Full

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM
SEDIAAN KAPSUL LUNAK OBAT HERBAL TERSTANDAR MEREK
RHEUMAKUR®
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
oleh:
Benny Nugroho
NIM: 078114027
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2011

RHEUMAKUR®
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
oleh:
Benny Nugroho
NIM: 078114027
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2011
ii
HALAMAN PERSEMBAHAN
Perjalanan Jauh Ribuan Mil
Dimulai Dari Langkah Pertama
Sebuah hasil perjuangan dan semangat...
Kupersembahkan untuk
Keluargaku
Sahabat dan almamaterku
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas
segala berkat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang
berjudul Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Pada
Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaan Kapsul Lunak Obat Herbal
Terstandar Merek Rheumakur® yang disusun sebagai salah satu syarat untuk
mencapai gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
Dalam serangkain proses skripsi yang telah dijalani, penulis
mendapatkan bantuan dari banyak pihak. Pada kesempatan ini penulis ingin
menyampaikan ucapan terima kasih kepada:
1. Mama tercinta yang telah memberikan doa dan semangat semoga cepat selesai
skripsi dan kuliahnya.
2. Ipang Djunarko, S.Si., Apt., M.Sc. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta dan sekaligus sebagai dosen pembimbing
akademik atas perhatian dan semangat yang diberikan kepada penulis selama
menjalani serangkaian proses skripsi.
3. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing atas segala
perhatian, dukungan, sentilan, dan semangat yang terus memotivasi penulis
dari proses kerja awal hingga proses akhir penyusunan skripsi ini.
4. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji atas saran dan kritik yang diberikan
serta semangat untuk terus maju.
viii
5. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji atas saran dan kritik yang
membangun.
6. Rini Dwi Astuti, M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium Farmasi Universitas
Sanata Dharma yang telah memberikan izin kepada penulis untuk melakukan
penelitian di laboratorium.
7. Prof. Dr. Sudibyo, M.S., Apt. yang telah memberikan senyawa baku kurkumin
untuk penelitian yang dilakukan oleh penulis.
8. Mas Bimo, Pak Timbol, Mas Kunto, Mas Parlan atas segala canda dan
bantuannya selama peneliti bekerja di laboratorium Kimia Analisis
Instrumental.
9. Segenap dosen pengajar, staf kesekretariatan, staf keamanan, dan laboran
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas dukungan dan bantuannya
dalam menyelesaikan skripsi ini.
10. Dian Prahara Florentino Wara dan Katarina Kusmiyanti sebagai rekan kerja
satu tim penulis, atas segala kerja sama sebelum penelitian, selama penelitian,
dan dalam proses penyusunan naskah skripsi atas kebersamaannya di saat
senang dan susah.
11. Lala, Toro, Katitik, Seno, Tere, Eliz, Yunita, Venny, dan Lilis sebagai bagian
dari tim besar penulis, atas segala kebersamaan sebelum proses penelitian,
selama proses penelitian, dan masukan serta ilmu pengetahuan yang sangat
berarti dalam proses penyusunan naskah skripsi.
12. Dika, Wawan, Yudhi, Ius atas bimbingan, bantuan, dorongan, hiburan, dan
semangat kepada penulis selama proses penyusunan skripsi.
ix
13. Teman-teman seperjuangan penulis selama proses penelitian: Wicak, Siwi,
Sere atas segala canda, dan semangat kepada penulis.
14. Lia Natalia Setiomulyo yang telah memberikan segenap rasa percaya,
dorongan, dan semangat kepada penulis.
15. Teman-teman FST 2007 atas kebersamaan bersama yang selalu mengenang di
hati penulis.
16. Semua orang yang telah membantu penulis dan tidak dapat disebutkan satu per
satu, terima kasih atas segala bentuk perhatian dan bantuan yang diberikan.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini belumlah sempurna, untuk itu
penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari para
pembaca yang diharapkan dapat menyempurnakan skripsi ini. Akhir kata, semoga
Tuhan Yang Maha Esa memberikan berkat-Nya kepada semua pihak yang telah
membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat
memberikan manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan. Ad Maiorem Dei
Gloriam.
Yogyakarta, Maret 2011
Penulis
x
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL.................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.......................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN..................................................................... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN.................................................................. v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA..................................................... vi
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH....................... vii
PRAKATA.................................................................................................. viii
DAFTAR ISI............................................................................................... xi
DAFTAR TABEL....................................................................................... xv
DAFTAR GAMBAR.................................................................................. xvi
DAFTAR LAMPIRAN............................................................................... xviii
INTISARI................................................................................................... xix
ABSTRACT.................................................................................................. xx
BAB I. PENGANTAR................................................................................ 1
A. Latar Belakang......................................................................... 1
1. Permasalahan....................................................................... 4
2. Keaslian penelitian.............................................................. 4
3. Manfaat penelitian.............................................................. 5
B. Tujuan Penelitian..................................................................... 5
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA........................................................ 6
A. Obat Herbal Terstandar (OHT)................................................ 6
xi
B. Kapsul Lunak............................................................................ 7
C. Kurkumin.................................................................................. 8
D. Spektrofotometri Visibel.......................................................... 10
1. Definisi spektrofotometri visibel dan konsep dasar radiasi
elektromagnetik................................................................... 10
2. Tipe transisi elektron........................................................... 11
3. Analisis kualitatif dan kuantitatif spektrofotometri
visibel.................................................................................. 13
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)............................. 14
1. Definisi dan tinjauan umum KCKT.................................... 14
2. Variabel-variabel dalam KCKT.......................................... 16
3. Kromatografi partisi............................................................ 20
4. Waktu retensi...................................................................... 21
5. Pemisahan puncak dalam kromatografi.............................. 22
6. Analisis kualitatif dan analisis kuantitatif........................... 23
F. Validasi Metode Analisis Instrumental................................... 24
1. Tinjauan umum validasi metode analisis instrumental....... 24
2. Parameter validasi metode analisis instrumental................ 25
G. Landasan Teori........................................................................ 29
H. Hipotesis.................................................................................. 30
BAB III. METODE PENELITIAN............................................................. 31
A. Jenis dan Rancangan Penelitian................................................ 31
B. Variabel Penelitian.................................................................... 31
xii
C. Definisi Operasional................................................................. 31
D. Bahan-bahan Penelitian............................................................ 32
E. Alat-alat penelitian................................................................... 32
F. Tata Cara Penelitian................................................................. 33
1. Pembuatan fase gerak.......................................................... 33
2. Pembuatan pelarut metanol pH 4......................................... 33
3. Pembuatan larutan baku kurkumin...................................... 34
4. Penetapan panjang gelombang (λ) maksimum kurkumin... 34
5. Preparasi sampel................................................................. 35
6. Validasi metode analisis...................................................... 35
G. Analisis Hasil........................................................................... 37
1. Selektivitas.......................................................................... 37
2. Linearitas............................................................................. 38
3. Akurasi................................................................................ 38
4. Presisi................................................................................... 38
5. Rentang................................................................................ 39
BAB IV. PEMBAHASAN......................................................................... 40
A. Pembuatan Fase Gerak KCKT................................................. 40
B. Pembuatan Pelarut dan Stabilitas Kurkumin........................... 41
C. Pembuatan Larutan Baku Kurkumin....................................... 42
D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Kurkumin.......... 42
E. Analisis Kualitatif Berdasarkan Waktu Retensi (tR)
Kurkumin................................................................................. 45
xiii
F. Pembuatan Kurva Baku Kurkumin........................................... 48
G. Validasi Metode Analisis.......................................................... 51
1. Selektivitas.......................................................................... 52
2. Linearitas............................................................................. 54
3. Akurasi................................................................................ 54
4. Presisi.................................................................................. 57
5. Rentang............................................................................... 58
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN................................................... 59
A. Kesimpulan............................................................................. 59
B. Saran........................................................................................ 59
DAFTAR PUSTAKA................................................................................ 60
LAMPIRAN............................................................................................... 64
BIOGRAFI PENULIS............................................................................... 91
xiv
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Nilai indeks polaritas pelarut................................................ 17
Tabel II. Kategori metode pengujian validitas data............................. 24
Tabel III. Parameter validasi yang dipersyaratkan untuk validasi metode 25
analisis..................................................................................
Tabel IV. Kriteria penerimaan akurasi pada konsentrasi analit yang 27
berbeda.................................................................................
Tabel V. Kriteria penerimaan presisi berdasar kadar analit................ 29
Tabel VI. Penentuan kurva baku kurkumin......................................... 49
Tabel VII. Penentuan kurva baku kurkumin hasil modifikasi............... 50
Tabel VIII. Hasil penetapan recovery (%) baku kurkumin.................... 55
Tabel IX. Hasil perhitungan nilai recovery (%) dengan standard
addition method.................................................................... 56
Tabel X. Hasil pengukuran coefficient of variation larutan baku
kurkumin.............................................................................. 57
Tabel XI. Hasil pengukuran coefficient of variation dengan standard
addition method.................................................................... 58
xv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Logo Obat Herbal Terstandar................................................. 7
Gambar 2. Struktur dari kurkumin............................................................ 9
Gambar 3. Diagram tingkat energi elektronik.......................................... 12
Gambar 4. Ilustrasi instrumen KCKT....................................................... 15
Gambar 5. Reaksi silanasi........................................................................ 21
Gambar 6. Kromatogram pemisahan dua senyawa secara KCKT............ 23
Gambar 7. Kromatogram respon analit dalam campuran
multikomponen....................................................................... 25
Gambar 8. Linearitas dengan koefisien korelasi (r) > 0,999................... 26
Gambar 9. Reaksi degradasi kolom C18 pada pH asam ≤ 2..................... 41
Gambar 10. Gugus metilen aktif pada kurkumin....................................... 42
Gambar 11. Gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kurkumin..... 44
Gambar 12. Spektra panjang gelombang maksimum kurkumin............... 44
Gambar 13. Gugus polar dan non polar pada struktur kurkumin............... 46
Gambar 14. Interaksi hidrogen antara kurkumin dengan fase gerak metanol
: asam asetat glasial 2% (95:5)................................................ 47
Gambar 15. Interaksi kurkumin dengan fase diam oktadesilsilan.............. 47
Gambar 16. Kromatogram baku kurkumin (a) dan kurkumin dalam
sampel (b).............................................................................. 48
Gambar 17. Kurva baku kurkumin.............................................................. 51
Gambar 18. Kromatogram kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT
xvi
merek Rheumakur® pada konsentrasi tinggi
(6,5ppm)................................................................................... 53
Gambar 19. Respon sampel sebelum diadisi (kiri) dan sampel setelah
diadisi (kanan).......................................................................... 56
Gambar 20. Respon baku kurkumin pada konsentrasi tinggi
(6,5ppm)................................................................................... 56
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Pernyataan jaminan keaslian senyawa kurkumin standar
hasil sintesis.................................................................... 65
Lampiran 2. Data penimbangan bahan................................................ 66
Lampiran 3. Skema pembuatan larutan baku kurkumin dan contoh
perhitungan kadar larutan baku yang digunakan............ 67
Lampiran 4. Optimasi stabilitas larutan baku kurkumin
berdasar pH.................................................................... 68
Lampiran 5. Spektra panjang gelombang maksimum kurkumin......... 68
Lampiran 6. Kromatogram baku kurkumin untuk kurva baku............ 69
Lampiran 7. Data penentuan kurva baku kurkumin............................ 72
Lampiran 8. Persamaan dan gambar kurva baku kurkumin................ 73
Lampiran 9. Kromatogram baku kurkumin untuk validasi metode.... 74
Lampiran 10. Perolehan nilai AUC untuk validasi metode dan contoh
perhitungan konsentrasi terukur baku kurkumin ........... 81
Lampiran 11. Contoh perhitungan persen perolehan kembali (recovery)
dan coefficient of varriation (CV) baku kurkumin.......... 82
Lampiran 12. Kromatogram sampel dan sampel adisi.......................... 84
Lampiran 13. Perolehan nilai AUC sampel dan sampel adisi, contoh
perhitungan konsentrasi terukur, perhitungan recovery,
dan coefficient of variation baku kurkumin adisi............. 89
xviii

RHEUMAKUR®
INTISARI
Kurkumin merupakan senyawa yang memiliki aktifitas farmakologis

sebagai antiinflamasi dan salah satunya terkandung dalam Obat Herbal Terstandar
(OHT) merek Rheumakur®. Aktifitas farmakologi kurkumin tergantung pada
ketepatan dan keseragaman dosis. Untuk menjamin ketepatan dosis OHT
diperlukan metode penjaminan kualitas kandungan zat aktif.
Penelitian yang dilakukan bersifat non eksperimental deskriptif.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik dapat digunakan sebagai
metode penjaminan kualitas kandungan kurkumin dalam OHT. Validasi metode
KCKT fase terbalik menggunakan sistem yang optimal dengan fase diam
oktadesilsilan (C18), fase gerak metanol p.a. : asam asetat glasial 2% (95:5 v/v),
kecepatan alir 1,0 ml/menit dengan detektor visibel pada panjang gelombang 432
nm.
Parameter validitas metode yang digunakan adalah selektivitas, linearitas,
akurasi, presisi, dan rentang. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode KCKT
fase terbalik memiliki selektifitas yang baik dengan adanya pemisahan sempurna
dari peak sampel dan linearitas yang baik dengan nilai koefisien korelasi 0,9996
pada konsentrasi 1,5-6,5 ppm. Nilai recovery dan CV untuk baku kurkumin pada
konsentrasi 1,5 ppm; 3,5 ppm; dan 6,5 ppm berturut-turut adalah 94,3922-
97,9863% dan 0,7088%; 86,3053-91,5140% dan 0,6414%; dan 98,7074-
102,9929% dan 0,3687%, sedangkan untuk recovery standard addition method
adalah 98,4635-102,2448% dan 1,6705%. Berdasarkan hasil tersebut, metode
KCKT fase terbalik pada penetapan kadar kurkumin dalam sediaan kapsul lunak
OHT merek Rheumakur® memenuhi parameter validitas yang baik.
Kata kunci: kurkumin, KCKT, OHT, validasi
xix
VALIDATION OF HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY REVERSE PHASE IN CURCUMIN
QUANTIFICATION IN SOFT CAPSULE OF SCIENTIFIC BASED
HERBAL MEDICINE RHEUMAKUR®
ABSTRACT
Curcumin is a compound that has pharmacological activity as anti

inflammantory and are found mainly in Scientific Based Herbal Medicine
(SBHM). Curcumin pharmacology's activity depends on the accuracy and
uniformity of the dose. To guarantee that SBHM's dose is accuracy, it required
assurance method which is qualified active substance.
The research that has conducted is non experimental descriptive. High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) reverse phase can be used as a
method of quality assurance content of curcumin in SBHM. Validation of HPLC
reverse phase with optimal system conditions using the optimal stationary phase
octadecylsylane (C18), mobile phase methanol p.a.: glacial acetic acid 2% (95:5
v/v), flow rate 1,0 ml/min with visible detector at wavelength 432 nm.
Parameter validity of the method used is the selectivity, linearity,
accuracy, precision, and range. The results showed that the reverse phase HPLC
method has good selectivity in the presence of a perfect separation of the peak
sample and a good linearity with coefficient of corelation of 0,9996 at
concentration of 1,5 to 6,5 ppm. Recovery and Coefficient of Variations values
for raw curcumin at a concentration of 1,5; 3,5; and 6,5 ppm respectively is
94,3922 to 97,9863% and 0,7088%; 86,3053 to 91,5140% and 0,6414%; and
98,7074 to 102,9929% and 0,3687%, while the standard addition method for
recovery is 98,4635 to 102,2448% and 1,6705%. Based on these results, reverse
phase HPLC method on the determination of curcumin in soft capsule dosage
SBHM Rheumakur® meets good validity parameters.
Key words: curcumin, HPLC, SBHM, validation
xx
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Kecenderungan gaya hidup back to nature menyebabkan sebagian besar
masyarakat mulai beralih dari penggunaan obat moderen ke penggunaan obat
tradisional untuk menunjang kesehatan tubuh. Pertimbangan berdasarkan pada
aspek ekonomi dan keamanan bagi kesehatan bisa menjadi dua alasan mendasar
di mana masyarakat mulai beralih ke penggunaan obat tradisional. Persentase
penggunaan obat tradisional dari tahun ke tahun terus mengalami peningkatan,
baik di negara berkembang maupun negara maju. World Health Organization
(WHO) menyebutkan bahwa hingga 80% dari penduduk negara-negara di Asia
dan Afrika telah menggunakan pengobatan tradisional sebagai pengobatan utama
(WHO, 2008).
Salah satu golongan obat tradisional yang digunakan adalah Obat Herbal
Terstandar (OHT) yang mengandung kurkumin. Obat Herbal Terstandar (OHT)
merupakan golongan obat tradisional yang khasiat dan keamanannya telah
terbukti secara ilmiah melalui uji praklinik dan bahan bakunya telah mengalami
standarisasi. Kurkumin merupakan senyawa aktif yang salah satunya berasal dari
tanaman Curcuma longa L. Kurkumin merupakan salah satu komponen
kurkuminoid dengan persentase terbesar. Kurkumin memiliki aktifitas
antiinflamasi, antioksidan, antimikrobia, dan menghambat pertumbuhan sel
1
2
kanker. Salah satu contoh OHT mengandung kurkumin yang beredar di pasaran
yaitu kapsul lunak Rheumakur® yang berkhasiat sebagai anti rheumatik.
Aktifitas farmakologi kurkumin tergantung pada ketepatan dan
keseragaman dosis. Untuk menjamin ketepatan dosis suatu sediaan obat herbal
tradisional diperlukan penjaminan kualitas kandungan zat aktif dalam sediaan
obat herbal tradisional jenis OHT. Jaminan kualitas terhadap produk obat herbal
tradisional sangat dibutuhkan seiring dengan meningkatnya permintaan terhadap
produk obat herbal tradisional jenis OHT yang mengandung kurkumin dalam
bentuk sediaan padat, khususnya Rheumakur®. Tujuan dari penjaminan kualitas
adalah terciptanya produk yang berkhasiat dan aman pada obat herbal tradisional
khususnya OHT yang mengandung kurkumin, di mana ditunjukkan oleh ketepatan
dan keseragaman dosis setiap proses produksinya.
Penjaminan kualitas pada sediaan OHT yang mengandung kurkumin
memerlukan metode yang tervalidasi dengan nilai selektivitas, linearitas, akurasi,
presisi, dan rentang yang baik (United States Pharmacopeial Convention, 2007).
Pemilihan metode penetapan kadar yang akan digunakan untuk analisis kuantitatif
sangat penting, karena akan mempengaruhi validitas dari hasil yang diperoleh.
Validasi metode merupakan proses yang dilakukan melalui penelitian
laboratorium untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode itu
memenuhi persyaratan aplikasi analitik yang dimaksudkan. Tujuan dilakukan
validasi metode adalah untuk membuktikan dan menjamin bahwa metode analisis
yang digunakan memiliki validitas yang baik sehingga hasilnya dapat dipercaya.
3
Beberapa penelitian mengenai analisis kurkumin secara KCKT yang
telah dilakukan antara lain menggunakan fase diam C 18 dan fase gerak metanol :
asam asetat glasial 2% (90:10 v/v) dengan detektor visibel (Widjaja, 2011), fase
diam amino bonded dan fase gerak etanol absolut dengan detektor visibel
(Sumule, 2007). Hal utama yang membedakan penelitian ini dengan penelitian
sebelumnya terletak pada komposisi fase gerak dan kecepatan alir yang
digunakan.
Berdasarkan penelusuran pustaka yang dilakukan oleh peneliti, validasi
metode KCKT untuk penetapan kadar pada sediaan kapsul lunak OHT merek
Rheumakur® yang mengandung kurkumin belum pernah dilakukan. Pemilihan
metode KCKT fase terbalik didasarkan pada selektivitas metode tersebut dimana
memiliki kemampuan untuk memisahkan suatu senyawa dari campuran sampel
yang multikomponen dalam kadar yang kecil.
Pada penelitian ini dilakukan proses validasi terhadap sistem KCKT fase
terbalik hasil optimasi dalam rangkaian penelitian penetapan kadar kurkumin
dalam sediaan kapsul lunak OHT merek Rheumakur ®, yaitu: optimasi, validasi,
dan penetapan kadar. Berdasarkan hasil optimasi diperoleh kondisi optimal sistem
KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak metanol : asam
asetat glasial 2% (95:5 v/v) dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit yang selanjutnya
digunakan sebagai sistem acuan pada proses validasi ini.
Metode KCKT fase terbalik yang akan digunakan oleh peneliti
diharapkan mampu memberikan selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan
rentang yang baik dengan kondisi sistem yang tepat sehingga dapat digunakan
4
untuk menetapkan kadar kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT merek
Rheumakur®.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka permasalahan yang muncul
adalah apakah metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik menggunakan
sistem yang sudah dioptimasi pada penetapan kadar kurkumin dalam sediaan
kapsul lunak Obat Herbal Terstandar merek Rheumakur ® memenuhi persyaratan
validitas seperti: selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan rentang?
2. Keaslian penelitian
Penelitian mengenai kurkumin yang telah dilakukan adalah kurkumin
dalam sediaan farmasi (tablet, serbuk, dan kapsul), serbuk hasil sintesis, ekstrak,
dan cairan tubuh secara kromatografi lapis tipis (Tonnesen dan Karlsen , 1986),
validasi metode penetapan kadar kurkumin secara kromatografi cair kinerja tinggi
dan aplikasinya dalam sediaan sirup (Sumule, 2007), serta validasi metode
penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair Obat Herbal Terstandar Merek
Kiranti® Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik (Widjaja, 2011).
Sejauh penelusuran pustaka yang telah dilakukan oleh peneliti, penelitian tentang
validasi metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik pada penetapan
kadar kurkumin dalam sediaan kapsul lunak Obat Herbal Terstandar merek
Rheumakur® belum pernah dilakukan.

5
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat metodologis. Hasil penelitian ini memberikan satu alternatif
metode baru yang memiliki validitas yang baik dalam menetapkan kadar
kurkumin dalam sediaan kapsul lunak Obat Herbal Terstandar merek Rheumakur®
menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik menggunakan
sistem optimal dengan validitas yang baik.
b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk
menetapkan kadar kurkumin dalam sediaan Obat Herbal Terstandar bentuk kapsul
lunak merek Rheumakur® yang beredar di pasaran.
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa metode Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik memenuhi parameter validitas, yaitu:
selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan rentang pada penetapan kadar
kurkumin dalam sediaan kapsul lunak Obat Herbal Terstandar merek Rheumakur ®
menggunakan sistem yang sudah dioptimasi.

BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Obat Herbal Terstandar (OHT)
Menurut Undang-Undang No.23 tahun 1992 tentang kesehatan bab I
pasal I ayat (10) obat tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang berupa
bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan cairan (galenik) atau
campuran dari bahan tersebut yang secara turun temurun telah digunakan untuk
pengobatan berdasarkan pengalaman.
Berdasarkan Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan
(BPOM) Republik Indonesia nomor: HK.00.05.4.2411, penggolongan obat bahan
alam Indonesia berdasarkan cara pembuatan serta jenis klaim penggunaan dan
tingkat pembuktian khasiat, dikelompokkan menjadi jamu, Obat Herbal
Terstandar (OHT), dan fitofarmaka.
Obat Herbal Terstandar adalah sediaan obat bahan alam yang telah
dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan uji praklinik dan bahan
bakunya telah distandarisasi. Standarisasi merupakan serangkaian parameter,
prosedur, dan cara pengukuran yang hasilnya berupa paradigma mutu sesuai
standar dan jaminan stabilitas produk (Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI,
2005).
Obat Herbal Terstandar mengandung ekstrak yang diperoleh dari proses
standarisasi sehingga menjamin produk yang terstandar dengan kadar senyawa
aktif yang tidak berubah-ubah. OHT harus memiliki kriteria sebagai berikut:
6
7
1. Aman sesuai dengan persyaratan yang ditetapkan
2. Klaim khasiat dibuktikan secara ilmiah atau pra klinik
3. Telah dilakukan standarisasi terhadap bahan baku yang digunakan dalam
produk jadi
4. Memenuhi persyaratan mutu yang berlaku
(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2005).
Gambar 1. Logo Obat Herbal Terstandar (Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, 2004)
B. Kapsul Lunak
Kapsul adalah sediaan padat yang terdiri dari obat dalam cangkang keras
atau lunak yang dapat larut. Cangkang umumnya terbuat dari gelatin,tetapi dapat
juga terbuat dari pati atau bahan lain yang sesuai. Cangkang gelatin lunak sedikit
lebih tebal dibanding kapsul cangkang keras dan dapat diplastisasi dengan
penambahan senyawa poliol. Umumnya kapsul cangkang lunak berisi cairan,
khususnya bahan aktif di mana dilarutkan atau disuspensikan dalam bahan
pembawa cair.
Keseragaman bobot pada kapsul lunak yang berisi obat cair atau pasta
yaitu timbang 10 kapsul, timbang lagi satu per satu. Keluarkan isi semua kapsul,
cuci cangkang kapsul dengan eter. Buang cairan cucian, biarkan hingga tidak
berbau eter, timbang seluruh bagian cangkang kapsul. Hitung bobot isi kapsul dan
8
bobot rata-rata tiap isi kapsul. Perbedaan dalam persen bobot isi tiap kapsul
terhadap bobot rata-rata tiap isi kapsul tidak lebih dari 7,5 % (Direktorat Jenderal
Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).
C. Kurkumin
Kurkumin merupakan salah satu jenis kandungan dalam kurkuminoid
selain demetoksikurkumin, dan bis-demetoksikurkumin. Kurkumin secara
kuantitas merupakan komponen terbesar dalam kurkuminoid yang memberikan
warna kuning (Dandekar and Patravale, 2009).
Dari ketiga senyawa kurkuminoid, kurkumin merupakan komponen
terbesar. Kandungan kurkumin dalam kunyit mencapai 50-60% sedangkan
demetoksikurkumin dan bis-demetoksikurkumin hanya terdapat dalam jumlah
kecil sehingga seringkali kadar total kurkuminoid dihitung sebagai persen (%)
kurkumin. Berdasarkan alasan tersebut, beberapa penelitian lebih ditekankan pada
kurkumin (Parinussa dan Timotius, 2002).
Hasil kajian pra klinik mengenai kurkumin menunjukkan khasiat yang
nyata untuk mengatasi berbagai macam penyakit. Kurkumin dari rimpang kunyit
memiliki khasiat sebagai anti bakteri broad spectrum, sehingga telah
dimanfaatkan dalam ramuan jamu, Obat Herbal Terstandar dan fitofarmaka.
Selain itu, hasil uji pra klinik pada tikus menunjukkan bahwa kurkumin dari
kunyit mampu menghambat pertumbuhan dan perkembangbiakan sel kanker
payudara yang telah resisten terhadap macam-macam obat, baik karena
dipengaruhi faktor hormonal maupun tidak (hormone dependent dan

9
independent), menghambat perkembangbiakan sel kanker kolon in vitro, leukimia
dan sel kanker kulit. Sebagai antivirus, kurkumin bekerja dengan cara
menghambat enzim integrase HIV-1, protease HIV-1 sehingga menghambat
transaktivasi HIV-1. Kurkumin juga memiliki aktivitas sebagai imunostimulan
dengan kemampuannya meningkatkan sintesis antibodi IgG dan meningkatkan
sitotoksisitas Natural Killer Cells. Kurkumin juga dikenal sebagai anti inflamasi,
bekerja dengan cara menghambat aktivitas enzim lipooksigenase dan
siklooksigenase (Bermawie, Rahardjo, Wahyuno, dan Ma’mun, 2006).
Kurkumin sukar larut dalan air, heksan, dan petroleum eter, agak larut
dalam benzen, kloroform, eter, tetapi larut dalam alkohol, aseton, dan asam asetat
glasial (Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, 1996).
Gambar 2. Struktur dari kurkumin (Aggarwal et al., 2006)
Stabilitas kurkumin dipengaruhi oleh pH dan cahaya. Dalam larutan
beraquadestilata kurkumin mengalami reaksi hidrolisis degradatif yang
bergantung pH lingkungan. Kecepatan degradasi pada pH kurang dari 7 lebih
lambat dibanding pH lebih dari 7 (Dandekar and Patravale, 2009).
Pada larutan pH asam, kurkumin berwarna kuning, dalam suasana basa
kurkumin akan terdegradasi menjadi trans-6-(4’-hidroksi-3-metoksifenil)-2,3-
diokso-5-heksanal, asam ferulat, feruloilmetan, dan vanilin dengan larutan

10
berwarna coklat kemerahan yang pekat sampai warna kuning muda (Sharma et al.
, 2005). Kurkumin bersifat tidak larut dalam air, tetapi larut dalam alkohol dan
asam asetat glasial. Kurkumin akan terdegradasi pada pH di atas 7,2 dan oleh
sinar ultra violet. Adanya cahaya dapat menyebabkan terjadinya degradasi
fotokimia karena kurkumin memiliki gugus metilen aktif (-CH2-) di antara dua
gugus keton pada senyawa tersebut (Tonnesen dan Karlsen, 1985).
Secara spektrofotometri, absorbansi maksimum kurkumin (λmax) di
metanol yaitu 430 nm. Kurkumin berwarna kuning pada pH 2,5 sampai 7 dan
berwarna merah pada pH > 7. Fluoresensi dari kurkumin terjadi pada asetonitril
(λmax = 524 nm), etanol (λmax = 549 nm), atau micellar solution (λmax = 557 nm),
tetapi di toluen (λmax = 460, 488 nm) (Aggarwal et al., 2006).
Analisis kurkumin secara kuantitatif pada tahun 1983 dilakukan dengan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) menggunakan detektor fluorometer.
Adanya gugus polar dan gugus kromofor pada kurkumin secara kuantitatif dapat
dianalisis menggunakan KCKT fase terbalik dengan kolom oktadesilsilan dan
detektor ultraviolet-visibel (Musfiroh, Indriyati, Susilawati, dan Percekawati,
2009).
D. Spektrofotometri Visibel
1. Definisi spektrofotometri visibel dan konsep dasar radiasi
elektromagnetik
Spektrofotometri visibel adalah pengukuran suatu interaksi antara radiasi
elektromagnetik dengan atom atau molekul dari suatu zat kimia pada panjang
11
gelombang 380-780 nm (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI,
1995).
Radiasi elektromagnetik pada daerah visibel dapat dianggap sebagai
energi yang merambat dalam bentuk gelombang. Panjang gelombang merupakan
jarak linier dari suatu titik pada satu gelombang ke titik yang bersebelahan pada
gelombang yang berdekatan.
Prinsip kerja spektrofotometri visibel berdasarkan interaksi antara radiasi
elektromagnetik dengan atom, ion, atau molekul. Serapan atom menyebabkan
peralihan elektronik atau transisi elektronik, yaitu peningkatan energi elektron
dari tingkat dasar (ground state) ke tingkat energi yang lebih tinggi (excited state).
Transisi ini terjadi bila energi yang dihasilkan oleh radiasi sama dengan energi
yang diperlukan untuk melakukan transisi (Rohman dan Gandjar, 2007).
2. Tipe transisi elektron
Ada empat tipe transisi elektron yang dapat terjadi yaitu: σ  σ*, n 
σ*, n  π*, dan π  π*. Transisi elektron (σ  σ*) pada suatu elektron di dalam
orbital molekul bonding akan dieksitasikan ke orbital antibonding sehingga
molekul berada dalam keadaan excited state (σ*). Untuk mengeksitasikan elektron
yang berada pada suatu ikatan kovalen tunggal terikat kuat (orbital σ) diperlukan
radiasi berenergi tinggi atau panjang gelombang pendek. Oleh karena itu, serapan
maksimum yang disebabkan oleh transisi ini tidak pernah teramati pada daerah
ultraviolet (Mulja dan Suharman, 1995).

12
Transisi elektron (n  σ*) terjadi pada senyawa organik jenuh yang
mengandung atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (elektron n). Energi
yang diperlukan untuk transisi jenis ini lebih kecil dibanding transisi σ  σ*
sehingga sinar yang diserap pun mempunyai panjang gelombang lebih panjang,
yaitu sekitar 150-250 nm (Rohman dan Gandjar, 2007).
Gambar 3. Diagram tingkat energi elektronik (Skoog et al, 1998)
Transisi elektron n  π* dan π  π* merupakan transisi yang paling
cocok untuk analisis sebab sesuai dengan panjang gelombang antara 200-700 nm.
Secara teknis dapat diaplikasikan pada spektrofotometer. Untuk memungkinkan
terjadinya jenis transisi ini, molekul organik harus mempunyai gugus fungsional
yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap dalam gugus tersebut memberikan
orbital π yang diperlukan (Rohman dan Gandjar, 2007). Kedua transisi ini
membutuhkan adanya kromofor dan auksokrom dalam struktur molekulnya.
Kromofor merupakan gugus fungsional tak jenuh yang menyediakan orbital π
yang dapat menyerap pada daerah ultraviolet. Sedangkan auksokrom merupakan
gugus jenuh yang bila terikat pada kromofor mengubah panjang gelombang dan
13
intensitas serapan maksimum, cirinya adalah heteroatom yang langsung terikat
pada kromofor (Sastrohamidjojo, 2002).
3. Analisis kualitatif dan kuantitatif spektrofotometri visibel
Pada analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri visibel yang
dapat ditentukan ada dua yaitu: pemeriksaan kemurnian spektrum visibel dan
penentuan panjang gelombang serapan maksimum (Mulja dan Suharman, 1995).
Dalam analisis kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan
(larutan sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya.
Radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas
sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada jenis
penyerap lainnya. Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan
jumlah foton yang melalui satu satuan luas penampang perdetik.
Serapan dapat terjadi jika radiasi yang mengenai cuplikan memiliki
energi yang sama dengan energi yang dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya
perubahan tenaga. Kekuatan radiasi juga mengalami penurunan dengan adanya
penghamburan dan pemantulan cahaya, akan tetapi penurunan karena hal ini
sangat kecil dibanding dengan proses penyerapan.
Bouger, Lambert, dan Beer membuat formula secara matematik
hubungan antara absorban terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang
dianalisis dan tebal larutan.

14
I
T= I t =10−ε.C.b (1)
o
Menurut Watson (1999), nilai daya serap (a) dapat dinyatakan sebagai
sehingga persamaan hukum Lambert-Beer dapat ditulis menjadi:
1
A= T =ε.C.b (2)
Keterangan:
T= persen transmitan C= konsentrasi larutan (mol L-1)
It= intensitas radiasi yang diteruskan b= tebal kuvet (cm)
Io= intensitas radiasi yang datang A=serapan/absorbansi
ε= daya serap molar (L mol-1 cm-1)
(Rohman dan Gandjar, 2007)
Dalam hukum Lambert-Beer tersebut terdapat beberapa pembatasan,
yaitu: sinar yang digunakan dianggap monokromatis, penyerapan terjadi dalam
suatu volume yang mempunyai penampang luas yang sama, senyawa yang
menyerap dalam larutan tidak tergantung terhadap senyawa lain dalam larutan
tersebut, tidak terjadi peristiwa fluoresensi atau fosforesensi, dan indeks bias tidak
tergantung pada konsentrasi larutan (Rohman dan Gandjar, 2007).
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
1. Definisi dan tinjauan umum KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode
kromatografi cair yang fase geraknya dialirkan secara cepat dengan bantuan
tekanan dan hasilnya dideteksi dengan detektor. Pada alat ini diperlukan sistem
pompa tekanan tinggi yang mengalirkan fase gerak dari bejana fase gerak ke
kolom dengan tekanan tinggi sampai 300 atmosfer sehingga pada awalnya
15
kromatografi ini disebut High Pressure Liquid Chromatography (Direktorat
Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995). Pada akhir tahun 1970,
perkembangan instrumen ini dapat menghasilkan pemisahan yang baik atau
menghasilkan penampilan peak yang baik sehingga sistem ini lebih dikenal
dengan KCKT (Kromidas, 2000).
KCKT merupakan teknik analisis yang paling banyak digunakan, karena
sensitivitas dari metode ini menghasilkan determinasi kuantitatif yang akurat
(Skoog, Holler, dan Nieman, 1998). Maksud dan tujuan analisis dengan KCKT
hanya ada dua hal yaitu memperoleh pemisahan yang baik dalam proses yang
relatif singkat (Mulja dan Suharman, 1995). Keterbatasan metode KCKT adalah
jika analit yang akan dianalisis sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit
diperoleh (Rohman dan Gandjar, 2007). Peralatan KCKT dapat dilihat pada
gambar:
Gambar 4. Ilustrasi instrumen KCKT (Lambertson, C., 2009)

16
2. Variabel-variabel dalam KCKT
1. Fase gerak. KCKT dapat dikembangkan dengan pelarut tunggal
maupun campuran pelarut. Pemisahan dengan fase gerak tunggal disebut elusi
isokratik, sedangkan pemisahan dengan dua fase gerak dengan berbagai
perubahan komposisi disebut elusi gradien. Fase gerak untuk pemisahan secara
KCKT harus murni untuk mencegah adanya peak pengganggu yang dapat
tumpang tindih dengan peak analit, tidak bereaksi dengan kemasan, dapat
melarutkan cuplikan, viskositasnya rendah (tidak lebih dari 50cP), memungkinkan
memperoleh kembali cuplikan dengan mudah bila diperlukan, tidak mudah
terbakar, toksisitasnya rendah, dan memiliki harga yang wajar (Skoog, Holler, dan
Nieman, 1985).
Fase gerak KCKT harus bebas dari gas yang terlarut karena dapat
mempengaruhi respon detektor sehingga memunculkan sinyal palsu dan akan
mempengaruhi kolom (Gritter, Bobbit, Schwarting, 1991). Maka peralatan
degassing diperlukan untuk menghilangkan gas yang terlarut di dalam fase gerak
(Dean, 1995).
Kepolaran pelarut merupakan ukuran kekuatan pelarut untuk mengelusi
suatu senyawa. Kandungan utama fase gerak pada kromatografi fase terbalik
adalah air. Kecenderungan air untuk melarutkan sampel dapat diubah dengan
menambahkan garam untuk menimbulkan pengaruh penggaraman, asam, basa,
dapar untuk melarutkan atau mengendapkan asam atau basa, pereaksi
pengompleks untuk menimbulkan jenis pengaruh pelarutan yang khas untuk
gugus fungsi tertentu atau golongan senyawa tertentu, atau pelarut organik yang
17
dapat bereampur dengan air. Pemodifikasi organik yang banyak digunakan adalah
metanol, asetonitril, dan tetrahidrofuran (Munson, 1984).
Kepolaran pelarut dinyatakan dalam bentuk P’ (indeks polaritas).
Besarnya polaritas campuran pelarut dapat dihitung dengan persamaan berikut:
P’ = ФaP’a + ФbP’b (3)
Keterangan:
Фa=fraksi volume pelarut a
Фb = fraksi volume pelarut b
P’a = kepolaran pelarut a murni
P’b = kepolaran pelarut b murni
P’ = kepolaran campuran pelarut
(Gritter et al, 1991)
Berikut ini merupakan beberapa nilai indeks polaritas dari beberapa pelarut yang
sering digunakan.
Tabel I. Nilai indeks polaritas pelarut (Synder, Kirkland, dan Glajh, 1997)
Solvent Indeks Nilai Eluotropik UV cutt off

polaritas (nm)
Alumina C18 Silika
Heksan 0,1 0,01 - 0,00 195

Sikloheksan 0,2 0,04 - - 200
Toluen 2,4 0,29 - 0,22 284
Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212
Etil Asetat 4,4 0,58 - 0,48 256
Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330
Metanol 5,1 0,95 1,0 0,7 205
Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190
Dimetilformamida 6,4 - 7,6 - 268
dimetilsulfoksida 7,2 0,62 - - 268
Air 10,2 - - - 190
Tabel di atas menunjukkan bahwa semakin besar nilai eluotropik dari
suatu pelarut maka semakin mudah untuk mengelusi analit. Sedangkan semakin
besar indeks polaritas pelarut maka semakin polar pelarut tersebut.

18
2. Fase diam. Kolom pada KCKTmerupakan bagian yang sangat penting
karena pemisahan komponen-komponen sampel akan terjadi di dalam kolom.
Keberhasilan pemisahan komponen-komponen sampel akan sangat bergantung
pada keadaan kolom (Mulja dan Suharman, 1995).
Kolom pada KCKT dapat berupa gelas atau baja tidak berkarat. Kolom
gelas dapat menahan tekanan sampai 50 atmosfer. Panjang kolom bervariasi
antara 15-150cm, pengisi kolom biasanya adalah silika gel, alumina, dan elit
(Khopkar, 1990).
Diameter kolom dibuat 3-5mm dengan tujuan supaya kepekaannya lebih
teliti, menghemat fase gerak, memperluas kemampuan detektor, dan mengurangi
jumlah sampel yang dianalisis. Untuk mendapatkan fase yang non polar, silika gel
direaksikan dengan klorosilan (Mulja dan Suharman, 1995). Oktadesil silika
(ODS) merupakan fase diam yang paling banyak dipakai karena mampu
memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun
tinggi (Rohman dan Gandjar, 2007).
Analit yang polar, terutama yang bersifat basa atau memiliki gugus amin
akan memberikan puncak yang mengekor (tailing peak) pada penggunaan fase
diam silika gel terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorbsi antara
gugus amin pada analit dengan residu silanol dan pengotor logam yang terdapat
pada silika. Hal ini dapat diatasi dengan end capping yakni suatu proses menutup
residu silanol dengan gugus trimetisisil dan menggunakan silika dengan
kemurnian tinggi (kandungan logam < 1ppm) (Rohman dan Gandjar, 2007).
19
Kolom kromatografi yang baik diharapkan mempunyai kemampuan
tinggi dalam hal pemisahan, cepat dalam operasi, dan mempunyai kapasitas yang
tinggi.
3. Detektor. Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen
cuplikan di dalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. Beberapa persyaratan
yang harus dimiliki detektor adalah sensitivitas yang tinggi, kestabilan,
reprodusibilitas yang baik, memberikan respon yang linear terhadap konsentrasi
solut, dapat bekerja pada suhu kamar, mudah didapat, dan mudah pemakaiannya
oleh operator (Ahuja, and Dong, 2005).
Secara umum detektor dibagi menjadi dua kategori, yaitu: bulk property
detector dan solute property detector. Bulk property detector merupakan jenis
detektor yang mengukur sifat solut dan fase gerak, misalnya detektor indeks bias.
Detektor indeks bias adalah suatu detektor universal yang memberi tanggap pada
setiap solut, asalkan indeks biasnya jauh berbeda dengan indeks bias fase gerak.
Kelemahan utamanya adalah bahwa indeks bias ini peka terhadap suhu. Oleh
karena itu, suhu fase gerak, kolom, dan detektor harus dikendalikan dengan
seksama. Solute property detector merupakan jenis detektor yang selektif
mengukur solut. Misalnya detektor UV-Vis dan fluoresensi. Detektor UV-Vis
umumnya berguna untuk senyawa aromatis dan jenis senyawa tidak jenuh lain.
Semua detektor UV-Vis bekerja atas dasar hukum Beer, yaitu jumlah cahaya yang
diabsorbsi sebanding dengan kadar analit. Detektor fluoresensi memberi
selektivitas tinggi pada analit yang mempunyai gugus yang dapat berfluoresensi
karena membutuhkan panjang gelombang eksitasi dan emisi yang spesifik. Hanya
20
sedikit senyawa yang mempunyai sifat tersebut (Munson, 1984; Willard dkk,
1988).
3. Kromatografi partisi
Pada kromatografi partisi, fase diam dapat polar atau non polar. Bila fase
diam polar dan fase gerak non polar disebut kromatografi partisi fase normal,
sedangkan bila fase diam non polar dan fase gerak polar dinamakan kromatografi
partisi fase terbalik.
Kecepatan migrasi analit dalam fase diam ditentukan oleh perbandingan
distribusinya (D) yang bergantung pada afinitas relatif pada fase diam dan fase
gerak. Dalam kromatografi, D didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi
analit dalam fase diam (Cs) dan dalam fase gerak (Cm) (Rohman dan Gandjar,
2007).
Cs
D= (4)
Cm
Kolom yang biasa digunakan dalam kromatografi partisi fase terbalik
adalah kolom dengan kemasan fase terikat yang memiliki sifat stabil karena fase
diamnya terikat secara kimia pada penyangga, sehingga tidak mudah terelusi oleh
fase gerak. Penyangga pada fase terikat biasanya terbuat dari silika yang sudah
diseragamkan, berpori, dan umumnya mempunyai diameter 3,5 atau 10 µm
(Skogg et al., 1998).
Pada KCKT partisi fase terbalik biasanya mengandung bagian organik
yang terikat secara kimia dengan gugus silanol pada permukaan silika. Bagian
21
organik tersebut umumnya hidrokarbon rantai panjang, sehingga fase gerak
umumnya polar. Gugus silanol permukaan dapat direaksikan dengan berbagai cara
menempelkan berbagai jenis gugus organik. Kemasan fase terikat dengan tipe
ikatan siloksan (Si-O-Si-O) dibuat dengan mereaksikan organoklorosilan dengan
gugus silanol pada permukaan silika gel. Reaksi silanasi sebagai berikut:
Reaksi tersebut digunakan untuk membuat isian kolom oktadesilsilan
(ODS) gugus silanol dan oktadesilklorosilan sebagai berikut:
(5)
Gambar 5. Reaksi silanasi (Harris, 1999)
Gugus yang ditempelkan pada silanol pada umumnya dalah hidrokarbon rantai
panjang. Panjang pendeknya rantai karbon mempengaruhi tertambatnya senyawa
pada fase diam.
Fase gerak yang sering digunakan adalah campuran metanol atau
asetonotril dengan air atau dengan larutan buffer. Untuk analit yang bersifat asam
atau basa lemah, peranan pH sangat penting karena jika pH fase gerak tidak diatur
maka analit akan mengalami ionisasi sehingga ikatan dengan fase diam akan
menjadi lemah jika dibandingkan dengan bentuk tidak terionisasi, spesies yang
terionisasi akan terelusi lebih cepat (Rohman dan Ganjar, 2007).
4. Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom
menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan
22
waktu di mana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian
puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda
memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi
akan sangat bervariasi dan bergantung pada tekanan yang digunakan (karena itu
akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut), kondisi dari fase diam (tidak hanya
terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel), komposisi yang tepat
dari pelarut, dan temperatur pada kolom. Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol
secara hati-hati jika menggunakan waktu retensi sebagai saran untuk
mengidentifikasi senyawa-senyawa (Ahuja and Dong, 2005).
5. Pemisahan puncak dalam kromatografi
Sasaran akhir dari analisis menggunakan instrumen KCKT adalah
pemisahan satu atau lebih analit dari komponen lain dalam sampel sehingga dapat
diperoleh informasi kuantitatif dari masing-masing analit. Resolusi adalah derajat
pemisahan dari dua puncak analit yang berdekatan.
Faktor resolusi adalah ukuran pemisahan dari 2 puncak. Daya pisah (R)
dapat diukur dengan persamaan:
(tR2 -tR )
Rs= 1 (6)
2(W1 -W2 )
Keterangan:
Rs = resolusi
tR1 dan tR2 = waktu retensi senyawa diukur pada titik maksimum puncak
W1 dan W2= lebar alas puncak
(Ahuja and Dong, 2005)
23
Gambar 6. Kromatogram pemisahan dua senyawa secara KCKT (Ahuja and Dong, 2005)
Nilai Rs sebesar 1,5 menunjukkan bahwa baseline resolution tercapai
dengan pemisahan dari dua puncak dengan ukuran yang sama sehingga diperoleh
perhitungan yang dapat dipercaya. Dalam penelitian, nilai Rs sebesar 1
menunjukkan pemisahan yang sudah memadai (Ahuja and Dong, 2005).
6. Analisis kualitatif dan analisis kuantitatif
Analisis kualitatif pada KCKT pada prinsipnya mengacu pada waktu
retensi peak kromatogram yang dianalisis. Pengamatan waktu retensi
kromatogram analit dilakukan dengan jalan membandingkan dengan waktu retensi
standar acuan (reference standard) (Mulja dan Suharman, 1995).
Ada dua jalan untuk analisis kuantitatif analit pada kromatogram, yaitu
dengan mengukur tinggi peak dan dengan menentukan luas peak. Tinggi peak
diperoleh dengan membuat garis antara kedua dasar sisi peak, dan mengukur jarak
tegak lurus dari garis ini sampai puncak kromatogram. Bila variasi keadaan kolom
tidak menyebabkan pelebaran peak, pengukuran ini biasanya dapat dilakukan
dengan ketelitian yang tinggi. Sedangkan pengukuran dengan luas peak tidak
24
terpengaruh oleh pelebaran peak. Oleh karena itu, pengukuran berdasarkan luas
peak lebih disukai dari pada tinggi peak (Noegrohati, 1994).
F. Validasi Metode Analisis Instrumental
1. Tinjauan umum validasi metode analisis instrumental
Validasi metode analisis adalah suatu prosedur yang digunakan untuk
membuktikan apakah suatu metode analisis memenuhi persyaratan yang
ditentukan atau tidak (United States Pharmacopeial Convention, 2005).
Validasi diperlukan untuk setiap metode baru atau metode yang diubah
untuk memastikan bahwa metode tersebut mampu memberikan reprodusibilitas
dan realibilitas yang baik, meskipun digunakan oleh operator yang berbeda
menggunakan peralatan yang sama di laboratorium yang sama atau berbeda
(Dong, 2005). USP 28 mencantumkan beberapa kategori uji umum yang harus
memenuhi validitas data, yaitu:
Tabel II. Kategori metode pengujian validitas data (United States Pharmacopeial
Convention, 2007)
Kategori Keterangan
I Metode analitik yang digunakan untuk mengukur secara kuantitatif
sejumlah besar komponen dari serbuk obat atau senyawa aktif (termasuk
preservatif)
II Metode analitik yang digunakan untuk penentuan kemurnian dalam
bentuk serbuk obat atau penentuan senyawa degradasi
III Metode analitik yang digunakan untuk penentuan sifat-sifat khusus seperti
kecepatan disolusi dan pelepasan obat
IV Metode analitik yang digunakan untuk mengidentifikasi sediaan farmasi
Menurut The United States Pharmacopeia 30 dan The National
Formulary 25 tahun 2007, metode analisis dapat dikelompokkan menjadi 4

25
kategori. Pengelompokan menjadi 4 kategori tergantung pada sifat tes yang
dilakukan untuk tujuan validasi metode analisis.
Tabel III. Parameter validasi yang dipersyaratkan untuk validasi metode analisis (United
States Pharmacopeial Convention, 2007)
Parameter Kategori I Kategori II Kategori III Kategori IV

Kuantitatif Uji
batas
Akurasi Ya Ya * * Tidak
Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak
Selektivitas Ya Ya Ya * Ya
Detection Limit Tidak Tidak Ya * Tidak
Quantitation Tidak Ya Tidak * Tidak
Limit
Linearitas Ya Ya Tidak * Tidak
Rentang Ya Ya * * Tidak
* Mungkin dibutuhkan (tergantung sifat tes yang spesifik)
2. Parameter validasi metode analisis instrumental
a. Selektivitas. Kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan
akurat respon analit di antara seluruh komponen sampel potensial yang ada dalam
matrik sampel. Selektivitas metode analisis ditentukan dengan membandingkan
hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil degradasi, senyawa
sejenis, senyawa asing lainnya, atau pembawa plasebo dengan hasil analisis
sampel tanpa penambahan bahan-bahan tersebut (Harmita, 2004).
Gambar 7. Kromatogram respon analit dalam campuran multikomponen (Chan et al.,

2004)
26
Selektivitas metode analisis yang terbaik dapat dibuktikan melalui
pemisahan puncak-puncak yang berdekatan dengan perhitungan nilai resolusi
(Rs). Nilai Rs sebesar 1,5 menunjukkan bahwa baseline resolution tercapai
dengan pemisahan dari dua puncak dengan ukuran yang sama sehingga diperoleh
perhitungan yang dapat dipercaya (Chan, Lam, Lee, and Zhang, 2004).
b. Linearitas. Kemampuan metode analisis memberikan respon yang
secara langsung, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel dengan
rentang yang ada. Untuk memperoleh linearitas antara respon analit dengan
konsentrasi, data penelitian yang diperoleh harus dimasukkan dalam persamaan
matematika (United States Pharmacopeial Convention, 2005). Persyaratan data
linearitas yang dapat diterima adalah jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) >
0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003).
Gambar 8. Linearitas dengam koefisien korelasi (r) > 0,999 (Chan et al., 2004)
Linearitas ditunjukkan langsung oleh pengenceran dari larutan stok
standar dari konsentrasi yang berbeda-beda dalam rentang tertentu. Linearitas
terbaik dievaluasi secara perhitungan matematika dari respon sinyal terhadap
konsentrasi analit (Chan et al., 2004).
c. Akurasi. Keterdekatan hasil pengukuran dengan kadar analit
sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery)

27
analit yang ditambahkan (United States Pharmacopeial Convention, 2005). Tabel
di bawah ini merupakan kriteria penerimaan akurasi berdasarkan kadar analit
(Yuwono dan Indrayanto, 2005).
Tabel IV. Kriteria penerimaan akurasi pada konsentrasi analit yang berbeda
(United States Pharmacopeial Convention, 2007)
Konsentrasi analit (%) Unit Akurasi (%recovery)

100 100% 98-102
≥ 10 10% 98-102
≥ 1 1% 97-103
≥ 0,1 0,1% 95-105
0,01 100 ppm 90-107
0,001 10 ppm 80-110
0,0001 1 ppm 80-110
0,00001 100 ppb 80-110
0,000001 10 ppb 60-115
0,0000001 1 ppb 40-120
Akurasi untuk kadar obat yang besar adalah 95-105% sedangkan untuk
bioanalisis rentang 80-120 % masih dapat diterima (Mulja dan Hanwar, 2003).
Akurasi dapat dilakukan dengan penambahan analit ke dalam sampel. ICH
merekomendasikan menggunakan minimal sembilan kali pengujian pada tiga
konsentrasi rentang tertentu dengan masing-masing konsentrasi tiga kali
pengulangan (Chan et al., 2004).
Akurasi dapat ditentukan dengan dua cara, yaitu: metode simulasi (spiked
placebo recovery) dan metode penambahan baku (standard addition method).
Pada spiked placebo recovery, sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke
dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) kemudian campuran
tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar analit yang
ditambahkan (kadar sebenarnya). Pada standard addition method, sampel
dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang dianalisis ditambahkan ke dalam

28
sampel kemudian dianalisis kembali. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan
kadar yang sebenarnya (Harmita, 2004).
Metode penambahan analit (standard addition method) ke dalam sampel
dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi suatu analit dengan konsentrasi
yang kecil dalam sampel multikomponen seperti pada cairan biologis. Perubahan
respon instrumen terhadap sampel menunjukkan adanya perubahan konsentrasi
analit (International Union of Pure and Applied Chemistry, 2002).
d. Presisi. Derajat kesesuaian antara hasil uji individual yang diperoleh
dari pengambilan sampel yang berulang dari suatu sampel yang homogen dengan
menggunakan suatu metode analisis. Presisi dinyatakan dengan coefficient of
variation (CV) atau relative standard deviation (RSD) (United States
Pharmacopeial Convention, 2005).
Presisi suatu metode dapat dikategorikan menjadi tiga macam, yaitu:
reproducibility, intermediate precision, dan repeatability. Reproducibility adalah
keseksamaan metode bila analisis dikerjakan di laboratorium yang berbeda.
Intermediate precision adalah keseksamaan metode jika analisis dikerjakan di
laboratorium yang sama pada hari yang berbeda atau analis yang berbeda atau
peralatan yang berbeda. Repeatability adalah keseksamaan metode jika analisis
dilakukan oleh analis yang sama dengan peralatan yang sama pada interval waktu
yang pendek. Repeatability dinilai melalui penetapan terpisah lengkap terhadap
sampel-sampel identik dari batch yang sama pada kondisi normal (Harmita,
2004).
29
Tabel V. Kriteria penerimaan presisi berdasar kadar analit (United States

Pharmacopeial Convention, 2007)
Kadar analit (%) Unit Presisi (%CV)

100 100% 1,3
≥ 10 10% 2,7
≥ 1 1% 2,8
≥ 0,1 0,1% 3,7
0,01 100 ppm 5,3
0,001 10 ppm 7,3
0,0001 1 ppm 11
0,00001 100 ppb 15
0,000001 10 ppb 21
0,0000001 1 ppb 30
e. Rentang. Suatu metode analisis diartikan sebagai interval antara kadar
terendah sampai tertinggi analit yang dapat diukur secara kuantitatif
menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan ketelitian dan ketepatan,
dan linearitas yang mencukupi (United States Pharmacopeial Convention, 2005).
Rentang bukan merupakan parameter validasi yang dapat diukur secara
independen, tetapi harus disimpulkan dari penelaahan terhadap data yang
dikumpulkan dari linearitas, akurasi, dan presisi (Ahuja and Dong, 2005).
G. Landasan Teori
Obat Herbal Terstandar (OHT) merupakan sediaan obat bahan alam yang
telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan uji praklinik dan
bahan bakunya telah distandarisasi. OHT mengandung ekstrak simplisia seperti
kurkumin yang telah mengalami serangkaian parameter, prosedur, dan cara
pengukuran yang hasilnya berupa paradigma mutu sesuai standar dan jaminan
stabilitas produk. OHT mengandung ekstrak yang diperoleh dari proses
standarisasi sehingga menjamin produk yang terstandar dengan kadar senyawa

30
aktif yang tidak berubah-ubah. Salah satu bentuk sediaan OHT yang beredar di
masyarakat adalah kapsul lunak dengan senyawa aktif kurkumin.
Kurkumin merupakan senyawa berwarna kuning yang memiliki kelarutan
yang baik di dalam metanol dan asam asetat glasial. Kurkumin dapat dianalisis
dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan sistem yang telah
dioptimasi dengan kolom oktadesilsilan dan detektor visibel. Jenis dan komposisi
fase gerak yang digunakan adalah metanol p.a. dan asam asetat glasial 2% (95:5
v/v) di mana kurkumin dapat terlarut di dalamnya. Penggunaan metode KCKT
memiliki kelebihan dalam hal selektivitas yang baik. Hal ini didukung dengan
adanya proses validasi sebagai tahap kedua dalam rangkaian penetapan kadar
kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT. Validasi perlu dilakukan untuk
memberikan hasil dengan reprodusibilitas dan realibilitas yang baik. Validasi
suatu metode analisis ditentukan oleh parameter validasi, yaitu: selektivitas,
linearitas, akurasi, presisi, dan rentang.
H. Hipotesis
Metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik menggunakan
sistem yang sudah dioptimasi pada penetapan kadar kurkumin dalam sediaan
kapsul lunak Obat Herbal Terstandar merek Rheumakur® memenuhi persyaratan
validitas: selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan rentang.

BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini berdasarkan judul mengikuti jenis dan rancangan penelitian
non eksperimental deskriptif karena tidak ada manipulasi terhadap subyek uji dan
hanya mendeskripsikan keadaan yang ada.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah kondisi optimal dari sistem
kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik yaitu fase gerak dan kecepatan
alir.
2. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah parameter validasi seperti
selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan rentang.
3. Variabel pengacau terkendali
a. Pelarut yang digunakan yaitu metanol memiliki pH 4 dengan kemurnian
yang tinggi (pro analysis).
b. Perlakuan terhadap larutan baku kurkumin terhindar dari cahaya.
C. Definisi Operasional
1. Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang
digunakan terdiri dari fase diam berupa kolom C 18 dan fase gerak campuran
31
32
metanol p.a. dan asam asetat glasial 2% (95:5 v/v) dengan kecepatan alir 1,0
ml/menit.
2. Kadar kurkumin dinyatakan dalam satuan part per million (ppm).
3. Validasi metode analisis merupakan serangkaian prosedur untuk menentukan
apakah metode analisis kategori I yang digunakan memenuhi parameter
selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, linearitas dan rentang.
D. Bahan-bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah kurkumin baku hasil
sintesis Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. yang telah dikonfirmasi
strukturnya dengan metode spektroskopi 1H-NMR dan Mass Spectra dengan titik
lebur 181,2-182,4°C (Sudibyo, 2000), metanol pro analysis 1.06009.2500
EMSURE® ACS, ISO, Reag., Ph Eur (E. Merck), asam asetat glasial pro analysis
1.00063.2500 EMPARTA® ACS (E. Merck), aquabidestilata, sampel kapsul lunak
Obat Herbal Terstandar merek Rheumakur®.
E. Alat-alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan adalah seperangkat alat spektrofotometri VIS
merk Milton Ray Spectronic 3000 Array dengan printer Epson LQ-1170,
seperangkat alat KCKT fase terbalik merk Shimadzu model LC-2010C HT, CAT
No. 228-46703-38, SERIAL No. C21254706757 LP dengan sistem gradien
(pompa merk Shimadzu, detektor UV-Vis merk Shimadzu), kolom oktadesilsilan
(C18) merk Bondapack C18 berukuran 250 x 4,6 mm merek KNAUER No.
33
25EE181KSJ (B115Y620), seperangkat komputer (merk Dell B6RDZ1S
Connexant System RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, UPS Prolink Model
PR0650P , printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625 730), ultrasonikator (merk
Retsch tipe T460 no V935922013 Ey), syringe, neraca analitik, penyaring
Milipore, mikropipet Socorex, vakum, organic solvent membrane filter
(Whatman) ukuran pori 0,45 µm; diameter 47 mm, indikator pH (E-Merck),
seperangkat alat gelas (Pyrex).
F. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan fase gerak
Jenis dan komposisi fase gerak yang digunakan adalah metanol p.a dan
asam asetat glasial 2% dengan perbandingan 95:5 v/v. Komponen fase gerak
masing-masing disaring menggunakan organic solvent membrane filter untuk
metanol, dan anorganic solvent membrane filter untuk asam asetat glasial 2%
dengan bantuan pompa vakum kemudian diawaudarakan menggunakan
ultrasonikator selama 15 menit. Selanjutnya pencampuran kedua komponen fase
gerak dilakukan secara gradien di dalam instumen KCKT dengan perbandingan
metanol p.a. : asam asetat glasial 2% sebesar 95:5 v/v.
2. Pembuatan pelarut metanol pH 4
Pelarut yang digunakan untuk melarutkan kurkumin adalah metanol p.a.
pH 4 yang diperoleh dengan menambahkan asam asetat glasial 2% beberapa tetes
ke dalam metanol p.a.

34
3. Pembuatan larutan baku kurkumin
a. Pembuatan larutan stok kurkumin. Lebih kurang 10,0 mg baku
kurkumin ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 ml
kemudian dilarutkan dengan metanol pH 4 hingga batas tanda sehingga diperoleh
konsentrasi 1000 ppm.
b. Pembuatan larutan intermediet kurkumin. Diambil 1,0 ml larutan stok
kurkumin dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 ml kemudian diencerkan
dengan metanol pH 4 sampai batas tanda sehingga diperoleh konsentrasi 100 ppm.
c. Pembuatan seri larutan baku kurkumin. Larutan intermediet kurkumin
dipipet 150; 250; 350; 450; 550; dan 650 µl dan masing-masing dimasukkan
dalam labu takar 10,0 ml dan diencerkan dengan metanol pH 4 sampai batas tanda
sehingga didapatkan konsentrasi 1,5; 2,5; 3,5; 4,5; 5,5; dan 6,5 ppm. Larutan
kemudian disaring dengan Milipore dan diawaudarakan dengan ultrasonikator
selama 15 menit.
4. Penetapan panjang gelombang (λ) maksimum kurkumin
Sebanyak 40; 100; dan 160 µl dari larutan intermediet kurkumin dipipet
dan dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 ml sehingga didapatkan konsentrasi 0,4;
1,0; dan 1,6 ppm. Pada masing-masing konsentrasi larutan uji tersebut dilakukan
variasi pH dengan menggunakan pelarut metanol p.a. yang diatur pH nya
menggunakan asam asetat glasial 2% pada pH 3, 4, dan 5. Serapan dibaca pada
rentang panjang gelombang 400-500 nm terhadap larutan blangko (pelarut
masing-masing). Spektrum yang dihasilkan kemudian ditentukan panjang

35
gelombang maksimumnya dan selanjutnya digunakan sebagai panjang gelombang
deteksi pada sistem KCKT.
5. Preparasi sampel
Sebanyak 50,0 mg sampel kapsul lunak OHT merek Rhemakur®
ditimbang dan dilarutkan dengan 10,0 mL metanol pH 4. Sampel selanjutnya
diekstraksi dengan pengadukan secara mekanik dan konstan selama 15 menit
menggunakan magnetic stirrer. Diambil sebanyak 1,0 mL dari larutan tersebut
dan dimasukkan dalam labu 10,0 mL diencerkan dengan metanol pH 4 sampai
tanda. Preparasi dilakukan di tempat yang terlindung dari cahaya.
6. Validasi metode analisis
a. Penentuan selektivitas. Sebanyak masing-masing 10 µl larutan baku
kurkumin dan larutan ekstrak sampel Rheumakur® yang telah diawaudarakan
dengan ultrasonikator selama 15 menit diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase
terbalik dengan jenis dan komposisi fase gerak metanol p.a. : asam asetat glasial
2% (95:5 v/v) pada kecepatan alir 1,0 ml/menit. Repetisi dilakukan sebanyak 5
kali. Perhitungan resolusi dilakukan apabila terdapat 2 puncak kromatogram yang
saling berdekatan dengan memasukkan selisih waktu retensi dan lebar peak ke
dalam rumus perhitungan resolusi.
b. Penentuan linearitas. Sebanyak 10 µl larutan baku kurkumin dengan
konsentrasi 1,5; 2,5; 3,5; 4,5; 5,5; dan 6,5 ppm dari larutan baku intermediet
kurkumin yang telah disaring dengan Milipore, diawaudarakan dengan

36
ultrasonikator selama 15 menit. Kemudian diinjeksikan pada sistem KCKT fase
terbalik menggunakan dengan jenis dan komposisi fase gerak metanol p.a. : asam
asetat glasial 2% (95:5 v/v) pada kecepatan alir 1,0 ml/menit. Replikasi dilakukan
sebanyak 5 kali. Kromatogram akan menunjukkan luas area kurkumin untuk
masing-masing konsentrasi. Luas area diplotkan dengan masing-masing
konsentrasi untuk membuat persamaan regresi linier dengan persamaan y = bx +
a. Dari kurva hubungan antara luas area dan konsentrasi akan diperoleh nilai
koefisien korelasi (r) sebagai parameter untuk menentukan linieritasnya.
c. Penentuan akurasi dan presisi larutan baku kurkumin. Sebanyak 10,0
µl larutan baku kurkumin dengan kadar 0,5; 3,5; dan 6,5 ppm yang telah disaring
dengan Milipore dan diawaudarakan selama 15 menit diinjeksikan pada sistem
KCKT fase terbalik dengan jenis dan komposisi fase gerak metanol p.a. : asam
asetat glasial 2% (95:5 v/v) pada kecepatan alir 1,0 ml/menit. Selanjutnya
dihitung kadar terukur dari masing-masing seri larutan baku dengan memasukkan
nilai respon yang diperoleh ke dalam persamaan kurva baku. Replikasi dilakukan
sebanyak 5 kali.
d. Penentuan akurasi dan presisi berdasar standard addition method.
Dibuat larutan sampel dan larutan sampel adisi. Larutan sampel dibuat dengan
mengambil 100 µl ekstrak sampel yang telah diekstraksi selama 15 menit secara
mekanik dengan magnetic stirrer dan diencerkan dengan metanol pH 4 hingga
tanda. Larutan sampel adisi dibuat dengan mengambil 535 µl larutan intermediet
kurkumin dan 100 µl ektstrak sampel dalam labu takar 10,0 ml kemudian
diencerkan dengan metanol pH 4 hingga tanda. Keduanya disaring dengan

37
Millipore dan diawaudarakan menggunakan ultrasonikator selama 15 menit.
Sebanyak 10 µl dari tiap larutan diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik
dengan jenis dan komposisi fase gerak metanol p.a. : asam asetat glasial 2% (95:5
v/v) pada kecepatan alir 1,0 ml/menit. Repetisi dilakukan sebanyak 5 kali. Kadar
baku kurkumin yang ditambahkan dalam sampel dihitung dengan memasukkan
selisih nilai respon sampel adisi dan respon sampel ke dalam persamaan kurva
baku.
e. Penentuan rentang. Rentang diperoleh dari hasil perhitungan data
linearitas, akurasi, dan presisi.
G. Analisis Hasil
1. Selektivitas
Selektivitas ditentukan dengan daya resolusi dari puncak kromatogram
yang dihasilkan oleh baku kurkumin dan kemampuan metode KCKT fase terbalik
dengan sistem yang telah dioptimasi untuk memisahkan kurkumin dengan
senyawa lain dalam sampel kapsul lunak OHT merek Rheumakur ®. Selektivitas
ditentukan dengan perhitungan resolusi menggunakan rumus:
(t R2  t R1 ) (7)
Rs 
1 (w 1  w 2 )
2
Keterangan:
Rs= resolusi w1= lebar dasar peak pertama
tR1= waktu retensi puncak pertama w2= lebar dasar peak kedua
tR2= waktu retensi puncak kedua
38
Nilai Rs= 1,0 menunjukkan puncak kromatogram baku kurkumin tidak
terpisah sampai ke baseline, nilai Rs= 1,5 menunjukkan puncak telah terpisah
sampai baseline, dan nilai Rs > 1,5 menunjukkan pemisahan puncak-puncak telah
sempurna antara satu sama lain.
2. Linearitas
Linearitas dilihat dari harga koefisien korelasi (r) hasil pengukuran seri
baku kurkumin. Rentang ditentukan dari kadar larutan baku kurkumin konsentrasi
terkecil hingga terbesar. Persyaratan data linearitas yang dapat diterima adalah
jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999.
3. Akurasi
Akurasi metode analisis dinyatakan dengan nilai % recovery yang
dihitung dari konsentrasi terukur dibandingkan dengan konsentrasi teoritis (kadar
sebenarnya) dikalikan 100%.
konsentrasi terukur
Recovery= ×100% (8)
konsentrasi teoritis
4. Presisi
Presisi metode analisis dinilai berdasarkan Coefficient of Variation (CV)
yang dihitung dengan cara sebagai berikut:

39
SD
CV= ×100% (9)
𝑋
Keterangan:
SD = Standard Deviation
𝑋 = kadar rata-rata
𝐶𝑉 = Coefficient of Variation
5. Rentang
Rentang merupakan interval antara kadar terendah sampai tertinggi analit
yang dapat diukur secara kuantitatif menggunakan metode analisis tertentu dan
menghasilkan linearitas, akurasi, dan presisi yang baik.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Fase Gerak KCKT
Sistem KCKT yang digunakan dalam validasi metode penetapan kadar
kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT merek Rheumakur ® secara KCKT
fase terbalik karena menggunakan fase gerak yang bersifat lebih polar
dibandingkan fase diamnya. Jenis dan komposisi fase gerak yang digunakan
dalam penelitian ini adalah campuran metanol p.a. dan asam asetat glasial 2%
dengan perbandingan 95:5 (v/v) dengan indeks polaritas sebesar 5,351. Metanol
p.a. dan asam asetat glasial 2% dipilih sebagai fase gerak karena keduanya dapat
melarutkan kurkumin dengan baik.
Sebelum digunakan, komponen fase gerak disaring menggunakan
penyaring Whatman dengan bantuan pompa vakum untuk menyaring partikel-
partikel yang dapat menyumbat kolom. Selanjutnya diawaudarakan menggunakan
ultrasonikator untuk menghilangkan gelembung udara yang dapat mengganggu
tekanan pompa pada instrumen KCKT. Gelembung udara dapat mengakibatkan
tekanan pada pompa tidak stabil sehingga mempengaruhi proses pembacaan
sinyal dalam instrumen KCKT.
Pencampuran fase gerak dalam metode ini dilakukan dengan sistem
gradien di dalam instrumen KCKT. Pemilihan penggunaan sistem pencampuran
fase gerak sistem gradien karena proses kerja menjadi lebih cepat dan efisien yang
didukung oleh kemampuan dari instrumen KCKT yang digunakan. Campuran fase
gerak metanol p.a. dan asam asetat glasial 2% (95:5 v/v) memiliki nilai pH 4
40
41
sehingga tidak akan merusak kolom oktadesilsilan (C 18) pada instrumen KCKT.
Penggunaan campuran metanol p.a. dan asam asetat glasial 2% (95:5 v/v) sebagai
fase gerak memiliki nilai pH 4 sehingga tidak akan merusak kolom kromatografi.
Pada pH terlalu asam (pH ≤ 2), C18 bereaksi dengan asam sehingga oktadesilsilan
kembali ke bentuk silanol (Gambar 9).
H2O/H
Si O Si (CH2)17CH3 Si OH Cl Si (CH)17CH3 H+
Gambar 9. Reaksi degradasi kolom C18 pada pH asam ≤ 2
B. Pembuatan Pelarut dan Stabilitas Kurkumin
Menurut Tonnesen dan Karlsen (1995), stabilitas kurkumin dipengaruhi
oleh pH dan cahaya. Kurkumin stabil dalam pH asam yang secara kenampakan
fisik menunjukkan warna kuning sesuai dengan warna asli kurkumin. Pada
kondisi lingkungan basa, kurkumin akan mengalami degradasi membentuk asam
ferulat dan feruloil metan. Pengujian stabilitas kurkumin dilakukan pada kondisi
lingkungan suasana asam pada berbagai pH. Metanol p.a. memiliki pH 5 dan
asam asetat glasial 2% memiliki pH 2. Pelarut baku kurkumin yang digunakan
adalah metanol p.a dengan penambahan sejumlah tertentu asam asetat glasial 2%
untuk mengatur suasana asam. Hasil optimasi pengujian stabilitas kurkumin
berdasarkan pH menunjukkan bahwa kurkumin stabil pada suasana asam dengan
pH 4. Pada suasana asam (pH 4) kurkumin akan stabil pada bentuk molekulnya.
Dalam suasana basa kurkumin mengalami perpanjangan gugus kromofor
di mana terjadi perubahan warna menjadi kemerahan. Adanya perpanjangan
gugus kromofor mengakibatkan terjadinya pergeseran batokromik dan lama-

42
kelamaan senyawa kurkumin dapat terputus ikatannya pada gugus metilen aktif
menjadi trans-6-(4’-hidroksi-3-metoksifenil)-2,3-diokso-5-heksanal, asam ferulat,
feruloilmetan, dan vanilin yang tidak berwarna.
Gambar 10. Gugus metilen aktif pada kurkumin
C. Pembuatan Larutan Baku Kurkumin
Larutan baku kurkumin dibuat dengan melarutkan baku kurkumin dalam
pelarut metanol p.a pada pH 4. Larutan baku yang dibuat pada penelitian ini
terdiri dari 3 macam, yaitu: larutan stok, larutan intermediet, dan larutan seri baku.
Larutan stok dibuat dengan konsentrasi 1000 ppm, sedangkan larutan intermediet
dibuat dengan konsentrasi 100 ppm. Larutan seri baku dibuat dalam enam
konsentrasi berbeda, yaitu: 1,5; 2,5; 3,5; 4,5; 5,5; dan 6,5 ppm.
D. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum Kurkumin
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum kurkumin bertujuan
untuk mengetahui pada panjang gelombang berapa kurkumin memberikan
absorbansi maksimum pada detektor visibel. Selain itu, untuk mengetahui
intermediate precision dari metode yang digunakan yaitu ketepatan pada kondisi
percobaan yang berbeda, baik sumber daya manusia, peralatan dan waktunya.
43
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum kurkumin dilakukan
dengan menggunakan konsentrasi larutan baku kurkumin dengan konsentrasi 0,4;
1,0; dan 1,6 ppm. Pelarut yang digunakan dalam penentuan panjang gelombang
maksimum kurkumin sama dengan pelarut yang digunakan untuk analisis pada
sistem KCKT. Panjang gelombang serapan maksimum dilakukan dengan
mengukur absorbansi kurkumin pada daerah visibel. Menurut Aggarwal et al.,
(2006), panjang gelombang serapan maksimum (λmaks.) kurkumin adalah 430 nm.
Suatu senyawa untuk dapat ditetapkan kadarnya pada panjang gelombang visibel
harus memiliki gugus kromofor dan auksokrom, di mana kedua gugus ini
bertanggung jawab dalam penyerapan radiasi. Kurkumin memiliki gugus
kromofor dan aukokrom pada strukturnya sehingga dapat memberikan serapan
pada daerah visibel (Gambar 11). Kromofor merupakan gugus fungsional tak
jenuh yang mengandung elektron π dan jika terkena radiasi elektromagnetik,
mudah tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi yaitu orbital π*. Auksokrom
merupakan gugus jenuh yang mengandung heteroatom di mana terikat pada
kromofor dan dapat mengubah atau meningkatkan intensitas maksimum dari
senyawa.
44
Gambar 11. Gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kurkumin
Keterangan:
: gugus kromofor
: gugus auksokrom
Spektra yang dihasilkan pada penetapan panjang gelombang maksimum
kurkumin menggunakan 3 konsentrasi berbeda ditunjukkan pada gambar di bawah
ini:
Gambar 12. Spektra panjang gelombang maksimum kurkumin
Keterangan:
1= konsentrasi rendah (0,4 ppm)
2= konsentrasi tengah (1,0 ppm)
3= konsentrasi tinggi (1,6 ppm)
Persamaan Lambert-Beer menyatakan hubungan matematis antara
absorban terhadap konsentrasi zat yang dianalisis, di mana semakin besar

45
konsentrasi maka absorban juga semakin bertambah. Spektra ketiga larutan baku
kurkumin dengan konsentrasi 0,4; 1,0; dan 1,6 ppm diperoleh panjang gelombang
maksimum berturut-turut sebesar 432, 433, dan 432 nm. Spektra panjang
gelombang maksimum kurkumin (gambar 12) menunjukkan pada konsentrasi
larutan baku kurkumin yang berbeda-beda tetap menunjukkan pola spektra yang
sama meskipun terjadi peningkatan absorbansi di mana ditunjukkan dengan
panjang gelombang maksimum dari tiap konsentrasi. Panjang gelombang
maksimum kurkumin terletak pada panjang gelombang 432 nm sesuai spektra
yang ditunjukkan pada larutan baku konsentrasi rendah (0,4 ppm) dan konsentrasi
tinggi (1,6 ppm). Menurut Farmakope Indonesia III, penyimpangan panjang
gelombang maksimum yang diperbolehkan sebesar ± 2 nm dari panjang
gelombang maksimum teoritis sehingga panjang gelombang maksimum yang
diperoleh dari pengukuran masih dapat digunakan untuk validasi metode
penetapan kadar kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT merek Rheumakur ®
secara KCKT fase terbalik.
E. Analisis Kualitatif Berdasarkan Waktu Retensi (tR) Kurkumin
Analisis kualitatif pada KCKT pada prinsipnya mengacu pada waktu
retensi (tR) peak kromatogram yang dianalisis. Tujuan dari pengamatan waktu
retensi (tR) dari kurkumin adalah untuk mengetahui waktu yang dibutuhkan
kurkumin saat melewati fase diam dengan bantuan fase gerak.
Waktu retensi dari kurkumin dipengaruhi oleh interaksi kurkumin dengan
fase diam dan fase geraknya atau dengan kata lain dipengaruhi oleh koefisien
46
partisi dari kurkumin terhadap fase diam dan fase geraknya. Kurkumin memiliki
sisi polar dan non polar pada strukturnya. Pada penelitian ini sistem kromatografi
yang digunakan adalah kromatografi partisi fase terbalik di mana fase gerak yang
digunakan lebih polar dibanding fase diam. Oleh karena itu, senyawa yang
cenderung bersifat non polar menyebabkan senyawa akan lebih lama melewati
kolom sehingga waktu retensinya akan lebih besar.
Dilihat dari strukturnya, kurkumin memiliki gugus polar dan non polar
yang berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak.
O O
OH3C CH3O
HO OH
Gambar 13. Gugus polar dan non polar pada struktur kurkumin
Keterangan gambar :
: gugus polar
: gugus non polar
Gugus polar dari kurkumin berinteraksi dengan fase gerak melalui
interaksi hidrogen, sedangkan bagian gugus non polar dari kurkumin berinteraksi
dengan fase diam melalui ikatan Van Der Waals. Berikut ini merupakan interaksi
antara kurkumin dengan fase diam oktadesilsilan dan fase gerak metanol p.a. :
asam asetat glasial 2% (95:5 v/v).

47
O O
H3C C O H H O C CH3
H O H H O H
H H C CH3 H3C C H H
H3C O H H O CH3 O
O O O
H CH3 O O CH3 H
O H O O H O
CH3 CH3
H H
O O
H H
O CH3 H3C O
H H H H
O O
H H
O C CH3
O C CH3
O
O
Gambar 14. Interaksi hidrogen antara kurkumin dengan fase gerak metanol:asam asetat
glasial 2% (95:5)
O O
OH3C CH3O
HO OH
H3C
H3C
Si
O CH3 Interaksi Van Der Waals
Gambar 15 . Interaksi Van Der Waals kurkumin dengan fase diam oktadesilsilan
Dari gambar 14 dan 15 menunjukkan bahwa interaksi kurkumin dengan
fase gerak lebih kuat dibandingkan dengan fase diam. Hal ini dipengaruhi oleh
adanya interaksi hidrogen antara kurkumin dengan fase gerak.
Dari kromatogram (Gambar 16) diketahui bahwa baku kurkumin
memiliki tR 2,682 menit dan kurkumin dalam sampel kapsul lunak OHT merek
48
Rheumakur® memiliki tR 2,680 menit. Oleh karena itu dapat dipastikan bahwa
dalam sampel kapsul OHT merek Rheumakur® terdapat kandungan kurkumin.
(a)
(b)
Gambar 16. Kromatogram baku kurkumin (a) dan kurkumin dalam sampel (b)
F. Pembuatan Kurva Baku Kurkumin
Pembuatan kurva baku kurkumin bertujuan untuk mendapatkan
persamaan regresi linear sehingga dapat digunakan dalam analisis kuantitatif.
Kurva baku menyatakan hubungan linier antara konsentrasi dengan Area Under
Curve (AUC) di mana dengan meningkatnya konsentrasi maka akan
meningkatkan AUC yang dihasilkan. Persamaan regresi linier diperoleh dengan
melakukan pengukuran analit dalam beberapa konsentrasi.

49
Penelitian ini menggunakan 6 seri konsentrasi larutan baku kurkumin,
yaitu: 1,5; 2,5; 3,5; 4,5; 5,5; dan 6,5 ppm yang masing-masing direplikasi 3 kali.
Pembuatan kurva baku dilakukan replikasi sebanyak 3 kali dengan tujuan untuk
mendapatkan kurva baku dengan nilai koefisien korelasi paling baik. Ada
beberapa pertimbangan yang diperhatikan dalam pemilihan data persamaan kurva
baku beberapa replikasi yaitu berdasarkan pada nilai r terhitung, nilai A
(intersept), nilai B (slope), dan SE (standard error). Dalam penelitian ini,
parameter utama yang digunakan adalah berdasarkan nilai r terhitung yang
didapatkan yaitu 0,9996 di mana r yang didapatkan lebih besar dari nilai r
linearitas analisis yaitu > 0,999 untuk minimal 5 seri konsentrasi (ICH, 1995).
Nilai r semakin mendekati 1 menunjukkan semakin baik linearitas persamaan
yang didapat, sehingga semakin baik hubungan antara peningkatan konsentrasi
dengan peningkatan respon yaitu AUC. Berikut tabel data perolehan AUC seri
baku kurkumin dari 3 kali replikasi.
Tabel VI. Penentuan kurva baku kurkumin
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

C (ppm) AUC C (ppm) AUC C (ppm) AUC
1,5 80587 1,47 88101 1,53 99579
2,5 140888 2,45 151483 2,55 154468
3,5 192509 3,43 234079 3,57 227391
4,5 246752 4,41 290285 4,59 285619
5,5 316510 5,39 383911 5,61 350697
6,5 383164 6,37 463126 6,63 413947
A = -12578,6 A = - 31915,6429 A = 1711,5
B = 59828,4 B = 76636,0058 B = 63393
r = 0,9985 r = 0,9980 r = 0,9996
α = 89,99° α = 89,99° α = 89,99°
Keterangan:
C = konsentrasi seri baku kurkumin (ppm)
AUC = Area Under Curve
50
Dari hasil penentuan kurva baku kurkumin, ketiga persamaan regresi linear yang
diperoleh memiliki nilai α yang lebih dari 45° sehingga bila dibuat kurva baku
hubungan konsentrasi seri baku kurkumin dengan AUC akan dihasilkan kurva
dengan kemiringan kurang baik dengan α sebesar 89,99°. Oleh karena itu,
dilakukan modifikasi yaitu konsentrasi baku kurkumin dikalikan 60.000.000
sehingga diperoleh hasil seperti yang tersaji pada tabel VII.
Tabel VII. Penentuan kurva baku kurkumin hasil modifikasi

C (mg/ml)x6.107 AUC C (mg/ml)x6.107 AUC C (mg/ml)x6.107 AUC
90000 80587 88200 88101 91800 99579
150000 140888 147000 151483 153000 154468
210000 192509 205800 234079 214200 227391
270000 246752 264600 290285 275400 285619
330000 316510 323400 383911 336600 350697
390000 383164 382200 463126 397800 413947
A = -12578,6 A = - 31915,6429 A = 1711,5
B = 0,9971 B = 1,2773 B = 1,0358
r = 0,9985 r = 0,9980 r = 0,9996
α = 44,92° α = 51,94° α = 46,01°
Keterangan:
C = konsentrasi seri baku kurkumin ((mg/mg) x 6.107)
Dari data yang diperoleh, dapat dilihat bahwa nilai r yang diperoleh dari
replikasi ke-3 memiliki nilai koefisien korelasi (r) yang baik sesuai yang
dipersyaratkan yaitu nilai r > 0,999 untuk minimal 5 seri konsentrasi larutan baku
(ICH, 1995).
51
Berikut grafik kurva baku yang dihasilkan:
450000
Konsentrasi VS AUC
400000
350000
300000 y=1,0358x + 1711,5
250000
AUC
r=0,9996
200000
150000
100000
50000
0
0 100000 200000 300000 400000 500000
Konsentrasi (mg/ml)x60.000.000
Gambar 17. Kurva baku kurkumin
Kurva baku kurkumin dengan nilai α sebesar 46,01° dapat menunjukkan
korelasi yang baik antara AUC dengan konsentrasi di mana semakin tinggi
konsentrasi maka nilai AUC juga semakin meningkat sehingga persamaan kurva
baku yang dihasilkan dapat digunakan untuk perhitungan kadar kurkumin. Nilai r
yang mendekati satu menggambarkan adanya korelasi yang baik antara variabel
bebas (konsentrasi) dan variabel tergantung (AUC).
G. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis merupakan suatu proses untuk membuktikan
apakah suatu metode memiliki validitas yang baik sesuai dengan parameter-
parameter yang diujikan. Tujuan dilakukan validasi metode adalah untuk
membuktikan dan menjamin bahwa metode analisis yang digunakan memiliki
validitas yang baik sehingga hasilnya dapat dipercaya.

52
Menurut USP XXVIII validasi metode dilakukan minimum 9 kali
penentuan mencakup range tertentu, misal 3 macam konsentrasi dan setiap
konsentrasi direplikasi 3 kali (United States Pharmacopeial Convention, 2000).
Dalam penelitian ini digunakan 3 macam konsentrasi yang direplikasi 5 kali yaitu
konsentrasi rendah 1,5 ppm; konsentrasi tengah 3,5 ppm; dan konsentrasi tinggi
6,5 ppm. Pemilihan konsentrasi rendah, tengah, tinggi dari kurva baku adalah
untuk mewakili keseluruhan konsentrasi yang dibuat yaitu antara konsentrasi 1,5
sampai 6,5 ppm.
Parameter-parameter yang dibutuhkan dalam validasi metode ditentukan
oleh kategori metode analisis yang digunakan. Pada penelitian ini termasuk dalam
kategori I menurut USP 28 karena penelitian yang dilakukan merupakan metode
analisis kuantitatif yang digunakan untuk mengukut secara kuantitatif sejumlah
besar komponen dari serbuk obat atau senyawa aktif (termasuk preservatif) dalam
sediaan obat jadi. Dengan demikian, parameter-parameter validasi yang
dibutuhkan dalam penelitian ini adalah selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan
rentang.
1. Selektivitas
Selektivitas suatu metode merupakan kemampuan untuk mengukur zat
tertentu saja yang dapat dibedakan dengan adanya komponen lain yang mungkin
terdapat dalam matriks sampel yang multikomponen. Penentuan selektivitas
metode KCKT dapat diamati dari pemisahan peak analit yang dihasilkan dan
dinyatakan sebagai nilai resolusi (Rs). Metode KCKT dikatakan memiliki

53
selektivitas yang baik jika nilai Rs yang dihasilkan > 1,5. Pada penelitian yang
dilakukan tidak dilakukan perhitungan nilai Rs karena pada kromatogram yang
diperoleh (Gambar 18) menunjukkan peak yang dominan dari kurkumin dalam
sampel. Proses preparasi sampel kapsul lunak OHT merek Rheumakur ® dengan
cara ekstraksi menggunakan pelarut metanol p.a. pH 4. Selanjutnya dilakukan
pengadukan mekanik selama 15 menit untuk melarutkan kurkumin yang terdapat
dalam sampel. Komponen lain yang tidak larut dalam metanol akan tersaring
dalam penyaring sehingga tidak ikut diinjeksikan ke dalam instrumen KCKT.
Komponen lain yang larut metanol memberikan respon dalam kromatogram,
namun peak yang muncul memiliki signal kecil sehingga tidak mengganggu peak
kurkumin. Oleh karena itu, perhitungan Rs tidak dilakukan. Hasil penentuan
selektivitas dari kromatogram kurkumin dalam sampel yang diperoleh
menunjukkan bahwa metode ini dapat dikatakan memiliki selektivitas yang baik.
Gambar 18. Kromatogram kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT merek Rheumakur®
pada konsentrasi tinggi (6,5 ppm)
54
2. Linearitas
Linearitas dalam metode analitik merupakan suatu kemampuan untuk
memperoleh hasil uji yang proporsional dengan konsentrasi analit pada sampel
yang dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Linearitas yang baik adalah nilai r
yang lebih besar dari 0,999 untuk minimal 5 seri konsentrasi larutan baku (ICH,
1995).
Berdasarkan hasil pembuatan kurva baku diperoleh nilai r sebesar 0,9996
sehingga dapat disimpulkan bahwa metode yang digunakan memiliki linearitas
yang baik di mana dengan meningkatnya konsentrasi maka nilai AUC juga
meningkat.
3. Akurasi
Akurasi menyatakan ukuran kedekatan nilai hasil percobaan dengan nilai
yang sebenarnya. Akurasi suatu metode dalam penelitian ini dapat dilihat dari
nilai recovery atau persen perolehan kembali. Metode penentuan recovery yang
digunakan pada penelitian ini adalah metode recovery larutan baku dan metode
standard addition. Metode penentuan recovery memberikan batasan % recovery
yang diterima untuk analit pada matriks sampel sebesar 100% biasanya disepakati
98-102% (United States Pharmacopeial Convention, 2007).

55
Berikut hasil pengukuran % recovery larutan baku pada 3 konsentrasi yang
berbeda:
Tabel VIII. Hasil penetapan recovery (%) baku kurkumin
Konsentrasi Recovery (%)

kurkumin Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5
(ppm)
1,5 94,3922 97,3401 96,3267 97,9863 95,6898
3,5 86,3053 89,8455 89,1743 91,5140 88,2744
6,5 98,7074 102,8226 100,7862 102,9929 99,6603
Hasil perhitungan data menunjukkan bahwa nilai % recovery larutan
baku pada konsentrasi rendah (1,5 ppm) berada pada rentang 94,3922-97,9863%,
konsentrasi tengah (3,5 ppm) berada pada rentang 86,3053-91,5140%, dan
konsentrasi tinggi (6,5 ppm) berada pada rentang 98,7074-102,9929%.
Berdasarkan batasan menurut Harmita (2004), dari 3 level konsentrasi baku
tersebut, hanya konsentrasi tinggi (6,5 ppm) saja yang masuk pada rentang 98-
102%. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa metode yang digunakan memiliki
akurasi yang baik pada konsentrasi tinggi, yaitu 6,5 ppm.
Untuk memastikan bahwa pada konsentrasi tinggi memiliki akurasi yang
baik maka dilakukan juga penentuan nilai recovery dengan standard addition
method. Tujuan penggunaan standard addition method adalah metode yang
divalidasi ini akan diaplikasikan pada penetapan kadar kurkumin dalam sediaan
kapsul lunak Obat Herbal Terstandar merek Rheumakur ®. Dalam standard
addition method, sampel dianalisis kemudian sejumlah tertentu analit
ditambahkan ke dalam sampel dan dianalisis lagi. Selisih hasil analisis sampel
sebelum dan sesudah ditambahkan baku dibandingkan dengan kadar yang
sebenarnya (Harmita, 2004). Pada penelitian ini analit yang ditambahkan ke

56
dalam sampel adalah sebanyak 5,35 ppm sehingga respon AUC kurkumin yang
dihasilkan mendekati respon baku kurkumin konsentrasi tinggi (6,5 ppm) sesuai
hasil pada penetapan recovery baku sebelumnya yang terlihat pada gambar 19 dan
gambar 20.
Gambar 19. Respon sampel sebelum diadisi (kiri) dan sampel setelah diadisi (kanan)
Gambar 20. Respon baku kurkumin pada konsentrasi tinggi (6,5 ppm)
Kromatogram menunjukkan bahwa penambahan baku kurkumin ke dalam larutan
sampel menyebabkan peningkatan respon AUC. Hasil perhitungan nilai recovery
dengan standard addition method adalah sebagai berikut:
Tabel IX. Hasil perhitungan nilai recovery (%) dengan standard addition method
Repetisi AUC Konsentrasi Recovery

ke- Sampel Baku Adisi terukur baku (%)
kurkumin sampel kurkumin adisi
adisi (ppm)
1 102146 335653,8 445691 5,2678 98,4635
2 114414 340733,8 450771 5,3479 99,9607
3 114388 339281,8 449319 5,3250 99,5327
4 107880 348478,8 458516 5,4701 102,2448
5 111358 348298,8 458336 5,4673 102,1925
57
Hasil perhitungan data recovery standard addition menunjukkan bahwa nilai %
recovery standard addition berada pada rentang nilai % recovery yang disepakati
untuk analit pada matriks sampel sebesar ≤ 10 ppm yaitu 80-110%.
Berdasarkan hasil perhitungan recovery menunjukkan bahwa metode
penetapan kadar kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT merek Rheumakur®
secara KCKT memiliki akurasi yang baik.
4. Presisi
Presisi adalah suatu ukuran kedekatan nilai data satu dengan data lainnya
dalam suatu pengukuran pada kondisi analisis yang sama. Presisi seringkali
diukur sebagai Koefisien Variasi (KV) atau Coefficient of Variation (CV) untuk
sejumlah sampel yang berbeda bermakna secara statistik. Kriteria presisi
diberikan jika metode memberikan nilai CV 2% atau kurang (Harmita, 2004).
Berikut hasil pengukuran CV pada 3 konsentrasi yang berbeda:
Tabel X. Hasil pengukuran coefficient of variation larutan baku kurkumin
Konsentrasi Konsentrasi rata- Simpangan deviasi Coefficient of

kurkumin rata (x) (SD) Variation (CV)
(ppm)
1,5 1,4391 0,0102 0,7088

3,5 3,1023 0,0199 0,6414
6,5 6,5363 0,0241 0,3687
Dari hasil perhitungan nilai CV, diperoleh nilai CV yang memenuhi
persyaratan yang berlaku untuk konsentrasi rendah (1,5 ppm), sedang (3,5 ppm),
dan tinggi (6,5 ppm) yaitu lebih kecil dari 2%, namun berdasarkan parameter
akurasi maka dipilih konsentrasi tinggi (6,5 ppm) yang memiliki CV yang paling
58
baik untuk metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT
merek Rheumakur®.
Tabel XI. Hasil pengukuran coefficient of variation dengan standard addition method
Repetisi ke Recovery (%) Konsentrasi rata- Simpangan CV (%)

rata (x) deviasi (SD)
1 98,4635
2 99,9607
3 99,5327 5,3756 0,0898 1,6705
4 102,2448
5 102,1925
Nilai presisi tersebut didukung oleh nilai presisi yang diperoleh dari
perhitungan recovery standard addition dengan batasan untuk kadar analit dalam
matriks sampel ≤ 10 ppm yaitu 1,6705%.
5. Rentang
Berdasarkan hasil dari perhitungan linearitas, akurasi, dan presisi dapat
dikatakan bahwa parameter rentang didapatkan pada daerah konsentrasi tinggi
(6,5 ppm).
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik pada penetapan
kadar kurkumin dalam sediaan kapsul lunak Obat Herbal Terstandar merek
Rheumakur® memenuhi parameter validitas: selektifitas, linearitas, akurasi,
presisi, dan rentang. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode KCKT fase
terbalik memiliki selektifitas yang baik dengan adanya pemisahan sempurna dari
peak sampel dan linearitas yang baik dengan nilai koefisien korelasi 0,9996 pada
konsentrasi 1,5-6,5 ppm. Nilai recovery dan CV untuk baku kurkumin pada
konsentrasi 1,5 ppm; 3,5 ppm; dan 6,5 ppm berturut-turut adalah 94,3922-
97,9863% dan 0,7088%; 86,3053-91,5140% dan 0,6414%; dan 98,7074-
102,9929% dan 0,3687%, sedangkan untuk recovery standard addition method
adalah 98,4635-102,2448% dan 1,6705%. Berdasarkan hasil tersebut, maka
metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik memiliki validitas baik untuk
penetapan kadar kurkumin dalam sediaan kapsul lunak Obat Herbal Terstandar
merek Rheumakur®.
B. Saran
Penelitian ini perlu diaplikasikan dalam bentuk penetapan kadar
kurkumin pada sediaan Obat Herbal Terstandar merek Rheumakur ® dengan
metode Kromatografi Cair Kinerja Tingi Fase Terbalik yang telah tervalidasi.
59
DAFTAR PUSTAKA
Aggarwal, B.B., Bhatt, I.D., Ichikawa, H., Ahn, K.S., Sethi, G., Sandur, S.K.,
dkk., 2006, Curcumin-Biological and Medical Properties,
http://www.indsaff.com/10%20Curcumin%20biological.pdf, diakses
tanggal 15 Desember 2010.
Ahuja, S., and Dong, Michael W., 2005, Handbook of Pharmaceutical Analysis
By HPLC, 1st ed., volume 6, Elsevier Academic Press, United Kingdom,
pp.194-207.
Badan Pengawas Obat dan Makanan, 2005, Peraturan Kepala Badan Pengawas
Obat dan Makanan Nomor HK.00.05.41.1384 tentang Kriteria dan Tata
Laksana Pendaftaran Obat Tradisional, Obat Herbal Terstandar dan
Fitofarmaka, BPOM RI, Jakarta,
http://www.pom.go.id/public/hukum_perundangan/pdf/KRITCARA%20
PENDAFT.OT.pdf, diakses tanggal 5 Januari 2011.
Bermawie, N., Rahardjo, M., Wahyuno, D., dan Ma’mun, 2006, Status Teknologi
Budidaya dan Pasca Panen Tanaman Kunyit dan Temulawak Sebagai
Penghasil Kurkumin, Laporan Penelitian, Balai Penelitian Tanaman
Obat dan Aromatik.
Chan, C.C., Lam, H., Lee., Y.C., Zhang, Xue-Ming, 2004, Analytical Method
Validation and Instrument Performance Verification, A John Willet &
Sons.Inc., publication, New Jersey, pp. 17, 22.
Dandekar, V., and Patravale, 2009, Development and Validation of a Stability-

Indicating LC Method for Curcumin, Chromatographia, 69(9-10), 871-
877.
Dean, J.A., 1995, Analytical Chemistry Handbook, 464, McGraw-Hill, Inc.,

Newyork.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope

Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, 6, 17, 1009.
Gritter, R. J., Bobbit, J. M., and Schwarting, A. E., 1991, Introduction to

Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, edisi II,
ITB, Bandung, 205-219.
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,

Majalah Ilmu Kefarmasian, 1 (3), 117-134, Departemen Farmasi FMIP,
Universitas Indonesia, Jakarta.
60
61
Harris, D. C., 1999, Quantitative Chemical Analysis, 2nd ed., W. H. Freeman

Company, New York, 643, 648, 716-717.
ICH, 1995, Note For Guidance on Validation of Analytical Procedures:

Methodology, The European Agency for The Evaluation of Medicinal
Products Human Medicines Evaluation Unit, London.
International Union of Pure and Applied Chemistry, 2002, Use of Terms

“Recovery” and “Apparent Recovery” in Analytical Procedures, Pure
Apll.Chem, 74 (11),2201-2205.
Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, diterjemahkan oleh A.

Saptohardjo, Pendamping Agus Nurhadi, UI Press, Jakarta, 189.
Kromidas, S., 2000, Practical Poblem Solving in HPLC, Wiley-VCH, Weinheim,

36-40.
Lambertson, C., 2009, Simulation Addresses Band-Broadening in HPLC Systems,

http://www.comsol.com/stories/waters_corp_hplc_systems/full/, diakses
tanggal 25 Januari 2011.
Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, 1996, The Merck Index, An
Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biological, Merck & Co.,
Inc.,USA, 2743.
Mulja, M., dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium yang
Baik (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Indonesia Airlangga,
Vol.III No. 2, 71-76, Universitas Airlangga Press, Surabaya.
Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga,

Surabaya, 6-11, 26, 31, 34.
Munson, J. W., 1984, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan

oleh Harjana dan Parwa B., Universiutas Airlangga Press, Surabaya,
15,33-34.59
Musfiroh, I., Indriyati, w., Susilawati, Y., Percekawati, A., 2009, Curcumin
Quantification in Dosage Forms Using High Performance Liquid
Chromatography, Laporan Penelitian, Fakultas Farmasi Universitas
Padjajaran, Bandung.
Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, UGM, Yogyakartal 6-17.
Parinussa, T.M.S., dan Timotius, K.H., 2002, Pengaruh Penambahan Asam

Terhadap Aktivitas Antioksidan Kurkumin, Laporan Penelitian,
Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga.
62
Rohman, A., dan Gandjar, I. G., 2007, Kimia Farmasi Analisis, cetakan kedua,
Penerbit Pustaka Pelajar, Yogyakarta, 323-345, 378-389.
Sastrohamidjojo, H., 2002, Spektroskopi, Penerbit Liberty, Yogyakarta, 9, 11,

15,22-26.
Sharma, K.K., and Dhir, A., 2010, An Overview of Curcumin in Neurological

Disorders, Indian Journal Pharmaceutical Sciences, 72(2), 149-154.
Skoog, D. A., Holler, F. J. and Nieman, T. A., 1998, Principles of Instrumental

Analysis, 5th edition, Harcourt Brace College Publishers, Philadelphia,
325-351.
Sumule, A.W., 2007, Validasi Metode Penetapan Kadar Kurkumin Secara

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dan Aplikasinya dalam Sediaan Sirup,
Tesis, Sekolah Pascasarjana, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J. and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method
Development, 2nd edition, , John Wiley and Sons, Inc., New York 687-
688, 690, 691, 695.
Tonnesen, H.H. and Karlsen, J., 1985, Studies on Curcuminand Curcuminoids, V.

Alkaline Degradation of Curcumin, Z. Lebensm. Unters. Forsch.,
180,132-134.
Tonnesen, H.H., 1986, Chemistry, Stability and Analyst of Curcumin-A Naturally
Occuring Drug Molecule, Ph. D, Thesis, Institute of Pharmacy,
University of Oslo, Oslo.
United States Pharmacopeial Convention, 2007, United State Pharmacopoeia,

Edisi 30 (monograph on CD-ROM), United States Pharmacopoeial
Convention, Inc.
Watson, D. G., 2003, Pharmaceutical Analysis, Churcill Livingstone, London,

265.
Widjaja, M., 2011, Validasi Metode Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaan
Cair Obat Herbal Terstandar Merk Kiranti ® Secara Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi Fase Terbalik, Skripsi, Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta.
World Health Organization, 2008, Traditional Medicine,

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/en/, diakses tanggal 20
Januari 2011.
63
Yuwono, M. and Indrayanto, G., 2005, Validation of Chromatographic Methods

of Analysis, Profile of Drug Substances, Excipients, and Related
Methodology, Elseiver Inc., 32, 243-259.
LAMPIRAN
64
65
Lampiran 1. Pernyataan jaminan keaslian senyawa kurkumin standar hasil
sintesis
66
Lampiran 2. Data penimbangan bahan
1. Baku kurkumin untuk pembuatan kurva baku
Replikasi Berat (gram)

Arloji kosong Arloji kosong + zat Arloji + sisa Berat zat
1 13,7676 13,7778 13,7778 0,0100
2 13,7680 13,7780 13,7682 0,0098
3 13,7664 13,7766 13,7664 0,0102
2. Baku kurkumin untuk validasi metode
Replikasi Berat (gram)

Arloji kosong Arloji kosong + zat Arloji + sisa Berat zat
1 13,7666 13,7770 13,7668 0,0102
2 13,7680 13,7786 13,7684 0,0102
3 13,7674 13,7778 13,7676 0,0102
3. Baku kurkumin untuk standard addition method
Berat (g)
Arloji kosong 13,7675
Arloji kosong + zat 13,7777
Arloji + sisa 13,7676
Berat zat 0,0101
4. Sampel kapsul lunak OHT merek Rheumakur®
Berat (g)
Arloji kosong 13,7676
Arloji kosong + zat 13,8178
Arloji + sisa 13,7683
Berat zat 0,0495
67
Lampiran 3. Skema pembuatan larutan baku kurkumin dan contoh

perhitungan kadar larutan baku yang digunakan
1. Skema pembuatan larutan baku kurkumin

Timbang kurang lebih seksama 10,0 mg kurkumin
Larutkan dalam metanol pH 4 ad 10,0 ml (sebagai larutan stok)
Pipet 1,0 ml larutan stok, masukkan ke dalam labu takar 10,0 ml dan encerkan
hingga tanda dengan metanol pH 4 (sebagai larutan intermediet)
Pipet larutan intermediet sebanyak 0,1500, 0,2500, 0,3500, 0,4500, 0,5500,

dan 0,6500 ml
Encerkan dengan metanol pH 4 sampai 10,0 ml
Diperoleh seri larutan baku 1,5, 2,5, 3,5, 4,5, 5,5, dan 6,5 ppm
2. Contoh perhitungan kadar larutan baku yang digunakan

Perhitungan seri baku kurkumin (hasil dari penentuan kurva baku ke-3)
Berat baku kurkumin hasil penimbangan = 0,0102 gram = 10,2000 mg
Kadar baku kurkumin dalam larutan stok = 10,2000mg/10,0ml = 1,02 mg/ml
Kadar baku kurkumin dalam larutan intermediet = V1 x C1 = V2 x C2
1,0ml×1,02 mg/ml=10,0mlC2
C2 = 0,102 mg/ml = 102 ppm(sebagai larutan A)
Kadar seri larutan baku kurkumin
volume pemipetan
kadar kurkumin= ×larutan A
volume pengenceran
68
Seri kadar Volume pemipetan (mL) Perhitungan kadar kurkumin (ppm)
1 0,1500 0,1500ml
x 102 ppm = 1,53
10,0ml
2 0,2500 0,2500ml
x 102 ppm = 2,55
10,0ml
3 0,3500 0,3500ml
x 102 ppm = 3,57
10,0ml
4 0,4500 0,4500ml
x 102 ppm = 4,59
10,0ml
5 0,5500 0,5500ml
x 102 ppm = 5,61
10,0ml
6 0,6500 0,6500ml
x 102 ppm = 6,63
10,0ml
Lampiran 4. Optimasi stabilitas larutan baku kurkumin berdasar pH
pH Konsentrasi Panjang Gelombang Serapan Maksimum (nm)

(ppm) Replikasi I Replikasi II Replikasi III
0,4 425 425 432
3 1,0 432 429 429
1,6 432 429 432
0,4 432 432 432
4 1,0 435 435 433
1,6 432 432 432
0,4 432 432 432
5 1,0 435 432 435
1,6 429 429 429
Lampiran 5. Spektra panjang gelombang maksimum kurkumin
1= konsentrasi rendah (0,4 ppm)

2=konsentrasi tengah (1,0 ppm) 3
3=konsentrasi tinggi (1,6 ppm)
2
1
69
Lampiran 6. Kromatogram baku kurkumin untuk kurva baku
1. Larutan blangko
2. Konsentrasi 1,5 ppm

70

71

72
Lampiran 7. Data penentuan kurva baku kurkumin

C (ppm) AUC C (ppm) AUC C (ppm) AUC
1,5 80587 1,47 88101 1,53 99579
2,5 140888 2,45 151483 2,55 154468
3,5 192509 3,43 234079 3,57 227391
4,5 246752 4,41 290285 4,59 285619
5,5 316510 5,39 383911 5,61 350697
6,5 383164 6,37 463126 6,63 413947
A = -12578,6 A = - 31915,6429 A = 1711,5
B = 59828,4 B = 76636,0058 B = 63393
r = 0,9985 r = 0,9980 r = 0,9996
α = 89,99° α = 89,99° α = 89,99°
Keterangan:
C = konsentrasi seri baku kurkumin (ppm)
Dari hasil penentuan kurva baku kurkumin, ketiga persamaan regresi linear yang
diperoleh memiliki nilai α lebih dari 45° sehingga bila dibuat kurva baku
hubungan konsentrasi seri baku kurkumin dengan AUC akan dihasilkan kurva
73
dengan kemiringan kurang baik. Oleh karena itu, dilakukan modifikasi yaitu
konsentrasi baku kurkumin dikalikan 60.000.000 sehingga diperoleh hasil seperti
yang tersaji pada tabel berikut.

C (mg/ml)x6.107 AUC C (mg/ml)x6.107 AUC C (mg/ml)x6.107 AUC
90000 80587 88200 88101 91800 99579
150000 140888 147000 151483 153000 154468
210000 192509 205800 234079 214200 227391
270000 246752 264600 290285 275400 285619
330000 316510 323400 383911 336600 350697
390000 383164 382200 463126 397800 413947
A = -12578,6 A = - 31915,6429 A = 1711,5
B = 0,9971 B = 1,2773 B = 1,0358
R = 0,9985 R = 0,9980 R = 0,9996
α = 44,92° α = 51,94° α = 46,01°
Keterangan:
C = konsentrasi seri baku kurkumin ((mg/ml) x 6.107)
Lampiran 8. Persamaan dan gambar kurva baku kurkumin
1. Persamaan kurva baku kurkumin yang digunakan berasal dari replikasi 3
dengan persamaan sebagai berikut:
y = 63393x – 1711,5
2. Gambar kurva baku kurkumin
450000
Konsentrasi VS AUC
400000
350000
300000 y=1,0358x + 1711,5
AUC
250000
r=0,9996
200000
150000
100000
50000
0
0 100000 200000 300000 400000 500000
Konsentrasi (mg/ml)x60.000.000
74
Lampiran 9. Kromatogram baku kurkumin untuk validasi metode
1. Konsentrasi rendah (1,53 ppm)
a. Replikasi 1
b. Replikasi 2
75
c. Replikasi 3
d. Replikasi 4
76
e. Replikasi 5
2. Konsentrasi tengah (3,57 ppm)
a. Replikasi 1
77
b. Replikasi 2
c. Replikasi 3
78
d. Replikasi 4
e. Replikasi 5
79
3. Konsentrasi tinggi (6,63 ppm)
a. Replikasi 1
b. Replikasi 2
80
c. Replikasi 3
d. Replikasi 4
81
e. Replikasi 5
Lampiran 10. Perolehan nilai AUC untuk validasi metode dan contoh
perhitungan konsentrasi terukur baku kurkumin
1. Nilai AUC baku kurkumin
Konsentrasi AUC
(ppm)
1,5 93267 92423 93312 92094 93614
3,5 197030 197070 199565 198666 199531
6,5 416578 416915 417009 413368 416474
82
2. Contoh perhitungan konsentrasi terukur baku kurkumin
Diperoleh nilai AUC = 93267 dan dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku
y=63393x+1711,5
93267=63393x+1711,5
91555,5=63393x
𝑥 = 1,4442 ppm
Konsentrasi Konsentrasi terukur (ppm)

(ppm)
1,5 1,4442 1,4309 1,4449 1,4257 1,4497
3,5 3,0811 3,0817 3,1211 3,1069 3,1205
6,5 6,5443 6,5498 6,5511 6,4937 6,5427
Konsentrasi Konsentrasi sebenarnya (ppm)

(ppm)
1,5 1,5300 1,4700 1,5000 1,4550 1,5150
3,5 3,5700 3,4300 3,5000 3,3950 3,5350
6,5 6.6300 6,3700 6,5000 6,3050 6,5650
Lampiran 11. Contoh perhitungan persen perolehan kembali (recovery) dan
coefficient of varriation (CV) baku kurkumin
1. Contoh perhitungan persen perolehan kembali (recovery)
konsentrasi terukur
Recovery= ×100%
konsentrasi sebenarnya
Diketahui konsentrasi baku kurkumin terukur sebesar 1,4442 ppm dan konsentrasi
sebenarnya sebesar 1,53 ppm, maka:
1,4442 ppm
Recovery= ×100%
1,53 ppm
𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = 94,3922%
83
Konsentrasi Recovery (%)

(ppm)
1,5 94,3922 97,3401 96,3267 97,9863 95,6898
3,5 86,3053 89,8455 89,1743 91,5140 88,2744
6,5 98,7074 102,8226 100,7862 102,9929 99,6603
2. Contoh perhitungan Coefficient of Variation (CV)
simpangan deviasi (SD)

CV= ×100%
rata-rata (x)
Diketahui konsentrasi terukur rata-rata (x) baku kurkumin konsentrasi rendah
(1,53 ppm) sebesar 1,4391 ppm dengan simpangan deviasi (SD) sebesar 00102,
0,0102
maka: CV= 1,4391 ×100%
CV= 0,7088%
Konsentrasi Konsentrasi rata- Simpangan deviasi Coefficient of

kurkumin rata (x) (SD) Variation (CV)
(ppm)
1,5 1,4391 0,0102 0,7088

3,5 3,1023 0,0199 0,6414
6,5 6,5363 0,0241 0,3687
84
Lampiran 12. Kromatogram sampel dan sampel adisi
1. Sampel
a. Repetisi 1
b. Repetisi 2
85
c. Repetisi 3
d. Repetisi 4
86
e. Repetisi 5
2. Sampel adisi
a. Repetisi 1
87
b. Repetisi 2
c. Repetisi 3
88
d. Repetisi 4
e. Repetisi 5
89
Lampiran 13. Perolehan nilai AUC sampel dan sampel adisi, contoh
perhitungan konsentrasi terukur, perhitungan recovery, dan coefficient of
variation baku kurkumin adisi
1. Nilai AUC sampel dan addisi sampel
Repetisi ke- AUC

Sampel Sampel adisi Baku adisi
1 102146 445691 335653,8
2 114414 450771 340733,8
3 114388 449319 339281,8
4 107880 458516 348478,8
5 111358 458336 348298,8
AUC rata-rata sampel = 110037,2
2. Contoh perhitungan konsentrasi terukur baku kurkumin adisi
Diketahui AUC sampel adisi sebesar 445691 dan AUC sampel rata-rata sebesar
110037,2, maka:
AUC baku kurkumin adisi= AUC sampel adisi – AUC sampel

= 445691 – 110037,2
= 335653,8
y=63393x+1711,5
335653,8= 63393x + 1711,5
333942,3= 63393x
x=5,2678 ppm
3. Contoh perhitungan recovery baku kurkumin adisi
Diketahui konsentrasi terukur baku kurkumin adisi sebesar 5,2678 ppm dan
konsentrasi sebenarnya sebesar 5,35 ppm, maka:
konsentrasi terukur
𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = × 100%
konsentrasi sebenarnya
90
5,2678 ppm
𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = × 100%
5,35 ppm
𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = 98,4635%
4. Contoh perhitungan Coefficient of Variation (CV)

Diketahui konsentrasi terukur rata-rata (x) baku kurkumin adisi sebesar 5,3756
ppm dengan simpangan deviasi (SD) sebesar 0,898, maka:
SD
CV= ×100%
x
0,0898
CV= ×100%
5,3756
Repetisi ke Recovery (%) Konsentrasi rata- Simpangan CV

rata (x) deviasi (SD)
1 98,4635
2 99,9607
3 99,5327 5,3756 0,0898 1,6705
4 102,2448
5 102,1925
5. Hasil recovery dan coefficient of variation dari standard addition method
Repetisi AUC Konsentrasi Recovery

ke- Sampel Baku Adisi terukur baku (%)
kurkumin sampel kurkumin adisi
adisi (ppm)
1 102146 335653,8 445691 5,2678 98,4635
2 114414 340733,8 450771 5,3479 99,9607
3 114388 339281,8 449319 5,3250 99,5327
4 107880 348478,8 458516 5,4701 102,2448
5 111358 348298,8 458336 5,4673 102,1925
AUC rata-rata sampel 110037,2
x 5,3756
SD 0,0898
CV (%) 1,6705
91
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi berjudul “Validasi Metode

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik
Pada Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaan
Kapsul Lunak Obat Herbal Terstandar Merek
Rheumakur®” memiliki nama lengkap Benny
Nugroho. Penulis lahir di Yogyakarta pada tanggal
19 Oktober 1988 sebagai putra kedua pasangan
Nugroho dan Yuliani. Pendidikan formal yang
pernah ditempuh penulis adalah TK Tarakanita
Bumijo (1993-1995), SD Tarakanita Bumijo (1995-2001), SMP Stella Duce I
(2001-2004), SMA Kolese de Britto (2004-2007), kemudian tahun 2007 penulis
melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Selama kuliah penulis aktif dalam berbagai kegiatan baik akademik yaitu juara III
final Kompetisi Karya Tulis Mahasiswa kopertis V Daerah Istimewa Yogyakarta,
dan non akademik, yaitu: anggota Badan Perwakilan Mahasiswa Farmasi (2007-
2008), anggota Ikatan Senat Mahasiswa Farmasi Seluruh Indonesia (2007-2008),
sie humas seminar aksi anti tembakau (2008), panitia Tiga Hari Temu Akrab
Farmasi/Titrasi (2008), ketua pemilihan gubernur Badan Eksekutif Mahasiswa
Farmasi (2008), panitia Kampanye Informasi Obat (2008), panitia sumpahan
Apoteker (2010). Selain itu, penulis juga pernah menjadi asisten dosen pada mata
kuliah praktikum Biofarmasetika, praktikum kromatografi, dan praktikum analisis
kosmetik (2011).

Full

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Full

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Perjalanan Jauh Ribuan Mil

Dimulai Dari Langkah Pertama

Sebuah hasil perjuangan dan semangat...

Sahabat dan almamaterku

Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaan Kapsul Lunak Obat Herbal

mencapai gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Dalam serangkain proses skripsi yang telah dijalani, penulis

menyampaikan ucapan terima kasih kepada:

skripsi dan kuliahnya.

Sanata Dharma Yogyakarta dan sekaligus sebagai dosen pembimbing

menjalani serangkaian proses skripsi.

3. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing atas segala

perhatian, dukungan, sentilan, dan semangat yang terus memotivasi penulis

serta semangat untuk terus maju.

untuk penelitian yang dilakukan oleh penulis.

bantuannya selama peneliti bekerja di laboratorium Kimia Analisis

9. Segenap dosen pengajar, staf kesekretariatan, staf keamanan, dan laboran

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas dukungan dan bantuannya

dalam menyelesaikan skripsi ini.

dan dalam proses penyusunan naskah skripsi atas kebersamaannya di saat

senang dan susah.

berarti dalam proses penyusunan naskah skripsi.

semangat kepada penulis selama proses penyusunan skripsi.

13. Teman-teman seperjuangan penulis selama proses penelitian: Wicak, Siwi,

Sere atas segala canda, dan semangat kepada penulis.

dorongan, dan semangat kepada penulis.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini belumlah sempurna, untuk itu

memberikan manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan. Ad Maiorem Dei

Yogyakarta, Maret 2011

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.......................................... iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA..................................................... vi

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH....................... vii

DAFTAR GAMBAR.................................................................................. xvi

DAFTAR LAMPIRAN............................................................................... xviii

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA........................................................ 6

A. Obat Herbal Terstandar (OHT)................................................ 6

1. Definisi spektrofotometri visibel dan konsep dasar radiasi

2. Tipe transisi elektron........................................................... 11

3. Analisis kualitatif dan kuantitatif spektrofotometri

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)............................. 14

1. Definisi dan tinjauan umum KCKT.................................... 14

2. Variabel-variabel dalam KCKT.......................................... 16

5. Pemisahan puncak dalam kromatografi.............................. 22

6. Analisis kualitatif dan analisis kuantitatif........................... 23

F. Validasi Metode Analisis Instrumental................................... 24

1. Tinjauan umum validasi metode analisis instrumental....... 24

2. Parameter validasi metode analisis instrumental................ 25

BAB III. METODE PENELITIAN............................................................. 31

A. Jenis dan Rancangan Penelitian................................................ 31

F. Tata Cara Penelitian................................................................. 33

1. Pembuatan fase gerak.......................................................... 33

2. Pembuatan pelarut metanol pH 4......................................... 33

3. Pembuatan larutan baku kurkumin...................................... 34

4. Penetapan panjang gelombang (λ) maksimum kurkumin... 34

6. Validasi metode analisis...................................................... 35

BAB IV. PEMBAHASAN......................................................................... 40

A. Pembuatan Fase Gerak KCKT................................................. 40

B. Pembuatan Pelarut dan Stabilitas Kurkumin........................... 41