa
sejumlah besar varian mungkin sangat mirip dengan tipe liar, sehingga penting bahwa seleksi
dilakukan dalam kondisi yang dapat membedakan antara antibodi dengan afinitas serupa.
Teknik yang paling umum, panning untuk pengikat dengan antigen yang diimobilisasi
permukaan [2], telah memberikan hasil yang sangat mengesankan (Gambar 15.9). Dalam teknik
ini, pelat 96-sumur (biasanya polistirena atau polikarbonat yang dimodifikasi) dilapisi dengan
antigen pada 1–10 g/mL dan diblokir dengan bovine serum albumin (BSA), kasein, atau reagen
penghambat lain untuk mencegah adsorpsi fag. Pustaka fag (~ 1010–1012 fag/mL) dibiarkan
mengikat selama beberapa menit hingga jam dan kemudian fag yang tidak mengikat dan
mengikat lebih lemah dicuci. Untuk membedakan antara banyak fag dengan afinitas tinggi dan
mengisolasi fag dengan tingkat off paling lambat, pencucian dapat dilakukan selama beberapa
jam (atau bahkan berhari-hari) dengan antigen terlarut dalam buffer pencuci untuk mencegah
pengikatan ulang. Meskipun teknik ini mudah diterapkan, dibutuhkan pengalaman untuk
mengetahui cara menyesuaikan parameter pencucian untuk mendapatkan binder terbaik.
Metode seleksi lainnya adalah penyortiran solusi [67]. Dalam metode ini, perpustakaan
yang ditampilkan dalam fag diinkubasi dengan antigen terlarut yang telah ditandai dengan
biotin. Fag terikat ditangkap pada sumur atau manik-manik berlapis streptavidin, dicuci, dielusi,
dan diperbanyak. Dengan mengontrol konsentrasi antigen, seseorang dapat mengontrol

104
10–6

1000
Peningkatan lipat

10–9
Afinitas (M)

100

10–12
10

10–15 1
Padat Sol'n Layar Padat Sol'n Layar
(A) Metode pemilihan (B) Metode pemilihan

Gambar 15.9 hubungan antara (a) afinitas absolut atau (b) peningkatan afinitas relatif terhadap fragmen
antibodi induk dan metode seleksi yang digunakan. Sebagian besar seleksi dilakukan pada
penyangga padat (padat, menunjukkan sel utuh atau antigen yang diimobilisasi pada
permukaan plastik), sementara beberapa menggunakan teknik pengikatan dan penangkapan
larutan (sol'n) atau mengandalkan skrining varian individu (layar).
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge 365

ketatnya seleksi. Misalnya, memilih dengan antigen 1 nM harus mendukung pemulihan

fag dengan aKD dari 1 nM atau lebih rendah.
Dimungkinkan juga untuk mengidentifikasi varian yang ditingkatkan afinitas hanya dengan
menyaring setiap klon. Metode ini menghalangi kerumitan teknis yang melekat pada tampilan dan
memastikan bahwa klon afinitas tinggi yang langka tidak akan hilang atau tumbuh terlalu besar
selama langkah propagasi yang digunakan dalam tampilan fag. Namun, itu membutuhkan
perpustakaan yang sangat kecil atau mesin penyaringan throughput tinggi. Implementasi yang paling
"berhasil" dari teknik ini adalah pematangan afinitas anti-α .vβ3 antibodi 92 kali lipat [49]. Dengan
menyaring semua kemungkinan mutasi asam amino tunggal pada setiap posisi CDR (2336 mutan), Wu
et al. [49] mampu mengidentifikasi mutasi individu yang meningkatkan afinitas 2 hingga 13 kali lipat
dan kemudian menggabungkannya secara kombinatorial (256 mutan) dan mengidentifikasi banyak
klon dengan afinitas yang lebih tinggi. Demikian pula, tetapi tidak secara dramatis, Casson dan
Manser [57] meningkatkan afinitas antibodi antiarsenat enam kali lipat dengan menyaring semua 400
kemungkinan mutasi pada dua posisi asam amino.

15.3.6 Hasil penggabungan dari Pustaka Terpisah

Dalam sejumlah kasus yang menggunakan skema mutagenesis yang ditargetkan, eksperimen pematangan

afinitas in vitro telah menggunakan banyak perpustakaan untuk mengambil sampel mutasi di setiap CDR. Pertanyaan

kunci yang kemudian harus dijawab adalah bagaimana menggabungkan mutasi yang berasal dari masing-masing

perpustakaan. Ada tiga pendekatan dasar yang dapat diambil (Gambar 15.10). Satu

104
10–6

1000
Peningkatan lipat

10–9
Afinitas (M)

100

10–12
10

10–15 1
Tidak ada Serial Menambahkan. Paralel Tidak ada Serial Menambahkan. Paralel
(A) Metode rekombinasi (B) Metode rekombinasi

Gambar 15.10 hubungan antara (a) afinitas absolut atau (b) peningkatan afinitas relatif terhadap
fragmen antibodi induk dan cara mutasi dari seleksi atau panning terpisah
digabungkan kembali untuk menghasilkan antibodi dengan afinitas lebih tinggi.
sebagian besar penelitian hanya melakukan satu percobaan panning (tidak ada). yang
lain menggunakan pemenang dari satu panning sebagai kerangka untuk panning
kedua (serial). dua kasus aditif sederhana dilaporkan (Tambah.), seperti dua kasus
membuat perpustakaan tambahan yang berisi mutasi terbaik dari perpustakaan
sebelumnya diikuti dengan pilihan tambahan (paralel).
366 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

pilihannya adalah untuk membangun sejumlah perpustakaan terpisah,

mengidentifikasi mutasi kritis di masing-masing, dan menganggap bahwa
efeknya pada afinitas akan menjadi aditif secara kasar. Kadang-kadang,
pendekatan ini berhasil [20,45], tetapi naif untuk berpikir akan selalu
demikian, karena seluk-beluk interaksi protein-protein belum sepenuhnya
dipahami. Pilihan lain adalah untuk melanjutkan secara serial, kadang-
kadang disebut "CDR berjalan" [44], membuat perpustakaan dari satu CDR,
memilih pengikat terbaik, dan menggunakan varian yang ditingkatkan
sebagai kerangka kerja untuk perpustakaan berikutnya dengan posisi asam
amino yang berbeda secara acak. Pendekatan ini memiliki keuntungan
yang jelas bahwa pengikat dari setiap perpustakaan berturut-turut dijamin
untuk bekerja dalam konteks mutasi menguntungkan yang diidentifikasi
sebelumnya. Namun, mutasi sinergis yang menjembatani beberapa CDR
tidak akan diidentifikasi dengan teknik ini.

15.3.7 Format antibodi

Faktor lain yang perlu dipertimbangkan dalam percobaan pematangan afinitas adalah format
antibodi. Kedua fragmen pengikat antigen (Fabs), biasanya dengan domain VH-CH1 rantai berat yang
menyatu dengan protein fag dan VL-CL diekspresikan bersama sebagai rantai kedua yang larut, dan
scFvs, dengan domain VH dan VL yang terhubung melalui penghubung peptida, memiliki digunakan
untuk tampilan fag. Format rantai tunggal mungkin memiliki keunggulan ekspresi secara umum;
namun, pembentukan diabodi dapat menghasilkan hasil yang menyesatkan dalam uji pengikatan dan
aktivitas. Kedua format terus digunakan secara luas, dan tidak ada

104
10–6

1000
Peningkatan lipat

10–9
Afinitas (M)

100

10–12
10

10–15 1
luar biasa scFv luar biasa scFv
(A) Format tampilan (B) Format tampilan

Gambar 15.11 hubungan antara format tampilan (Fab atau scFv) dan (a) afinitas absolut atau
(b) peningkatan afinitas relatif terhadap fragmen antibodi induk.
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge 367

telah menunjukkan keunggulan yang jelas atas yang lain sehubungan dengan pematangan afinitas in
vitro (Gambar 15.11).

15.4 PENDEKATAN MUNCUL

Baru-baru ini, dua teknologi tampilan tambahan telah digunakan untuk pematangan afinitas:
FACS dan tampilan ribosom. FACS memisahkan populasi sel berdasarkan sifat fluoresennya. Teknologi
ini telah digunakan untuk mematangkan afinitas antibodi antifluorescein-biotin dengan ditampilkan
pada permukaan ragi [42], menghasilkan peningkatan afinitas terbesar (6250 kali lipat) dan antibodi
keseluruhan yang paling ketat (48 fM). Penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi juga telah
digunakan untuk memisahkan sel bakteri, menampilkan scFv melalui fusi dengan protein permukaan
bakteri OmpA, meskipun hanya menghasilkan peningkatan afinitas kecil [48]. Salah satu batasan yang
jelas dari teknologi ini adalah bahwa hal itu bergantung pada penggunaan target fluoresen yang
dapat larut.
Tampilan ribosom adalah pendekatan ex vivo sepenuhnya di mana protein yang diinginkan
ditambatkan ke ribosom sebenarnya (dan messenger RNA) yang mengkodekannya [68,69].
Meskipun teknologi ini telah digunakan bukan untuk mematangkan afinitas antibodi itu sendiri,
melainkan untuk mengisolasi antibodi dengan afinitas pikomolar [70,71], kemungkinan
teknologi ini akan segera diadaptasi untuk pematangan afinitas.
Selain metode baru untuk menyortir/memilih pengikat yang ditingkatkan dari pustaka
varian yang besar, kemajuan telah dibuat dalam penggunaan metode komputasi untuk
meningkatkan afinitas. Dalam kasus antibodi anti-VEGF, varian dengan afinitas yang
ditingkatkan dirancang dengan secara khusus menargetkan residu di dalam dan di luar
rangkaian residu yang mengontak antigen [33]. Dalam kasus ini, meskipun strategi seleksi fag
ekstensif telah menyebabkan peningkatan afinitas melalui seleksi off-rate, tidak ada
peningkatan signifikan dalam on-rate yang ditemukan. Pendekatan komputasi menghasilkan
serangkaian mutasi baru yang memberikan peningkatan afinitas, terutama melalui
peningkatan on-rate dalam varian “34-TKKT” (Gambar 15.2).

15.5 KESIMPULAN

Dengan banyak contoh humanisasi dan pematangan afinitas fragmen

antibodi dalam literatur, orang dapat mulai membandingkan metode yang
digunakan untuk menangani variabel pematangan afinitas berbasis
tampilan. Karena berbagai mutagenesis, penargetan residu, dan metode
seleksi telah digunakan, perbandingan antara metodologi tertentu hanya
dapat dibuat dengan jumlah contoh yang terbatas dari masing-masing
metode. Namun, gambaran yang muncul pada titik ini adalah bahwa tidak
ada "peluru ajaib" (meminjam referensi lama untuk antibodi terapeutik)
yang ditemukan untuk meningkatkan afinitas antibodi secara sistematis,
tetapi setiap metode memiliki manfaat dan keterbatasannya sendiri. .
368 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

Pada akhirnya, kombinasi desain berbasis struktur, desain keragaman berbasis struktur, dan
strategi seleksi yang ketat kemungkinan akan menghasilkan antibodi yang paling berguna untuk
penggunaan reagen dan terapi.

referensi

1. Kohler G, Milstein C. Kultur terus menerus dari sel yang menyatu mensekresi antibodi dengan
spesifisitas yang telah ditentukan. Alam 1975; 256:495–497.
2. Smith GP. Fag fusi berfilamen: Vektor ekspresi baru yang menampilkan antigen kloning
pada permukaan virion.Sains 1985; 228:1315–1317.
3. Chothia C, Lesk AM. Struktur kanonik untuk daerah hipervariabel
imunoglobulin.J Mol Biola 1987; 196:901–917.
4. Wilson IA, Stanfield RL. Interaksi antibodi-antigen: Struktur baru dan perubahan
konformasi baru.Struktur Curr Opin Biol 1994; 4:857–867.
5. Kang AS, Barbas CF III, Janda KD, Benkovic SJ, Lerner RA. Keterkaitan fungsi pengenalan
dan replikasi dengan merakit perpustakaan Fab antibodi kombinatorial di sepanjang
permukaan fag.Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 4363–4366 .
6. Cwirla SE, Peters EA, Barrett RW, Dower WJ. Peptida pada fag: Pustaka peptida yang luas
untuk mengidentifikasi ligan.Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 6378–6382 .
7. Barbas CF III, Kang AS, Lerner RA, Benkovic SJ. Perakitan perpustakaan antibodi
kombinatorial pada permukaan fag: Situs gen III.Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:
7978–7982 .
8. Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G. Protein
multisubunit pada permukaan fag berfilamen: Metodologi untuk menampilkan rantai
berat dan ringan antibodi (Fab). Asam Nukleat Res 1991; 19: 4133–4137 .
9. Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G.
Melewati imunisasi. Antibodi manusia dari perpustakaan gen-V ditampilkan di fag.
J Mol Biola 1991; 222:581–597.
10. Perisic O, Webb PA, Holliger P, Winter G, Williams RL. Struktur kristal diabody,
fragmen antibodi bivalen.Struktur 1994; 2:1217–1226.
11. Jaffers GJ, Fuller TC, Cosimi AB, Russell PS, Winn HJ, Colvin RB. Terapi antibodi
monoklonal. Antibodi anti-idiotypic dan non-anti-idiotypic terhadap OKT3 muncul
meskipun imunosupresi intens.Transplantasi 1986; 41:572–578.
12. Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G. Membentuk kembali antibodi manusia untuk
terapi. Alam 1988; 332:323–327.
13. Hale G, Dyer MJ, Clark MR, Phillips JM, Marcus R, Riechmann L, Winter G dkk. Induksi
remisi pada limfoma non-Hodgkin dengan antibodi monoklonal manusia yang dibentuk
kembali CAMPATH-1H.Lanset 1988; 2:1394–1399.
14. Sugo T, Mizuguchi J, Kamikubo Y, Matsuda M. Anti-human factor IX antibodi
monoklonal spesifik untuk konformasi yang diinduksi ion kalsium. tromb res 1990;
58: 603–614.
15. Suggett S, Kirchhofer D, Hass P, Lipari T, Moran P, Nagel M, Judice K et al. Penggunaan
tampilan fag untuk menghasilkan antibodi manusia yang menetralkan fungsi faktor IXa.
Fibrinolisis Koagul Darah 2000; 11:27–42.
16. Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner D, Wong WL, Rowland AM dkk.
Humanisasi antibodi anti-p185HER2 untuk terapi kanker manusia.Proc Natl Acad Sci
USA 1992; 89: 4285–4289 .
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge 369

17. Presta LG, Lahr SJ, Shields RL, Porter JP, Gorman CM, Fendly BM, Jardieu PM. Humanisasi
antibodi yang ditujukan terhadap IgE.J kekebalan 1993; 151: 2623–2632 .
18. Werther WA, Gonzalez TN, O'Connor SJ, McCabe S, Chan B, Hotaling T, Champe M et
al. Humanisasi antibodi monoklonal anti-limfosit function-associated antigen (LFA)-1
dan rekayasa ulang antibodi manusiawi untuk mengikat rhesus LFA-1.J kekebalan
1996; 157: 4986–4995 .
19. Presta LG, Chen H, O'Connor SJ, Chisholm V, Meng YG, Krummen L, Winkler M dkk.
Humanisasi antibodi monoklonal faktor pertumbuhan endotel anti-vaskular untuk terapi
tumor padat dan gangguan lainnya.Res Kanker 1997; 57: 4593–4599 .
20. Chen Y, Wiesmann C, Fuh G, Li B, Christinger HW, McKay P, de Vos AM dkk. Pemilihan dan
analisis antibodi anti-VEGF yang dioptimalkan: Struktur kristal Fab yang matang afinitas
dalam kompleks dengan antigen.J Mol Biola 1999; 293:865–881.
21. Foote J, Winter G. Residu kerangka antibodi mempengaruhi konformasi loop
hipervariabel. J Mol Biola 1992; 224:487–499.
22. Jones PT, Dear PH, Foote J, Neuberger MS, Winter G. Mengganti daerah penentu
komplementaritas dalam antibodi manusia dengan yang berasal dari tikus. Alam 1986;
321: 522–525.
23. Verhoeyen M, Milstein C, Winter G. Membentuk kembali antibodi manusia: Mencangkok aktivitas
antilisozim. Sains 1988; 239:1534–1536.
24. Chothia C, Lesk AM, Tramontano A, Levitt M, Smith-Gill SJ, Air G, Sheriff S dkk.
Konformasi daerah hipervariabel imunoglobulin.Alam 1989; 342:877–883.
25. Gussow D, Seemann G. Humanisasi antibodi monoklonal. Metode Enzim1991;
203:99-121.
26. Carter P, Abrahmsen L, Wells JA. Menyelidiki mekanisme dan meningkatkan laju
katalisis berbantuan substrat di subtilisin BPN.Biokimia 1991; 30: 6142–6148 .
27. Baca M, Presta LG, O'Connor SJ, Wells JA. Humanisasi antibodi menggunakan tampilan fag
monovalen.J Biol Chem 1997; 272: 10678–10684 .
28. Queen C, Schneider WP, Selick HE, Payne PW, Landolfi NF, Duncan JF, Avdalovic NM dkk.
Sebuah antibodi manusiawi yang mengikat reseptor interleukin 2.Proc Natl Acad Sci USA
1989; 86: 10029–10033 .
29. Rosok MJ, Yelton DE, Harris LJ, Bajorath J, Hellstrom KE, Hellstrom I, Cruz GA dkk. Strategi
perpustakaan kombinatorial untuk humanisasi cepat antikarsinoma BR96 Fab.
J Biol Chem 1996; 271: 22611–22618 .
30. Roguska MA, Pedersen JT, Keddy CA, Henry AH, Searle SJ, Lambert JM, Goldmacher
VS dkk. Humanisasi antibodi monoklonal murine melalui pelapisan ulang domain
variabel.Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:969–973.
31. Jespers LS, Roberts A, Mahler SM, Musim Dingin G, Hoogenboom HR. Memandu
pemilihan antibodi manusia dari repertoar tampilan fag ke epitop tunggal antigen.
Bioteknologi (NY) 1994; 12:899–903.
32. Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Urutan Protein
Kepentingan Imunologis. Bethesda, MD: Institut Kesehatan Nasional, 1991.
33. Marvin JS, Lowman HB. Mendesain ulang fragmen antibodi untuk asosiasi yang lebih cepat
dengan antigennya.Biokimia 2003; 42: 7077–7083 .
34. Ferrara N. Peran faktor pertumbuhan endotel vaskular dalam angiogenesis fisiologis dan
patologis: Implikasi terapeutik. Semin Oncol 2002; 29:10–14.
35. Klotz IM. Interaksi ligan-reseptor: Fakta dan fantasi.Q Rev Biophys 1985;
18:227–259.
36. Neri D, Montigiani S, Kirkham PM. Metode biofisik untuk penentuan afinitas
antibodi-antigen.Tren Bioteknologi 1996; 14:465–470.
370 JonAthAn s. MArVin Dan henry b. rendah

37. Karlsson R, Michaelsson A, Mattsson L. Analisis kinetik dari interaksi antigen

antibodi monoklonal dengan sistem analisis berbasis biosensor baru. Metode J
Imunol1991; 145:229–240.
38. Crothers DM, Metzger H. Pengaruh polivalensi pada sifat pengikatan antibodi.
Imunokimia 1972; 9:341–357.
39. Muller KM, Arndt KM, Pluckthun A. Model dan simulasi pengikatan multivalen pada ligan
tetap. Biokimia Anal 1998; 261:149–158.
40. Miller K, Meng G, Liu J, Hurst A, Hsei V, Wong WL, Ekert R et al. Desain, konstruksi,
dan analisis in vitro antibodi multivalen.J kekebalan 2003; 170: 4854–4861 .
41. Schlom J, Eggensperger D, Colcher D, Molinolo A, Houchens D, Miller LS, Hinkle G dkk.
Keuntungan terapeutik dari radioimmunoconjugates antikarsinoma afinitas tinggi.Res
Kanker 1992; 52:1067–1072.
42. Boder ET, Midelfort KS, Wittrup KD. Evolusi terarah dari fragmen antibodi dengan afinitas
pengikatan antigen femtomolar monovalen.Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 10701–
10705 .
43. Schier R, Marks JD. Pematangan afinitas in vitro yang efisien dari antibodi fag menggunakan
pilihan yang dipandu BIAcore.Hum Antibodi Hibridoma 1996; 7:97–105.
44. Yang WP, Green K, Pinz-Sweeney S, Briones AT, Burton DR, Barbas CF III. Mutagenesis
berjalan CDR untuk pematangan afinitas antibodi anti-HIV-1 manusia yang kuat ke dalam
kisaran picomolar.J Mol Biola 1995; 254:392–403.
45. Jackson JR, Sathe G, Rosenberg M, Manis R. Pematangan antibodi in vitro.
Peningkatan afinitas tinggi, antibodi penetralisir terhadap IL-1 beta.J kekebalan
1995; 154: 3310–3319 .
46. Thompson J, Paus T, Tung JS, Chan C, Hollis G, Mark G, Johnson KS. Pematangan afinitas
antibodi monoklonal manusia afinitas tinggi terhadap loop hipervariabel ketiga human
immunodeficiency virus: Penggunaan tampilan fag untuk meningkatkan afinitas dan
memperluas reaktivitas regangan.J Mol Biola 1996; 256:77–88.
47. Chowdhury PS, Pastan I. Meningkatkan afinitas antibodi dengan meniru hipermutasi somatik in
vitro. Nat Bioteknologi 1999; 17:568–572.
48. Daugherty PS, Chen G, Olsen MJ, Iverson BL, Georgiou G. Pematangan afinitas antibodi
menggunakan tampilan permukaan bakteri. Protein Inggris 1998; 11:825–832.
49. Wu H, Beuerlein G, Nie Y, Smith H, Lee BA, Hensler M, Huse WD dkk. Pematangan afinitas
in vitro bertahap dari Vitaxin, sebuahvβ3-mAb manusiawi khusus. Proc Natl Acad Sci USA
1998; 95: 6037–6042 .
50. Huls G, Gestel D, van der Linden J, Moret E, Logtenberg T. Pembunuhan sel tumor oleh
antibodi monoklonal manusia rekombinan afinitas-matang in vitro. Kanker Imunol
Imunother 2001; 50:163–171.
51. Marks JD, Griffiths AD, Malmqvist M, Clackson TP, Bye JM, Winter G. Melewati imunisasi:
Membangun antibodi manusia afinitas tinggi dengan pengocokan rantai. Bioteknologi
(NY) 1992; 10:779–783.
52. Neri D, Carnemolla B, Nissim A, Leprini A, Querze G, Balza E, Pini A dkk. Penargetan oleh
fragmen antibodi rekombinan afinitas matang dari isoform fibronektin terkait
angiogenesis.Nat Bioteknologi 1997; 15:1271–1275.
53. Beers R, Chowdhury P, Bigner D, Pastan I. Imunotoksin dengan aktivitas yang meningkat terhadap sel-
sel yang mengekspresikan reseptor faktor pertumbuhan epidermal vIII yang diproduksi oleh tampilan
fag antibodi. Clin Kanker Res 2000; 6: 2835–2843 .
54. Hawkins RE, Russell SJ, Winter G. Pemilihan antibodi fag dengan afinitas pengikatan.
Meniru pematangan afinitas.J Mol Biola 1992; 226:889–896.
HUMANISASI ANTIBODI DAN MaturASI AFFinitas menggunakan Tampilan phAge 371

55. Irving RA, Kortt AA, Hudson PJ. Pematangan afinitas antibodi rekombinan menggunakan
Sel mutator E.coli. Imunoteknologi (Amsterdam) 1996; 2:127–143.
56. Park SG, Lee JS, Je EY, Kim IJ, Chung JH, Choi IH. Pematangan afinitas antibodi alami
menggunakan teknik pengocokan rantai dan ekspresi antibodi rekombinan di
Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 2000; 275:553–557.
57. Casson LP, Manser T. Mutagenesis acak dari dua asam amino wilayah penentu
komplementaritas menghasilkan frekuensi antibodi yang sangat tinggi dengan afinitas yang
meningkat untuk antigen serumpun dan autoantigen. J Exp Med 1995; 182:743–750.
58. Yelton DE, Rosok MJ, Cruz G, Cosand WL, Bajorath J, Hellstrom I, Hellstrom KE et al.
Pematangan afinitas antibodi anti-karsinoma BR96 oleh mutagenesis berbasis kodon.
J kekebalan 1995; 155:1994–2004.
59. Gram H, Marconi LA, Barbas CF III, Collet TA, Lerner RA, Kang AS. Seleksi in vitro dan
pematangan afinitas antibodi dari perpustakaan imunoglobulin kombinatorial naif.
Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 3576–3580 .
60. Perelson AS. Teori jaringan imun.Immunol Rev 1989; 110:5–36.
61. Delano WL. Sistem Grafik Molekuler PyMOL. DeLano Ilmiah, Palo Alto, CA,
2002.
62. Lowman HB, Wells JA. Pematangan afinitas hormon pertumbuhan manusia dengan tampilan fag
monovalen.J Mol Biola 1993; 234:564–578.
63. Ferrara N. VEGF dan pencarian faktor angiogenesis tumor. Kanker Nat Rev 2002;
2:795–803.
64. Muller YA, Chen Y, Christinger HW, Li B, Cunningham BC, Lowman HB, de Vos
AM. VEGF dan fragmen Fab dari antibodi penetral manusiawi: Struktur kristal
kompleks pada resolusi 2,4 dan analisis mutasi antarmuka.Struktur 1998;
6:1153–1167.
65. Vajdos FF, Adams CW, Breece TN, Presta LG, de Vos AM, Sidhu SS. Peta fungsional komprehensif
dari situs pengikatan antigen dari antibodi anti-ErbB2 yang diperoleh dengan mutagenesis
pemindaian senapan.J Mol Biola 2002; 320:415–428.
66. Lowman HB, Wells JA. Tampilan fag monovalen: Metode untuk memilih protein varian dari
perpustakaan acak.Metode: Metode Pendamping Enzymol 1991; 3:205–216.
67. Parmley SF, Smith GP. Vektor fag fd filamen yang dapat dipilih antibodi: Pemurnian
afinitas gen target.gen 1988; 73:305–318.
68. Mattheakis LC, Bhatt RR, Dower WJ. Sistem tampilan polisom in vitro untuk mengidentifikasi
ligan dari perpustakaan peptida yang sangat besar.Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 9022–
9026 .
69. Hanes J, Pluckthun A. Seleksi in vitro dan evolusi protein fungsional dengan menggunakan
tampilan ribosom. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 4937–4942 .
70. Hanes J, Jermutus L, Weber-Bornhauser S, Bosshard HR, Pluckthun A. Tampilan ribosom secara
efisien memilih dan mengembangkan antibodi afinitas tinggi in vitro dari perpustakaan
kekebalan. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 14130–14135 .
71. Hanes J, Schaffitzel C, Knappik A, Pluckthun A. Picomolar antibodi afinitas dari perpustakaan naif
sintetis sepenuhnya dipilih dan dikembangkan oleh tampilan ribosom. Nat Bioteknologi2000;
18:1287–1292.