Kelompok 3

Istiqomah (0121184-001)
Nurmala Maulidina H. (0121184-074)

METODE ANALISIS
MIKROBA TANAH
 Daftar Isi
01 03
Mikroorganisme Macam-Macam Metode
Pengelompokkan Analisis Mikroba Tanah
mikroorganisme Berbagai metode analisis mikroba
berdasarkan habitatnya tanah yang berkembang sesuai
kebutuhannya

02 04
Mikroba Tanah
Berbagai mikroba yang Studi Kasus
sering ditemukan di
tanah
 01
Mikroorganisme
Mikroorganisme merupakan makhluk
hidup yang berukuran mikroskopik.
Makhluk hidup yang termasuk
mikrobiologi antara lain eubacteria,

About
archaea, fungi, dan protista. Sedangkan
untuk virus dan prion tidak diklasifikasikan
dalam mikroorganisme karena dianggap
sebagai makhluk tak hidup
Microorganism
(University of Bergen, 2021)
Klasifikasi Mikroorganisme
Kingdom Habitat Suhu Lingkungan
Eubacteria, Terrestrial, Psychrophile, Mesophilic,
Archaea, Fungi, akuatik, daratan, Thermophilic,
Protozoa, Algae host cell Hyperthermophilic

Kandungan garam lingkungan Pewarnaan Gram

Halofilik dan Gram positif dan
halotolerant gram negatif
 02
Mikroorganisme
Tanah
 Bacteria
Actinomycetes

Fungi Protozoa
Nematoda

Mikroorganisme Algae

Tanah
03
Metode Analisis
Mikroba Tanah
 Beberapa metode untuk mempelajari mikroorganisme
Menurut tanah telah distandarisasi sejak 1997. Dikarenakan potensi

L. Philippot
degradasi tanah yang berkaitan dengan kontaminasi lokal dan
difusi atau hilangnya keanekaragaman hayati mikroorganisme

et al. (2012) tanah. Sehingga berikutnya dikembangkan berbagai metode

terstandar untuk mengukur dan mengidentifikasi pencemaran
kimia bahkan dampaknya terhadap aktivitas berbagai
mikroorganisme.
Tahun Metode ISO Daftar Pustaka

1997 Determination of soil microbial biomass ISO 14240-1 Jenkinson & Powlson (1976);
– part 1: substrate-induced respiration Anderson & Domsch (1978)
method

1997 Determination of soil microbial biomass
– part 2: fumigation-extraction method
ISO 14240-2 Brookes et al. (1985); Vance et
al. (1987); Ocio & Brookes
(1990); Sparling et al. (1990);
Wu et al. (1990); Inubushi et al.
(1991); Mueller et al. (1992);
Harden et al. (1993a, b)

1997 Determination of nitrogen ISO 14238 Bremner (1965); Henriksen &

mineralization and nitrification in soils Selmer-Olsen (1970);
and the influence of chemicals on these Selmer-Olsen (1971); Stanford
processes & Smith (1972); Andersch &
Anderson (1991)
Tahun Metode Acuan ISO Daftar Pustaka

2002 Determination of abundance and activity ISO 17155 Anderson & Domsch (1978);
of soil microflora using respiration Nordgren et al. (1988);
curves Arnebrant & Schnurer (1990);
Chander & Brookes (1991); Van
Beelen et al. (1991); Stenstrom
et al. (1998); Wilke et al. (1998)

2002 Soil quality – guidance on laboratory
testing for biodegradation of organic
chemicals in soil under anaerobic
conditions
ISO 15473 Beland et al. (1974); Gowda &
Sethunathan (1976); Healy &
Young (1979); Attaway et al.
(1982); Kearney (1982); Shelton
& Tiedje (1984); Ward (1986);
Alef & Nannipieri (1995)

2002 Laboratory methods for determination of ISO 16072 Gupta & Singh (1977);
microbial soil respiration Nordgren (1988); Watts et al.
(2000)
Tahun Metode Acuan ISO Daftar Pustaka

2004UR Determination of potential nitrification ISO 15685 Belser & Mays (1980); Hansson
and inhibition of nitrification – rapid test et al. (1991); Stenberg et al.
by ammonium oxidation (1998); Winkel et al. (1999)

2005 Determination of dehydrogenase activity ISO 23753-1 Thalmann (1968); Glathe &
in soils – part 1: method using Thalmann (1970); Wilke (1982);
triphenyltetrazolium chloride (TTC) Ohlinger (1995)

2005 Determination of dehydrogenase activity ISO 23753-2 Thalmann (1968); Glathe &
in soils – part 2: method using Thalmann (1970); vonMersi &
iodotetrazolium chloride (INT) Schinner (1991);
Spothelfer-Magan˜ a et al.
(1993); Fuchs et al. (1994);
Ohlinger (1995)

2010 Measurement of enzyme activity ISO 22939 Tabatabai (1994); Stemmer et

patterns in soil samples using al. (1998); Marx et al.(2001);
fluorogenic substrates in micro-well Vepsa¨ la¨ inen et al. (2001,
plates 2004); Marx et al. (2005);
Tahun Metode Acuan ISO Daftar Pustaka

2010 Determination of soil microbial diversity
– part 1: method by PLFA analysis and
PLEL analysis
ISO 29843-1 Blight & Dyer (1959); White et
al. (1979); Findlay et al. (1990);
Frostega° rd et al. (1991); Zelles
& Bai (1993); Alef & Nannipieri
(1995); Zelles (1999); Gattinger
et al. (2003)

2011 Determination of soil microbial diversity ISO 29843-2 Blight & Dyer (1959); White et
– part 2: method by PLFA analysis using al. (1979); Zelles & Bai (1993);
the ‘simple PLFA extraction method’ Gattinger et al. (2003)

2011UR Method to directly extract DNA from soil ISO 11063 Tsai & Olson (1991); Smalla et
samples al. (1993); Zhou et al. (1996); van
Elsas et al. (2000);
Martin-Laurent et al. (2001);
Niemi et al. (2001)
Metagenomik
Metagenomik merupakan metode identifikasi
genetik mikroba secara langsung dari genom yang
terkandung dalam sampel lingkungan.
(Torsten Thomas dkk, 2012).

Metode metagenomik ini sangat

menguntungkan bagi mikroba - mikroba yang tidak
dapat dikulturkan di laboratorium dikarenakan DNA
langsung diekstraksi di lingkungan. Metagenomik
telah diterapkan untuk menganalisis komunitas
mikroba di usus manusia, pada limbah tanaman, dan
pada lingkungan hypersalin (kadar garam tinggi)
(Fitra Adi Prayogo dkk, 2020)
Metagenomik
Terdapat 4 macam pendekatan metagenomik:
- Metagenomik tertarget ⇒ pendekatan yang paling sering digunakan untuk mengetahui keragaman
filogenetik dan kelimpahan dari gen tertentu dalam suatu sampel. Pendekatan ini juga banyak
digunakan untuk menganalisis keragaman urutan rRNA subunit kecil (16S/18S RNA) di dalam sampel.
- Metagenomik shotgun ⇒ analisis komunitas dalam satu lingkungan melalui sekuensing genom. Pada
pendekatan ini, preparasi data pengurutan DNA dari sampel lingkungan dengan ekstraksi dan
fragmentasi. Kemudian, data diurutkan untuk menentukan total konten genom dari sampel tersebut.
- Metatranskriptomik ⇒ pendekatan dengan mengekstraksi RNA yang kemudian dilakukan transkipsi
menjadi cDNA. Selanjutnya, hasil diurutkan dengan cara yang sama seperti metagenomik tertarget.
- Metaproteomik ⇒ pendekatan menggunakan LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometer) dan
enzymatic digest. Metaproteomik memberikan informasi mengenai protein pelengkap yang ditemukan
dalam sampel lingkungan termasuk modifikasi pasca-translasi dalam protein yang dapat
mempengaruhi aktivitasnya.
(Stephen M. Techtmann dan Terry C. Hazen, 2016)
 Metagenomik
https://www.youtube.com/watch?v=TnWeVUx5ERU

https://www.youtube.com/watch?v=as09J0z_UOc

https://www.youtube.com/watch?v=kXYJ_Dc9qcc
 Biosensor
Biosensor adalah perangkat yang memanfaatkan interaksi alami antara analit yang perlu dideteksi
dan biomolekul. Respon biologis diubah menjadi sinyal listrik oleh transduser. Transduser adalah
perangkat yang memanfaatkan berbagai fenomena fisik dan/atau kimia untuk mengidentifikasi
interaksi biologis dan mengubahnya menjadi sinyal terukur. Beberapa mekanisme transduksi yang
paling umum adalah optik, listrik, elektrokimia, piezoelektrik dan kalorimetri. Setelah sinyal diubah oleh
transduser, sinyal diproses dan hasil ditampilkan sebagai gambar, angka atau grafik.
Beberapa biosensor yang masih dikembangkan hingga saat ini adalah biosensor berbasis enzim,
sensor asam nukleat, imunosensor, sensor berbasis organel, sensor sel utuh, biosensor sintetik, dan
biosensor inferface.
Selain itu, pada penelitian T. Petanen dkk (2001), biosensor dilakukan dengan menggunakan sistem
biosensing berbasis lux yang memanfaatkan Pseudomonas fluorescens rekombinan.
 Biosensor
Berdasarkan mekanisme transduksi, biosensor dibagi dalam beberapa macam :
● Biosensor optik : spektroskopi absorpsi, biosensor chemiluminescent, biosensor
photoluminescent, sensor refraktometri
● Biosensor fibre optik : sensor evanescent field, biosensor fibre tip, biosensor
microstructured optical fibre
● Biosensor elektrik atau elektrokimia : biosensor amperometric, biosensor impedimetric,
biosensor conductometric, biosensor potentiometric
● Biosensor elektrokimia berbasis nanomaterial : biosensor berbasis carbon nanotubes
(CNTs), biosensor berbasis grafit, biosensor berbasis nanopori, biosensor piezoelektrik,
biosensor kalorimetrik.
(Agnieszka A Zuber dan Elizaveta Klantsataya and Akash Bachhuka, 2018)
Fluorescent in situ
hybridization (FISH)
Metode untuk mengidentifikasi secara
langsung dan mengkuantifikasi kelompok
prokariotik baik spesifik maupun general dari
takson mikroorganisme di habitat aslinya
(Amann et al., 1995; Assmus et al., 1995;
MacNaughton et al., 1996; Kenzaka et al., 1998).
Metode FISH menggunakan sel utuh
yang fix (16S atau 23S rRNA) terhibridisasi
dengan oligonukleotida probes berlabel
fluoresensi takson spesifik, yang kemudian
sel berlabel dilihat dengan mikroskop laser
confocal (SCLM) (Ludwig et al., 1997; Wallner
et al., 1997; Felske et al., 1998a)
https://www.youtube.com/watch?v=b81DcJC1jAs
 04
Studi Kasus
Judul : Improved detection of soil
microorganisms using fluorescence in
situ hybridization (FISH) and
catalyzed reporter deposition
(CARD-FISH)

Penulis : Thilo Eickhorst, Rolf

Tippkotter

Tahun terbit : 2008

 Pendahuluan
Metode standar dalam menganalisis kelompok prokariotik semakin berkembang,
salah satunya metode deteksi Fluorescence in situ hybridization (FISH) yang memanfaatkan
fluoresen probe oligonukleotida berlabel yang hibridisasikan ke mikroorganisme target
pada tingkat filogenetik yang berbeda dapat dideteksi dengan mikroskop fluoresensi.
Walaupun metode ini cukup akurat dan populer, metode FISH cukup jarang digunakan
untuk analisis mikroba tanah. Hal ini dikarenakan efek autofluorescent yang muncul
akibat perpendaran partikel tanah dan terbatas pada kelompok mikroba dengan
kandungan ribosome content yang tinggi.

Efek ini bisa diatasi melalui ekstraksi bakteri sampel dengan Nycodenz terlebih
dahulu sebelum analisis FISH, serta penambahan katalis (CARD-FISH) saat proses
analisis.
Metodologi
- Liu Jia (28°14’N, 116°55’E; Jiangxi Province) - Hope (52°37’N, 9°39’E)
- Sun Jia (28°13’N, 116°53’E; Jiangxi Province) - Stockendrebber (52°40’N, 9°35’E)
- Jinjiaba (31°05’N, 120°46’E; Jiangsu Province) - Ahausen (53°00’N, 8°56’E)

Sampel Tanah
Preparasi Sampel
1. Ditimbang 0.5 cm3 sampel tanah yang baru diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi
berukuran 2 mL
2. Untuk fiksasi, ditambahkan 32o mL larutan paraformaldehida 25% murni (b/v) (konsentrasi akhir
4%) dan diisi dengan 1 x PBS (Phosphate-buffered saline) kemudian dicampurkan secara merata
hingga terbentuk suspensi. Hasil suspensi disimpan pada suhu 4°C selama 5 jam
3. Sampel dicuci menggunakan 1 x PBS sebanyak 2 kali, disentrifugasi pada 10.000 xg selama 5 menit
dengan suhu 4°C setiap selesai pencucian.
4. Sampel yang sudah dicuci disimpan dalam PBS/etanol (1:1) pada suhu -20°C untuk pengolahan lebih
lanjut
5. 100 µL sampel dilarutkan dalam 900 µL PBS/etanol kemudian didispersikan menggunakan
ultrasonic probe pada daya minimum (10%) selama 20 detik menggunakan 1-s sonication pulse
6. Sampel paralel untuk tiap tanah disonifikasi 2 kali selama 30 detik menggunakan energi dan laju
pulse yang sama yang diselingi jeda 3o detik
CARD-FISH pada Kaca Preparat
1. 30 µL sampel terdispersi dicampur dengan 60 µL 1 x PBS, 10 µL SDS 10% (w/v), dan 10 µL
agarosa 1% (w/v) bertitit leleh rendah pada suhu 55°C
2. 10 µL suspensi sampel dipipet dalam lubang preparat kaca 10-lubang yang telah dilapisi
epoksi. Preparat dikeringkan dalam inkubator pada suhu 37°C dan didehidrasi
menggunakan etanol secara bertingkat (50% selama 5 menit, 80% selama 1 menit dan 98%
selama 1 menit)
3. Tiap lubang pada preparat dengan agarosa 10 µL larutan lisozim (10 mg lisozim + 100 ml
EDTA 0.5 M (pH 8.0) + 100 ml Tris–HCl 1 M (pH 8.0) + 800 ml MQ H2O)
4. Preparat diinkubasi dalam tabung PE-terhumidifikasi dengan ukuran 50 mL pada suhu 37°C
selama 1 jam kemudian dicuci menggunakan 50 mL MQ air serta didehidrasi menggunakan
etanol secara bertingkat (50% selama 5 menit, 80% selama 1 menit dan 98% selama 1 menit)
5. Aktivitas peroksidase endogen dimatikan dengan menambahkan 0.15% H2O2 dalam metanol
kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang dan dicuci menggunakan etanol
6. Probe oligonukleotida yang digunakan untuk prosedur CARD-FISH diberi label dengan
enzim horseradish peroxidase (HRP) pada ujung 5’. Sebagai kontrol untuk pengikatan non
spesifik, nonsense probe NONEUB digunakan
CARD-FISH pada Kaca Preparat
Probe Spesifikasi Sekuens (5’ - 3’) Referensi

EUB338 (I - III) Bakteri Campuran EUB338, EUB338 II, EUB 338 III Daims dkk (1999)

EUB338 Bakteri GCT GCC TCC CGT AGG AGT Amann dkk (1990)

EUB338 II Planctomycetes GCA GCC ACC CGT AGG TGT Daims dkk (1999)

EUB338 III Verrucomicrobium GCT GCC ACC CGT AGG TGT Daims dkk (1999)

NONEUB Nonsense EUB338 ACT CCT ACG GGA GGC AGC Wallner dkk (1993)

ARCH915 Archae GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT Stahl dan Amann (1991)
CARD-FISH pada Kaca Preparat
1. Buffer hibridisasi dibuat dari campuran NaCl 0.9 M, Tris–HCl 20 mM (pH 8.0), dextran sulfate
10% (b/v), reagent penghambat 2% (b/v), natrium dodesil sulfat 0,1% (b/v), formamida 55% (v/v)
2. Larutan reagent stok penghambat (10% b/v) disiapkan dalam buffer asam maleat (asam maleat
100 mM, NaCl 150 mM (pH 7.5))
3. Untuk satu preparat, 100 ml buffer hibridisasi dicampur dengan 2 ml larutan kerja probe (50
ng µL-1) dan 10 ml probe-yang-diubah dan dipindahkan pada setiap lubang preparat
4. Hibridisasi preparat dilakukan dalam inkubator pada suhu 37°C selama 2 jam dan setiap
preparat ditempatkan dalam tabung plastik 50 ml yang dilembabkan dengan buffer hibridisasi
berlebih
5. Setelah hibridisasi, preparat dipindahkan ke dalam tabung yang berisi 50 ml buffer pencuci
yang telah dihangatkan sebelumnya (NaCl 3 mM, EDTA 5 mM (pH 8.0), Tris–HCl 20 mM (pH
8.0), SDS 0,01% (b/v))
6. Pencucian probe yang tidak terikat dilakukan dalam inkubator pada suhu 37°C selama 30
menit
7. Preparat ditutup dengan Triton X-100 0,05% (v/v) diubah PBS selama 15 menit pada suhu
kamar. Kelebihan cairan diseka dengan hati-hati
8. TSA (Tyramide signal amplification) ditampilkan dengan inkubasi preparat pada
37°C selama 30 menit dengan campuran substrat (1 µl tiramida berlabel
fluorescein ditambahkan ke 5oo µL buffer amplifikasi (1 x PBS (pH 7,4), H2O2
0.0015%, reagen pemblokiran 0,1% (b/v)))
9. Preparat ditutup dengan Triton X-100 yang diubah dengan PBS selama 15 menit
pada suhu kamar, kemudian preparat dibilas menggunakan air MQ dan
didehidrasi etanol secara bertingkat (50% selama 5 menit, 80% selama 1 menit
dan 98% selama 1 menit)
CARD-FISH pada Filter Polikarbonat
1. 20 µL sampel terdispersi diencerkan dengan 10 µL air MQ
2. Suspensi disaring menggunakan filter polikarbonat (pori-pori 0.2 µm, diameter 25 mm)
yang diletakkan dalam wadah kaca (area filtrasi 3 cm2) dengan vakum 800 hPa
3. Filter dicelupkan ke dalam agarosa 0.2% bertitik leleh rendah kemudian dikeringkan
dalam inkubator pada suhu 46°C
4. Filter diinkubasi dengan larutan lisozim kemudian ditempatkan dalam cawan petri
tertutup pada suhu 37°C selama 1 jam dan dicuci menggunakan air MQ
5. Filter diinkubasi dalam metanol yang mengandung H2O2 0.15% selama 30 menit pada
suhu kamar untuk menonaktifkan aktivitas peroksidase endogen kemudian dicuci
dengan air MQ dan dikeringkan dengan mencelupkannya ke dalam etanol 98% dan
dikeringkan dengan udara. Setelah litu, filter disimpan pada suhu 20°C untuk diproses
lebih lanjut
CARD-FISH pada Filter Polikarbonat
6. Untuk hibridisasi in situ, sebagian filter dipotong dan ditempatkan dalam tabung reaksi 500 µL
(lima bagian filter sekaligus).
7. Ditambahkan buffer hibridisasi (300 µL) dengan konsentrasi formamida 35% (v/v) dicampur
dengan 2 ml larutan kerja probe (50 ng µL-1). Hibridisasi dilakukan pada 35°C selama 2 jam pada
rotor dalam oven hibridisasi
8. Setelah hibridisasi, filter dipindahkan ke buffer pencuci yang telah dipanaskan sebelumnya
dengan konsentrasi NaCl 42 mM. Filter tetap dalam buffer pencuci pada 37°C selama 10 menit
kemudian dipindahkan ke Triton X-100 0,05% (v/v) diubah PBS selama 10 menit. Kelebihan
cairan dari filter dibersihkan
9. Filter diinkubasi dalam 300 µLl campuran substrat yang digunakan untuk prosedur pada
preparat pada rotisserie pada 37°C selama 15 menit dalam oven shaded hibridisasi
10. Filter kemudian dicelupkan ke dalam Triton X-100 0,05% (v/v) diubah PBS selama 10 menit
kemudian dicuci dalam air MQ dan didehidrasi dengan etanol 98%
Pewarnaan Tambahan
1. FISH dengan probe oligonukleotida berlabel mono dilakukan dengan
sampel yang disiapkan pada preparat kaca seperti yang dijelaskan
oleh Eickhorst dan Tippkotter (2008).
2. Preparat ditambah dengan larutan lisozim yang digunakan untuk
CARD-FISH, guna menyelidiki efek permeabilitas dinding sel pada
probe berlabel berlabel mono.
3. Pewarnaan penahan (counterstain) dilakukan menggunakan larutan
4’,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) 0,5% (b/v) mengikuti langkah
terakhir dari prosedur FISH dan CARD-FISH.
4. Tingkat deteksi dihitung dengan fraksi sel bernoda DAPI yang
terdeteksi dengan FISH atau CARD-FISH
CARD-FISH pada Filter Polikarbonat
6. Untuk hibridisasi in situ, sebagian filter dipotong dan ditempatkan dalam tabung reaksi 500 µL
(lima bagian filter sekaligus).
7. Ditambahkan buffer hibridisasi (300 µL) dengan konsentrasi formamida 35% (v/v) dicampur
dengan 2 ml larutan kerja probe (50 ng µL-1). Hibridisasi dilakukan pada 35°C selama 2 jam pada
rotor dalam oven hibridisasi
8. Setelah hibridisasi, filter dipindahkan ke buffer pencuci yang telah dipanaskan sebelumnya
dengan konsentrasi NaCl 42 mM. Filter tetap dalam buffer pencuci pada 37°C selama 10 menit
kemudian dipindahkan ke Triton X-100 0,05% (v/v) diubah PBS selama 10 menit. Kelebihan
cairan dari filter dibersihkan
9. Filter diinkubasi dalam 300 µLl campuran substrat yang digunakan untuk prosedur pada
preparat pada rotisserie pada 37°C selama 15 menit dalam oven shaded hibridisasi
10. Filter kemudian dicelupkan ke dalam Triton X-100 0,05% (v/v) diubah PBS selama 10 menit
kemudian dicuci dalam air MQ dan didehidrasi dengan etanol 98%
 Pengamatan dan Numerasi
1. Preparat berisi sampel tanah yang sudah distain menggunakan FISH/CARD-FISH ditutup kaca deg
glass yang diberikan campuran Citifluor AF1 75% (v/v), VectaShield H-1000 15% (v/v) dan 1 x PBS 10%
(v/v) untuk mencegah cepatnya pemutihan sinyal probe dan sinyal tyramide. Hal yang sama dilakukan
pada sampel yang menggunakan filter
2. Sampel diamati menggunakan mikroskop Zeiss Axioskop 2 yang dilengkapi dengan lampu uap HBO
103 W/2 Hg, set filter yang sesuai (02, 09, 15, 24) dan tiga objektif (Plan-Neofluar 40 , 63 , 100)
3. Imaging dilakukan dengan kamera CCD yang terhubung ke imaging software (AnalySIS 3.2)
4. Penghitungan sel dilakukan pada 20-25 mikrograf yang dipilih secara acak yang diambil dengan
objektif 63 x (23.900 µm2) dan 100 x (9.500 µm2) kemudian diekstrapolasi ke 1 g tanah. Untuk probe
berlabel fluoresen dan tiramida, eksitasi biru digunakan sebelum eksitasi UV karena energi UV yang
tinggi diduga dapat melemahkan pewarna fluoresen
5. Penghitungan otomatis dilakukan dengan software analisis gambar AnalySIS 3.2 dengan mikrograf
yang menunjukkan kontras tinggi antara sel yang diwarnai dan fluoresensi latar belakang. Nilai
ambang batas ditetapkan oleh software analisis. Tingkat deteksi minimum ditetapkan pada 4 piksel
untuk mikrograf yang diambil dengan objektif 63x dan 10 piksel untuk objektif 100x. Jumlah piksel ini
mewakili partikel berdiameter 0.2 µm, yang merupakan partikel terkecil yang tersisa pada filter
polikarbonat. Piksel yang lebih kecil menunjukkan sinyal probe harus berasal dari noise di mikrograf.
Urutan auto-enumeration ditunjukkan pada gambar berikut.
Pengamatan
dan
Numerasi
Hasil dan Pembahasan
 Visualisasi Noda Sel pada FISH
Deteksi mikroorganisme tanah
yang dihibridisasi menggunakan
FISH berlabel mono menunjukkan
hasil terbaik ketika menggunakan
probe oligonukleotida berlabel
fluoresens.
Tapi, probe ini hampir tidak
terdeteksi pada jenis tanah sawah
dan lempung (a). Penggunaan
eksitasi ganda menunjukkan hasil
visualisasi yang lebih baik seperti
pada struktur agregat lempung,
sehingga perhitungan sel lebih
akurat (b)
➔ Visualisasi menggunakan eksitasi sinar biru (450-490 nm) mampu menampakkan
sinyal probe. Namun terdapat beberapa area yang mirip tanah dengan warna dan
intensitas sama dengan cahaya pancaran dari probe berlabel fluorescein terhibridisasi
bakteri.
➔ Visualisasi menggunakan eksitasi sinar hijau (534-558 nm) menghasilkan
autofluoresensi murni dari hifa dan beberapa mineral dalam sampel berwarna merah.
➔ Visualisasi dengan eksitasi ganda (465-505 dan 564–892 nm) mampu mengeksitasi
probe berlabel fluoresen yang dihibridisasi dengan bakteri dan autofluoresensi sampel
tanah dengan hasil berupa emisi warna yang berbeda.
➔ Counterstain dengan DAPI menunjukkan masih sedikitnya sel yang menempel pada
baik dan jelas yang dapat dideteksi di tanah sawah dan lempung (Ahausen)
dibandingkan dengan sonikasi berlabel mono.
Visualisasi Noda Sel pada FISH
Intensitas noda sel CARD-FISH lebih
tinggi setelah dilakukan TSA. Hasil ini
juga lebih baik daripada menggunakan
FISH berlabel mono. CARD-FISH yang
diterapkan pada sampel tanah yang
disiapkan pada preparat kaca
kekurangan waktu pemaparan hingga
400 ms dibandingkan untuk FISH
berlabel berlabel mono yang
membutuhkan waktu pemaparan hingga
2000 ms (objektif 100x). Interferensi
disebabkan oleh autofluoresensi partikel
tanah sangat tinggi pada tanah dengan
kandungan liat yang lebih tinggi
Total sel mikroba dengan visualisasi DAPI ditunjukkan pada tabel berikut:

FISH Berlabel Mono (sel g-1 berat

CARD-FISH (sel g-1 berat kering)
kering)
Tempat (Tekstur)
Sel Prokariot DAPI (%) Sel Prokariot DAPI (%)

Hope (Pasir) 8 53 8 94
1.95 (±0.64) x 10 3.47 (±1.23) x 10

Stockendrebber (Lumpur Lempung) 8 58 8 89

2.59 (±0.93) x 10 3.99 (±0.87) x 10

Ahausen (Lempung) 8 54 8 86
1.62 (±0.47) x 10 2.57 (±1.30) x 10

Liu Jia (Lempung berpasir) 9 51 9 77

2.56 (±0.62) x 10 3.84 (±0.84) x 10

Sun Jia (Lempung) 9 37 9 67

3.57 (±0.53) x 10 6.42 (±0.74) x 10

Jinjiaba (Tanah liat berlumpur) 9 22 9 51

1.03 (±0.42) x 10 1.68 (±0.75) x 10
 Visualisasi Sel Bernoda
CARD-FISH pada Filter
Polikarbonat
Hasil perhitungan total sel ketika
CARD-FISH diaplikasikan pada filter
polikarbonat lebih tinggi
dibandingkan pada preparat kaca.
Visualisasi Noda Sel CARD-FISH
pada Filter Polikarbonat
Hasil mikrograf juga menunjukkan hasil
visualisasi yang lebih jelas walaupun terdapat
autofluoresensi kemerahan yang dipancarkan
oleh tanah. Hal ini memudahkan deteksi Archaea
dan Bacteria meskipun pada sampel tanah
lempung berpasir dan lempung (a). Deteksi pada
tanah lempung dengan lumpur sedikit
terganggu oleh latar berwana hijau berpendar.
Namun, intensitas sinyal hasil reaksi tiramida
cukup tinggi sehingga penghitungan sel dapat
tetap dilakukan (b).
Hasil Perhitungan Sel Secara Otomatis
Hasil perhitungan sel secara manual dan otomatis diberikan pada tabel berikut
Perhitungan Manual (Sel g-1 berat Perhitungan Otomatis (Sel g-1 berat
Tempat kering) kering)
(Tekstur)
Archaea Bacteria DAPI (%) Archaea Bacteria DAPI (%)

Liu Jia 4.02

1.08 (±0.23) x 1.03 (±0.21) 3.93 (±1.15)
(Lempung (±1.09) x 95 93
9 9 9
berpasir) 10 9 x 10 x 10
10

9.78
Sun Jia 1.56 (±0.19) x 1.44 (±0.20) 9.66 (±1.70)
(±1.51) x 91 89
(Lempung) 9 9 9
10 9 x 10 x 10
10

Jinjiabia 3.02
1.18 (±0.15) x 1.06 (±0.14) 2.92 (±0.56)
(Tanah liat (±0.53) x 89 85
9 9 9
berlumpur) 10 9 x 10 x 10
10
Laju deteksi perhitungan manual
dan otomatis ditunjukkan oleh
grafik berikut.
 Kesimpulan
Prosedur CARD-FISH adalah metode yang sangat baik untuk deteksi spesifik
mikroorganisme dalam sampel kompleks, misalnya tanah. Optimalisasi preparasi sampel dan
mikroskop epifluoresensi menghasilkan pewarnaan CARD-FISH yang akurat dan dapat
direproduksi mikroorganisme. Sel yang diwarnai mudah dibedakan tanpa terhalang
autofluoresensi karena (i) intensitas sinyal yang tinggi dari penggunaan tyramides pada
CARD-FISH dan (ii) double filter eksitasi menggunakan pewarna fluorescein. Berbeda halnya
dengan CARD-FISH ke sampel tanah di atas kaca berlapis epoksi slide, aplikasi untuk sampel
tanah yang disiapkan pada polikarbonat filter menyebabkan hasil yang lebih jelas untuk tanah
sawah. Karena penguatan sinyal TSA, metode ini sangat cocok untuk mendeteksi
mikroorganisme dengan kandungan konten rRNA rendah yang diakibatkan aktivitas fisiologi
yang rendah
Terimakasih…