BAB II

PEMBAHASAN

A.    Antibodi Monoklonal

1.  Pengertian Antibodi Monoklonal

Salah satu hasil teknik hibridoma yaitu antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal adalah antibodi sejenis
yang diproduksi oleh sel plasma klon sel-sel positif sejenis. Antibodi ini dibuat oleh sel-sel hibridoma (hasil fusi 2 sel
berbeda; penghasil sel positif limpa dan sel mieloma) yang dikultur. Bertindak sebagai antigen yang akan menghasilkan
anti bodi adalah limpa. Fungsi antara lain diagnosis penyakit dan kehamilan. Antibodi monoklonal adalah zat yang
diproduksi oleh sel gabungan tipe tunggal yang memiliki kekhususan tambahan.  Ini dalah komponen penting dari
sistem kekebalan tubuh. Mereka dapat mengenali dan mengikat antigen yang spesifik .

Antibodi monoklonal dibuat dengan dari sel hibrid yang mempunyai sifat lebih baik dari
antibodi poliklonal karena hanya mengikat 1 epitop serta dapat dibuat dalam jumlah tak terbatas.
Terobosan teknik hibridoma yang menghasilkan antibodi monoklonal terhadap antigen, membuka
era baru cara identifikasi dan memurnikan suatu molekul pada berbagai disiplin ilmu, juga membuka
cakrawala dalam prosedur diagnostik dan pengobatan dan pencegahan alternatif pada keganasan
dan berbagai macam penyakit lain.

Sel tertentu yang membuat immunoglobulin untuk dilepaskan ke dalam sirkulasi disebut sel
plasma. Sel-sel itu menetap pada sumsum tulang bersama dengan prekusor sel darah. Satu individu
sel plasma membelah dan menghasilkan satu jalur sel keturunan atau disebut juga klon, sel-sel yang
dihasilkan tersebut melanjutkan sintesis antibodi yang sama dan spesifik terhadap satu antigen.

Pada teknologi antibodi monklonal, sel tumor yang dapat mereplikasi tanpa henti digabungkan dengan sel
mamalia yang memproduksi antibodi. Hasil penggabungan sel ini adalah hibridoma, yang akan terus memproduksi
antibodi. Antibodi monoklonal mengenali setiap determinan yang antigen (bagian dari makromolekul yang dikenali
oleh sistem kekepalan tubuh / epitope). Mereka menyerang molekul targetnya dan mereka bisa memilahantara
epitope yang sama. Selain sangat spesifik, mereka memberikan landasan untuk perlindungan melawan patogen.

Antibodi monoklonal sekarang telah digunakan untuk banyak masalah diagnostik seperti mengidentifikasi
agen infeksi, mengidentifikasi tumor, antigen dan antibodi auto, mengukur protein dan level drug pada serum,
mengenali darah dan jaringan,mengidentifikasi sel spesifik yang terlibat dalam respon kekebalan dan mengidentifikasi
serta mengkuantifikasi hormon. Kemajuan sekarang telah memungkinkan untuk memproduksi antibodi monoklonal
manusia melalui rekayasa genetika dalam jumlah yang besar untuk digunakan dalam terapi berbagai penyakit.

Antibodi monoklonal secara luas digunakan sebagai reagensia diagnostik dan juga
diaplikasikan untuk terapi.
2.   Antibodi monoklonal mempunyai 4 jenis, yaitu :

a.      Murine  Monoclonal Antibodies

Antibodi ini murni didapat dari tikus dapat menyebabkan human anti mouse antibodies  (HAMA)
nama akhirannya ″momab″ (ibritumomab).

b.      Chimaric Monoclonal Antibodies

Antibodi ini dibuat melalui teknik rekayasa genetika untuk menciptakan suatu mencit atau tikus yang
dapat memproduksi sel hibrid mencit-manusia. Bagian variabel dari molekul antibodi, termasuk
antigen binding site berasal dari mencit, sedangkan bagian lainnya yaitu bagian yang konstan berasal
dari manusia. Salah satu contohnya antibodi monoklonal yang struktur molekulnya terdiri dari 67%
manusia adalah Rifuximab.

c.       Humanized Monoclonal Antibodies

Antibodi ini dibuat sedemikian rupa sehingga bagian protein yang berasal dari mencit hanya terbatas
pada antigen binding site saja. Sedangkan bagian yang lainya yaitu bagian variabel dan bagian
konstan berasal dari manusia. Antibodi monoklonal yang struktur molekulnya terdiri dari 90%
manusia diantaranya adalah Alemtuzumab.

d.      Fully Human Monoclonal Antibodies

Antibodi ini merupakan antibodi yang paling ideal untuk menghindari terjadinya respon imun karena
protein antibodi yang disuntikkan ke dalam tubuh seluruhnya merupakan protein yang berasal dari
manusia.

Salah satu pendekatan yang dilakukan untuk merancang pembentukan antibodi ini adalah
dengan teknik rekayasa genetika untuk menciptakan mencit transgenik yang membawa gen yang
berasal dari manusia. Sehingga mampu memproduksi antibodi yang diinginkan .

Pendekatan lainnya adalah merekayasa suatu binatang transgenik yang dapat mensekresikan
antibodi manusia dalam air susu yang dikeluarkan oleh binatang tersebut.

3.   Kegunaan antibodi monoklonal lainnya, yaitu :

1.      Untuk mendeteksi kandungan hormon korionik gonadotropin (HCG) dalam urin wanita hamil.

2.      Untuk mengikat racun dan menonaktifkannya, contohnya racun tetanus dan kelebihan obat digoxin
dapat dinonaktifkan oleh antibodi ini.
3.      Mencegah penolakan jaringan terhadap sel hasil transplantasi jaringan lain.

4.      Mengidentifikasi agen infeksi

5.      Mengidentifikasi tumor, antigen dan antibodi auto

6.      Mengukur protein dan level drug pada serum

7.      Mengenali darah dan jaringan

8.      Mengidentifikasi sel spesifik yang terlibat dalam respon kekebalan dan mengidentifikasi.

4.      Cara Pembuatan Antibodi Monoklonal

Antibodi monoklonal dibuat dengan cara dari penggabungan (fusi) antara sel B limfosit
dengan sel kanker (jenis mieloma NS-1). Hasil penggabungan (fusi) antara sel B-limfosit dengan sel
kanker secara in vitro disebut juga hibridoma. Sifat dari sel hibridoma ini adalah immortal (sel abadi
karena mampu bertahan hidup, membelah dan memperbanyak diri dalam jumlah tak terhingga.

Proses pembuatannya yaitu :

a.    Imunisasi Mencit

1)      Antigen berupa protein atau polisakarida yang berasal dari bakteri atau virus, disuntikkan
secarasubkutan pada beberapa tempat atau secara intra peritoneal.

2)      Setelah 23 minggu disusul suntikan antigen secara intravena, mencit yang tanggap kebal terbaik
dipilih.

3)      Pada hari ke-12 hari suntikan terakhir antibodi yang terbentuk pada mencit diperiksa dan diukurtiter
antibodinya.

4)      Mencit dimatikan dan limfanya diambil secara aseptis. Kemudian dibuat suspensi sel limfa untuk
memisahkan sel B yang mengandung antibodi.

b.    Fussi sel kebal dan sel mieloma

1)    Pada kondisi biakan jaringan biasa, sel limfa yang membuat antibodi akan cepat mati, sedangkansel
mieloma dapat dibiakkan terus-menerus. Fusi sel dapat menciptakan sel hibrid yang terdiri
darigabungan sel limfa yang dapat membuat antibodi dan sel mieloma yang dapat dibiakkan
secaraterus menerus dalam jumlah yang tidak terbatas secara in vitro.

2)    Fusi sel diawali dengan fusi membran plasma sehingga menghasilkan sel besar dengan dua ataulebih
inti sel, yang berasal dari kedua induk sel yang berbeda jenis yang disebut heterokarion.
3)    Pada waktu tumbuh dan membelah diri terbentuk satu inti yang mengandung kromosom
kedua induk yang disebut sel hibrid.

Frekuensi fusi dipengaruhi bebrapa faktor antara lain jenis medium, perbandingan jumlah
sel limpa dengan sel mieloma, jenis sel mieloma yang digunakan, dan bahan yang mendorong
timbulnya fusi (fusagon). Penambahan polietilen glikol (PEG) dan dimetilsulfoksida (DMSO) dapat
menaikan efisiensi fusi sel.

c.       Eliminasi sel induk yang tidak berfusi

Frekuensi terjadinya hibrid sel limfa-sel mieloma biasanya rendah, karena itu penting
untukmematikan sel yang tidak fusi yang jumlahnyaa lebih banyak agar sel hibrid
mempunyaikesempatan untuk tumbuh dengan cara membiakkan sel hibrid dalam media selektif
yang mengandung hyloxanthine, aminopterin, dan thymidine (HAT).

d.    Isolasi dan pemilihan klon hibridoma

1)    Sel hibrid dikembangbiakkan sedemikian rupa, sehingga tiap sel hibrid aka membentuk
kolonihomogen yang disebut hibridoma.

2)    Tiap koloni kemudian dibiakkan terpisah satu sama lain.

3)    Hibridoma yang tumbuh diharapkan mensekresi antibodi ke dalam medium, sehingga antibodiyang
terbentuk bisa diisolasi. Pemilihan klon hibridoma dilakukan dua kali, pertama adalah dilakukan
untuk memperolehhibridoma yang dapat menghasilkan antibodi, dan yang kedua adalah memilih sel
hibridomapenghasil antibodi monoklonal yang potensial menghasilkan antibodi monoklonal yang
tinggi dan stabil.

Umumnya untuk menetukan antibodi yang diinginkan dilakukan dengan cara Enzyme Linked
Immunosorbent Assay(ELISA) atau radioimmunoassay  (RIA). Pemilihan klon hibridoma dilakukan dua
kali, pertama adalah dilakukan untuk memperoleh hibridoma yang dapat menghasilkan antibodi;
dan yang kedua adalah memilih sel hibridoma penghasil antibodi monoklonal yang potensial
menghasilkan antibodi monoklonal yang tinggi dan stabil.

5)      Cara Kerja Antibodi Monoklonal

 Cara kerja antibodi monoklonal ini tidak seperti kemoterapi dan radioterapi, yang bekerja
secara kurang spesifik, tujuan pengobatan antibodi monoklonal adalah untuk menghancurkan sel-sel
limpoma non Hodgkin secara khusus dan tidak mengganggu jenis-jenis sel lainnya.

Semua sel memiliki penandaan protein pada permukaannya yang di kenal sebagai antigen.
Antibodi monoklonal dirancang di laboratorium untuk secara spesifik mengenali penanda protein
tertentu di permukaan sel kanker. Antibodi monoklonal kemudian berikatan dengan protein ini. Hal
ini memicu sel untuk menghancurkan diri sendiri atau memberi tanda pada siinduk kekebalan tubuh
untuk menyerang dan membunuh sel kanker.

6)      Mekanisme Kerja Antibodi Monoklonal

Antibodi monoklonal menggunakan mekanisme kombinasi untuk meningkatkan efek

sitotoksik sel tumor. Mekanisme komponen sistem imun adalah antibody dependent cellular
cytotoxicity (ADCC), complement dependent cytotoxicity(CDC), mengubah signal transduksi sel tumor
atau menghilangkan sel permukaan antigen. Antibodi dapat digunakan sebagai target muatan
(radioisotop, obat atau toksin) untuk membunuh sel tumor atau mengaktivasi prodrug di
tumor, antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT). Antibodi monoklonal digunakan secara
sinergis melengkapi mekanisme kerja kemoterapi untuk melawan tumor 

Pengobatan menggunakan antibodi monoklonal telah diterapkan pada beberapa jenis

penyakit kanker yaitu kanker paru, kanker kulit, dan kanker limfosit atau kanker getah bening.
Tubuh manusia tidak dapat menyerang sel kanker karena antibodi alami yang terdapat dalam
tubuh manusia tidak mengenali sel-sel tersebut sebagai protein asing (antigen). Sehingga, fungsi
utama antibodi monoklonal adalah untuk mengenali molekul khas yang terdapat pada permukaan
sel kanker. Setelah mengenali sel abnormal tersebut, antibodi monoklonal akan mengikat sel
kanker.  Berikut ini adalah beberapa cara yang dapat dilakukan antibodi monoklonal untuk
mengatasi sel kanker.

a.   Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC)

Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) adalah cara yang dilakukan
antibodimonoklonal untuk membuat sel-sel kanker terlihat bagi sel fagosit, sebagai natural
killer ditubuh manusia. Ikatan antibodi monoklonal dengan antigen permukaan sel tumor
memicu penglepasan perforin dan granzymes yang dapat menghancurkan sel tumor. Sel - sel yangha
ncur ditangkap  Antigen  Presenting  Cell  (  APC  ) lalu dipresentasikan pada sel B limfosit(sebagai
penghasil antibodi alami di dalam tubuh) sehingga memicu pelepasan antibodikemudian antibodi ini
akan berikatan dengan target antigen. Pelepasan antibodi oleh sel Blimfosit memicu sel T
limfosit untuk mengenali dan membunuh sel target.

terjadi jika antibodi mengikat antigen sel tumor dan Fc antibodi melekat dengan reseptor Fc
pada permukaan sel imun efektor. Interaksi Fc reseptor ini berdasarkan kemanjuran anti tumor dan
sangat penting pada pemilihan suatu antibodi monoklonal. Sel efektor yang berperan masih belum
jelas tapi diasumsikan sel fagosit mononuklear dan atau natural killer  (NK).

Struktur Fc domain dimanipulasi untuk menyesuaikan jarak antibodi dan interaksi dengan Fc

reseptor. Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) dapat meningkatkan respons klinis secara
langsung menginduksi destruksi tumor melalui presentasi antigen dan menginduksi respons sel T
tumor.

Antibodi monoklonal berikatan dengan antigen permukaan sel tumor melalui Fc reseptor
permukaan sel NK. 

Hal ini memicu penglepasan perforin dan granzymes untuk menghancurkan sel tumor

(gambar a). Sel - sel yang hancur ditangkapantigen presenting cell (APC) lalu dipresentasikan pada sel
B sehingga memicu penglepasan antibodi kemudian antibodi ini akan berikatan dengan target
antigen (gambar b-d). Sel cytotoxic T lymphocytes (CTLs) dapat mengenali dan membunuh sel target
antigen .

b.      Complement dependent cytotoxicity (CDC)

Pengikatan antibodi monoklonal dengan antigen memicu protein lain untuk

mengawali pelepasan proteolitik dari sel efektor kemotaktik yang dapat menyebabkan terbentuknya
lubang pada membran sel-sel kanker. Lubang ini membuat air dan ion natrium dapat keluardan
masuk sel kanker tanpa terkendali sehingga sel tersebut akan mengalami lisis atau pecah.

Pengikatan antibodi monoklonal dengan antigen permukaan sel akan mengawali kaskade
komplement. Complement dependent cytotoxicity (CDC) merupakan suatu metode pembunuh sel
tumor yang lain dari antibodi. Imunoglobulin G1 dan G3 sangat efektif pada CDC melalui jalur klasik
aktivasi komplemen (Gambar a).

Formasi kompleks antigen antibodi merupakan komplemen C1q berikatan dengan IgG
sehingga memicu komplemen protein lain untuk mengawali penglepasan proteolitik sel efektor
kemotaktik / agen aktivasi C3a dan C5a (Gambar 4b). Kaskade komplemen ini diakhiri dengan
formasi membrane attack complex (MAC) (Gambar c) sehingga terbentuk suatu lubang pada sel
membran. Membrane attack complex (MAC) memfasilitasi keluar masuknya air dan Na++ yang akan
menyababkan sel target lisis.

c.       Perubahan Transduksi Signal

Reseptor growth factor merupakan suatu antigen target tumor, ekspresinya berlebihan pada

keganasan. Aktivasi transduksi signal pada kondisi normal akan menginduksi respons mitogenik dan
meningkatkan kelangsungan hidup sel, hal ini diikuti dengan ekspresi perkembangan sel tumor yang
berlebihan yang juga menyebabkan tumor tidak sentitif terhadap zat kemoterapi. Antibodi
monoklonal sangat potensial menormalkan laju perkembangan sel dan membuat sel sensitif
terhadap zat sitotoksik dengan menghilangkan signal reseptor ini. Target antibodi EGFR merupakan
inhibitor yang kuat untuk transduksi signal.

Terapi antibodi monoklonal memberikan efek penurunan densiti ekspresi target antigen
contohnya penurunan konsentrasi EGFR permukaan sel tumor atau membersihkan ligan seperti
VEGF. Pengikatan ligand reseptor growth factor memicu dimerisasi dan aktivasi kaskade signal
(gambar a) sehingga terjadi proliferasi sel dan hambatan terhadap zat sitotoksik (gambar b). Antibodi
monoklonal menghambat signal dengan cara menghambat dimerisasi atau mengganggu ikatan
ligand.

d.      Antibodi  Directed  Enzyme  Prodrug  Therapy (ADEPT)

Antibodi directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) adalah cara penggunaan antibodi

monoklonal sebagai penghantar enzim dan obat-obatan untuk sampai ke sel kanker. Enzimyang
dibawa oleh antibodi monoklonal akan mengaktifkan obat-obatan sehingga dapat meningkatkan
kerja obat untuk membunuh sel-sel kanker. Selain obat-obatan, antibodi monoklonal juga dapat
digabungkan dengan partikel radioaktif untuk dikirimkan langsung pada sel kanker.

 Bisa juga sebagai penghantar untuk sampa ike sel tumor kemudian enzim

mengaktifkan prodrug pada tumor, hal ini dapat meningkatkan dosis active drug di dalam tumor.
Konjugasi antibodi monoklonal dan enzim mengikat antigen permukaan sel tumor (Gambar 5a)
kemudian zat sitotoksik dalam bentuk inaktif prodrug akan mengikat konjugasi antibodi monoklonal
dan enzim permukaan sel tumor (Gambar b-c) akhirnya inaktivasi prodrug terpecah dan
melepaskan active drug di dalam tumor.

6.      Contoh Aplikasi Antibodi Monoklonal Pada kanker Paru

Kanker paru salah satu penyebab tersering kematian di Amerika. Kanker Paru Karsinoma Bukan Sel
Kecil (KPKBSK) mewakili kira-kira 80% total keganasan pulmoner, sayangnya kebanyakan pasien
KPKBSK datang dengan stage lanjut dan prognosisnya buruk. Data karakteristik kanker
paru Indonesian association for the study of lung cancer  (IASLC) menunjukkan kasus pada laki – laki
masih lebih tinggi dari perempuan tetapi perempuan cenderung meningkat dan sebagian besar
adalah perokok. Insidens kanker paru ditemukan meningkat pada usia lebih 60 tahun dan
kebanyakan stage lanjut. Teori dasar genetik dan molekuler KPKBSK sudah berkembang pesat seperti
terapi bedah, kemoterapi konvensional dan radiasi tetapi lama tahan hidup 5 tahun pasien masih
rendah dan hal ini merupakan tantangan masa depan. Selama dekade terakhir ini beberapa molekul
yang berperan pada progresiviti kanker paru dan metastasis telah diidentifikasi. Strategi dasar terapi
masih dalam perkembangan dan diharapkan pendekatan baru ini akan memperbaiki lama tahan
hidup pasien pasien kanker paru stage lanjut.  Pasien dengan KPKBSK stage lanjut kemoterapi atau
kombinasi radioterapi dipertimbangkan sebagai terapi standar. Terapi ini sebagian memberikan hasil
perbaikan  lama tahan hidup pasien tetapi prognosisnya masih tetap buruk, terapi ini tidak spesifik
dan tidak selektif serta toksik karena itu strategi terapi baru masih diperlukan.

Perubahan paradigma terjadi pada terapi KPKBSK dan beberapa tumor lain setelah perkembangan
target spesifik tumor. Growth factor dan faktor proangiogenik telah difokuskan pada penelitian
kanker sampai ditemukannya terapi inhibitornya. Sejumlah molekuler terapi target telah terbukti
efikasinya dan telah diakui sebagai terapi spesifik kanker. Penelitian utama adalah inhibitor EGFR
famili, inhibitor angiogenesis, inhibitor transduksi signal, induksi apoptosis dan imunoterapi.

Penelitian klinis lanjut kanker paru adalah terapi target yang menghambat jalur transduksi signal
EGFR dan VEGF. Beberapa zat tersebut adalah inhibitor EGFR antibodi monoklonal ″Trastuzumab″
(Herceptin), ″Cetuximab″ (Erbitux), inhibitor EGFR tyrosine kinase (Iressa) dan inhibitor angiogenesis
antibodi monoklonal VEGF ligand. Sejumlah zat tersebut telah memasuki fase penelitian klinis lanjut.
Terapi target dapat diaplikasikan dalam kombinasi kemoterapi sitotoksik atau terapi radiasi semua
stage terapi termasuk terapi rumatan. Terapi biologis baru ini akan digunakan sebagai kombinasi
rasional berdasarkan diagnosis patologi untuk KPKBSK stage lanjut.

Tujuan penelitian molekuler terapi target juga termasuk mempelajari peranan khusus growth
factor pada tumor spesifik, penetapan desain penelitian klinis baru untuk zat biologi, kombinasi
dengan kemoterapi konvensional dan radioterapi yang disesuaikan pada kondisi pasien. Pencapaian
tujuan ini diharapkan dapat memberikan keuntungan pasien kanker paru. Semua terapi ini harus
disesuaikan kondisi pasiennya yang diharapkan akan menunjukkan perubahan kontrol tumor dan
menyembuhkan gejala kanker paru.

Sucrose transporter (SUT)

Sukrosa merupakan senyawa karbon hasil fotosintesis yang berperan penting terhadap
pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Huber and Huber, 1996). Sucrose transporter (SUT)
merupakan protein translokator pada proses translokasi hasil fotoasimilasi dalam bentuk sukrosa
dari organ source (pembuat) menuju organ sink (penyimpanan). Protein SUT disandikan oleh gen
SUT (Aoki et al., 2003). Sukrosa ditranslokasikan dari organ source melalui phloem (loading) menuju
organ sink (unloading) (Hackel et al., 2006). Translokasi sukrosa dari organ source ke organ
penyimpanan (sink) mengikuti jalur symplast dan apoplast. Secara symplast translokasi sukrosa
terjadi dari sel melalui plasmodesmata, yang terjadi pada jaringan meristem dan organ tanaman
yang masih muda. Secara apoplast sukrosa ditranslokasikan melewati dinding sel dan ruang
interseluler jaringan (Patrick 1997; Lalonde et al., 2003).

Translokasi sukrosa merupakan bentuk pengangkutan aktif, disebut sebagai sucrose proton symport
(Riesmeier et al., 1993). Proses translokasi ini diperantarai oleh protein transporter yang terdapat
pada membran plasma dan membutuhkan energi (Riesmeier et al., 1992). Pada tanaman monokotil
dan dikotil, protein transporter tersebut diidentifikasi sebagai sucrose transporter (SUT) (Lemoine,
2000). Khun dan Crishtopher (2010) melaporkan bahwa lokasi sucrose transporter dalam sel
terdapat pada membran plastid (SUT4), membran tonoplast (SUT4), dan membran plasma (SUT1,
SUT2 dan SUT3), Transportasi sukrosa pada tanaman tingkat tinggi dilaporkan oleh Giaquinta (1976)
bahwa sukrosa di translokasikan secara aktif kedalam phloem secara apoplasmik yang melibatkan
protein yang mengandung ikatan sulfhydryl. Sejak itu, banyak penelitian tentang kloning gen sucrose
transporter dari spesies yang berbeda- beda (Sauer, 2007). Pada beberapa tanaman, gen sucrose
transporter telah ditemukan seperti OsSUT1, OsSUT3 pada padi (Oryza sativa L.) (Yu et al., 2000),
AtSUC1, AtSUC2, AtSUC5 pada Arabidopsis (Sauer et al., 2004), LeSUT1, LeSUT2 pada tomat (Hackel
et al., 2006) dan SoSUT1, SoSUT2 pada tebu (Sugiharto et al., 2010).

Pembuatan Antibodi Poliklonal

Antibodi poliklonal merupakan kelompok antibodi yang diproduksi oleh lymfosit-B pada respon
antigen yang sama. Produksi antibodi poliklonal melalui imunisasi hewan melibatkan injeksi antigen,
pemilihan adjuvant, pemilihan hewan dan pengumpulan antibodi (Leenaars dan Hendriksen, 2005).

Sistem imun pada hewan sangat sensitif karena dapat mendeteksi unsur terkecil dari suatu antigen.
Spesifitas antibodi dapat ditingkatkan dengan pemisahan protein terlebih dahulu kedalam subunit
dan menginjeksi hewan uji hanya dengan satu tipe polipeptida. Kemampuan antigen untuk
menginisiasi respon imun sangat beragam, antigen biasanya dicampur dengan adjuvant dalam
sampel sebelum diinjeksikan (Cooper, 1977).

Adjuvant adalah zat yang digunakan untuk meningkatkan respon imun terhadap antigen dan
mencegah agar antigen tidak cepat hilang dari jaringan. Adjuvant Freund’s merupakan adjuvant yang
sangat kuat. Aktivitasnya diperkuat oleh bagian aktif mikobakteri yaitu muramil dipeptida. Muramil
dipeptida merangsang fungsi makrofag dan merangsang respon antibodi yang kuat dalam waktu
lama. Adjuvant bertindak khusus untuk merangsang fungsi sel T dan hanya meningkatkan reaksi
antigen tergantung timus. Freund’s complete adjuvant digunakan pada injeksi antigen pertama,
sedangkan Freund’s incomplete adjuvant digunakan untuk injeksi antigen kedua dan selanjutnya
(Cooper, 1977).

Selain pemberian adjuvant, pemilihan spesies hewan yang akan digunakan yang sesuai sangat
penting khususnya ketika memproduksi antibodi poliklonal. Hewan yang akan digunakan seharusnya
berbeda dari hewan sebagai sumber antigen. Hewan yang sering digunakan untuk produksi antibodi
adalah kelinci karena lebih mudah, lebih murah memiliki respon imun yang kuat dan dapat diambil
serum darah berulang-ulang tanpa mengganggu kelinci tersebut. (Lipman, 2005). Usia kelinci yang
umum digunakan adalah umur 10-16 minggu. Kelinci yang lebih tua tidak digunakan untuk produksi
antibodi karena pada usia ini sistem kekebalan tubuh berada pada puncaknya dan kemampuan
untuk merespon antigen baru mengalami penurunan karena usia. Kelinci betina lebih sering
digunakan karena lebih jinak. Telah dilaporkan bahwa kelinci betina sensitif terhadap dosis antigen
yang lebih rendah dan mungkin secara signifikan lebih tinggi dan lebih lama merespon imunisasi
dibandingkan kelinci jantan (Leenaars dan Hendriksen, 2005).