Full

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
IDENTIFIKASI SENYAWA DALAM FRAKSI IV EKSTRAK
N-HEKSANA DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi
Program Studi Farmasi
Oleh:
Margaretha Efa Putri
NIM : 088114075
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2013
IDENTIFIKASI SENYAWA DALAM FRAKSI IV EKSTRAK
N-HEKSANA DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi
Program Studi Farmasi
Oleh:
Margaretha Efa Putri
NIM : 088114075
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2013
i
“Dalam hal inilah Bapa-Ku dipermuliakan,

yaitu jika kamu berbuah banyak dan dengan
demikian kamu adalah murid-murid-Ku.”
(Yoh. 15: 8)
Karya Kecil ini KupersembahKan untuK:
Guru sejatiku, Yesus, yang senantiasa mengajar, membimbing, dan

menyertai setiap langkahku.
Orang tuaku tercinta, Mama Kanthi dan Papa Tri yang senantiasa
mendoakan, mendukung, dan membimbingku dengan penuh
kesabaran, cinta, dan kasih sayang yang tak ada habisnya.
Serta adik-adikku tersayang, Satrio, Hiro, dan Agung yang terus

memberiku kasih sayang dan semangat.
iii
PRAKATA
Segala pujian dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan karena hanya
dengan berkat dan pertolongan-Nya, penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
penyusunan skripsi yang berjudul ”Identifikasi Senyawa Fraksi IV Ekstrak n-
Heksana Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)”. Skripsi ini
disusun guna memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata
Satu Program Studi Farmasi (S.Farm) pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta.
Selama penelitian hingga penyusunan skripsi ini, penulis banyak
mendapat bantuan dari berbagai pihak berupa bimbingan, pengarahan, saran,
dukungan, maupun sarana. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan
penghargaan dan ucapan terima kasih kepada:
1. Ibu Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. selaku Dosen Pembimbing yang telah
memberikan petunjuk, saran, arahan, dan bimbingan kepada penulis dalam
proses penyusunan skripsi ini,
2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. dan Pak Enade Perdana Istyastono, Ph.D,
Apt. selaku Dosen Penguji skripsi yang telah memberikan saran dan masukan
demi kesempurnaan skripsi ini,
3. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan dan segenap dosen Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta,
4. Bapak-bapak Laboran dan staf laboratorium yang telah membantu dalam
proses penyelesaian skripsi di laboratorium Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta,
vii
5. Bapak Supoyo, selaku laboran di laboratorium Gas Chromatography-Mass
Spectrometer (GC-MS) Fakultas MIPA Universitas Gadjah Mada, yang telah
membantu proses pengerjaan kromatografi gas-spektrometri massa serta
diskusi yang membantu dalam pengerjaan penelitian ini,
6. Semua keluarga yang selalu mendukung dan menyemangati dalam suka dan
duka selama proses pengerjaan skripsi,
7. Wilfrida, teman sekelompok skripsi yang telah membantu dan menemani
selama proses pengerjaan skripsi,
8. Bu Yuli dan beberapa pihak lain yang telah bersedia menyumbangkan banyak
sampel daun binahong,
9. Seluruh teman-teman dari fakultas farmasi USD, khususnya kelas B angkatan
2008 dan FST 2008 yang telah banyak berbagi keceriaan dan kesedihan,
10. Semua teman-teman, yang selalu mendukung, menemani dan menyemangati
11. Serta semua pihak yang telah membantu penyusunan skripsi ini yang tidak
dapat disebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan
dan kelemahan karena keterbatasan kemampuan dan pengalaman penulis. Untuk
itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak.
Akhir kata semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca semua,
serta turut member sumbangan pada perkembangan ilmu pengetahuan.
viii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ........................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.................................... ii
HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN .............................................................. iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................... v
PERNYATAAN PERSTUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ...... vi
PRAKATA .......................................................................................... vii
DAFTAR ISI ....................................................................................... ix
DAFTAR TABEL ............................................................................... xiii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................ xvii
INTISARI ............................................................................................ xviii
ABSTRACT .......................................................................................... xix
BAB I PENGANTAR .......................................................................... 1
A. Latar Belakang Masalah ................................................................. 1
B. Permasalahan ................................................................................. 4
C. Keaslian Penelitian ......................................................................... 5
D. Tujuan Penelitian ........................................................................... 6
E. Manfaat Penelitian ......................................................................... 6
1. Manfaat praktis ........................................................................ 6
ix
2. Manfaat teoretis ........................................................................ 6
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ................................................... 8
A. Tanaman Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) ................ 8
B. Ekstraksi ........................................................................................ 10
C. Metabolit Sekunder pada Tanaman................................................. 11
1. Senyawa Fenolik ...................................................................... 11
2. Alkaloid ................................................................................... 15
3. Terpenoid ................................................................................. 16
D. Kromatografi Kolom ...................................................................... 18
E. Kromatografi Lapis Tipis ............................................................... 22
F. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif ............................................... 24
G. Elusidasi Struktur ........................................................................... 27
1. Kromatografi gas-spektrometri massa....................................... 27
2. Spektrometri ultraviolet-sinar tampak (UV-Vis) ....................... 31
H. Kandungan Binahong ..................................................................... 37
I. Landasan Teori .............................................................................. 39
J. Hipotesis ........................................................................................ 41
BAB III METODE PENELITIAN ....................................................... 42
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...................................................... 42
B. Variabel dan Definisi Operasional .................................................. 42
1. Klasifikasi Variabel .................................................................. 42
2. Definisi Operasional ................................................................. 42
C. Bahan............................................................................................. 43
x
D. Alat ................................................................................................ 43
E. Tata Cara Penelitian ....................................................................... 44
1. Determinasi Tanaman Binahong ............................................... 44
2. Preparasi Sampel ...................................................................... 44
3. Uji pendahuluan ekstrak ........................................................... 45
4. Fraksinasi ekstrak n-heksan daun binahong dengan
kromatografi kolom (KK) ......................................................... 48
5. Isolasi dengan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) ......... 50
6. Elusidasi Struktur ..................................................................... 52
F. Analisis Hasil ................................................................................ 52
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................. 54
A. Determinasi Tanaman ................................................................... 54
B. Preparasi Serbuk Simplisia Daun Binahong ................................... 54
C. Ekstraksi Serbuk Simplisia Daun Binahong ................................... 57
D. Uji Pendahuluan Ekstrak ............................................................... 58
1. Identifikasi flavonoid ............................................................... 58
2. Identifikasi tanin ...................................................................... 60
3. Identifikasi alkaloida ............................................................... 62
4. Identifikasi saponin ................................................................. 65
5. Identifikasi triterpenoid dan steroid ......................................... 66
E. Isolasi dengan Kromatografi Kolom .............................................. 70
1. Optimasi fase gerak KK dengan metode pendekatan KLT ........ 71
2. Proses kromatografi kolom ...................................................... 75
xi
3. Uji kemurnian eluat hasil KK dengan metode KLT ................. 76
F. Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) .......... 80
G. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM) .......................... 83
H. Spektroskopi Ultraviolet-Visibel (UV-Vis) .................................... 100
I. Analisis Hasil ................................................................................. 106
BAB V PENUTUP .............................................................................. 109
A. Kesimpulan .................................................................................... 109
B. Saran .............................................................................................. 109
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................... 110
LAMPIRAN ........................................................................................ 114
BIOGRAFI PENULIS ......................................................................... 147
xii
DAFTAR TABEL
Tabel I. Warna flavonoid dengan sinar tampak dan sinar
ultraviolet ....................................................................... 14
Tabel II. Klasifikasi sinar tampak dengan warna
komplementernya ............................................................ 32
Tabel III. Hasil identifikasi flavonoid dengan KLT ........................ 60
Tabel IV. Hasil identifikasi alkaloid dengan KLT ............................ 65
Tabel V. Hasil KLT identifikasi triterpenoid dan steroid ............... 68
Tabel VI. Hasil uji fitokimia ekstrak n-heksan daun binahong ......... 69
Tabel VII. Kepolaran fase gerak yang digunakan .............................. 72
Tabel VIII. Hasil KLT ekstrak dengan berbagai fase gerak ................ 74
Tabel IX. Hasil KLT eluat dari kromatografi kolom ........................ 77
Tabel X. Hasil identifikasi fraksi IV dengan KLT .......................... 79
Tabel XI. Hasil KLTP .................................................................... 81
Tabel XII. Uji kemurnian isolat ........................................................ 83
Tabel XIII. Hasil Kromatografi Gas-Spektrometri Massa ................... 99
Tabel XIV. Panjang gelombang maksimum isolat dalam spektra
UV-Vis dengan pelarut kloroform.................................... 102
Tabel XV. Spektra UV-Vis beberapa karotenoid dalam pelarut
kloroform ........................................................................ 102
Tabel XVI. Panjang gelombang maksimum isolat dalam spektra
UV-Vis dengan pelarut metanol ....................................... 104
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) .. 8
Gambar 2. Struktur fenol .................................................................. 12
Gambar 3. Kerangka umum senyawa golongan flavonoid ................ 12
Gambar 4. Proses kromatografi kolom ............................................. 19
Gambar 5. Proses kromatografi lapis tipis ........................................ 22
Gambar 6. Skema peralatan spektrofotometer massa ........................ 27
Gambar 7. Skema peralatan kromatografi gas-spektrofotometer
massa .............................................................................. 31
Gambar 8. Transisi elektronik oleh sinar UV-Vis ............................. 33
Gambar 9. Skema peralatan spektrofotometer UV-Vis ..................... 36
Gambar 10. Beberapa senyawa boussingosida dalam daun binahong .. 38
Gambar 11. Hasil uji flavonoid dengan serbuk seng dan magnesium... 59
Gambar 12. Hasil KLT identifikasi flavonoid ..................................... 59
Gambar 13. Hasil reaksi uji identifikasi tanin dengan FeCl3 ............... 60
Gambar 14. Hasil uji identifikasi tanin dengan larutan gelatin ............ 61
Gambar 15. Hasil Uji Identifikasi Alkaloid dengan Wagner LP .......... 62
Gambar 16. Hasil Uji Identifikasi Alkaloid dengan Mayer LP ............ 63
Gambar 17. Hasil Uji Identifikasi Alkaloid dengan Dragendorff LP ... 63
Gambar 18. Hasil KLT identifikasi alkaloid dengan reagen
Dragendorff ..................................................................... 64
Gambar 19. Hasil uji identifikasi saponin ............................................ 66
xiv
Gambar 20. Reaksi steroid dengan reagen Liebermann-Burchard ........ 66
Gambar 21. Hasil uji identifikasi triterpenoid dan steroid .................... 67
Gambar 22. Identifikasi triterpenoid dan steroid dengan KLT ............. 68
Gambar 23. Hasil KLT ekstrak dengan berbagai fase gerak ................ 73
Gambar 24. Kromatografi Kolom Ekstrak n-Heksan Daun Binahong .. 76
Gambar 25. Hasil KLT masing-masing eluat dari kromatografi
kolom .............................................................................. 76
Gambar 26. Hasil uji identifikasi fraksi IV ekstrak n-heksan daun
binahong .......................................................................... 79
Gambar 27. Hasil KLTP ..................................................................... 81
Gambar 28. Isolat pekat dari proses isolasi ......................................... 82
Gambar 29. Uji kemurnian isolat ........................................................ 82
Gambar 30. Kromatogram KG-SM isolat ............................................ 84
Gambar 31. Spektra peak 1 KG-SM isolat........................................... 86
Gambar 32. Struktur Naftalen ............................................................. 87
Gambar 33. Spektra peak 3 KG-SM isolat .......................................... 87
Gambar 34. Fragmentasi 1-alkena ....................................................... 87
Gambar 35. Fragmentasi senyawa 1-pentadekena ............................... 88
Gambar 37. Fragmentasi senyawa 1-oktadekena ................................. 90
Gambar 39. Fragmentasi 4-tetradekanol dengan pemutusan-α dan
tata ulang hidrogen .......................................................... 92
xv
Gambar 40. Spektra peak 10 KG-SM isolat......................................... 93
Gambar 41. Fragmentasi trikosanol dengan pemutusan-α dan tata
ulang hidrogen ................................................................. 94
Gambar 42. Spektra peak 11 KG-SM isolat......................................... 94
Gambar 43. Fragmentasi senyawa siklotetrakosana ............................. 95
Gambar 44. Spektra peak 14 KG-SM isolat ........................................ 96
Gambar 45. Fragmentasi bis-(2-etilheksil) ftalat.................................. 97
Gambar 46. Spektra peak 16 KG-SM isolat ........................................ 98
Gambar 47. Fragmentasi senyawa 1-oktadekana ................................. 99
Gambar 48. Spektra UV-Vis isolat dengan pelarut kloroform.............. 101
Gambar 49. Struktur lutein .................................................................. 103
Gambar 50. Spektra UV-Vis isolat dengan pelarut metanol ................. 104
Gambar 51. Struktur steroid dengan kerangka kolesta-2,4-diena ......... 105
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Determinasi Binahong
(Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) ............................. 114
Lampiran 2. Perhitungan Rendemen Ekstrak .................................... 115
Lampiran 3. Perhitungan Kepolaran Kloroform:Methanol (1:1) ....... 115
Lampiran 4. Contoh Perhitungan Nilai Rf KLT ................................ 115
Lampiran 5. Hasil Kromatografi Gas-Spektrometri massa ................ 116
Lampiran 3. Spektrum UV/Vis ......................................................... 141
Lampiran 4. Perhitungan Panjang Gelombang Maksimum Teoretis
Berdasarkan Teori Fieser-Kuhn .................................... 142
xvii
INTISARI
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui struktur salah satu senyawa

metabolit sekunder dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong (Anredera
cordifolia (Ten.) Steenis). Informasi mengenai struktur senyawa yang terkandung
tanaman ini dapat digunakan untuk mengembangkan obat baru. Senyawa ini dapat
juga berguna dalam proses standardisasi untuk mendapatkan bukti dalam
pengembangan obat tradisional.
Fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong didapatkan melalui proses
pemisahan pada proses kromatografi kolom dengan fase diam silika dan fase
gerak kloroform. Identifikasi senyawa dalam fraksi IV dilakukan dengan uji
fitokimia. Elusidasi struktur senyawa yang terkandung dalam isolat, dilakukan
dengan KG-SM dan Spektrometri UV-Vis. Isolat didapatkan dari pemisahan
fraksi IV dalam proses kromatografi lapis tipis preparatif dengan fase diam silika
dan fase gerak kloroform.
Dari hasil uji fitokimia, didapatkan bahwa fraksi IV mengandung steroid.
Elusidasi struktur menunjukkan bahwa isolat mengandung lutein dan senyawa
steroid dengan kerangka kolesta-2,4-diena, 1-pentadekena, 1-heptadekena, 1-
oktadekena, 4-tetradekanol, trikosil alkohol, dan n-oktadekana.
Kata Kunci: Identifikasi Senyawa, Ekstrak n-Heksana, Daun Binahong,

Anredera cordifolia (Ten.) Steenis
xviii
ABSTRACT
This research was conducted to determine the structure of one of the

secondary metabolites in fourth fraction of n-hexane’s extract of binahong leaf
(Anredera cordifolia (Ten.) Steenis). The information about the structure of
compounds discovered in this plant could be used as a lead in developing new
medicines. The compounds could also be useful in the standardization process in
order to gather evidences in the development of traditional medicine.
The fourth fraction of n-hexane extract was obtained by separation at a
column chromatography process with silica as the stationary phase and
chloroform as the mobile phase. Identification of compounds in the fourth fraction
was conducted by phytochemical screening. Structure elucidation of the
compounds discovered in the isolate was conducted by GC-MS and UV-Vis
spectrometry. Isolate was obtained by the fourth fraction separation in a
preparative thin layer chromatography process with silica as the stationary phase
and chloroform as the mobile phase.
From the phytochemical screening, it was discovered that the fourth
fraction contains steroid. Structure elucidation showed that the isolate contained
lutein and compounds of a steroid with cholesta-2,4-diene skeleton, 1-
pentadecene, 1-heptadecene, 1-octadecene, 4-tetradecanol, tricosyl alcohol, and n-
octadecane.
Keywords: Compounds Identification, n-Hexane Extract, Binahong Leaves,

Anredera cordifolia (Ten.) Steenis
xix
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang Masalah
Dewasa ini, penemuan obat baru tidak lagi dilakukan dengan coba-coba,
melainkan dengan mengembangkan senyawa-senyawa aktif yang telah ada.
Penemuan senyawa obat baru memiliki proses yang relatif lama dan rumit.
Banyak usaha pengembangan obat dilakukan dengan mengeksplorasi senyawa
aktif dari sumber daya alam yang banyak tersedia, misalnya tumbuhan. Senyawa
aktif yang banyak dikembangkan ini merupakan hasil metabolisme sekunder
tanaman. Metabolit sekunder inilah yang banyak bertanggung jawab pada efek
farmakologis pada manusia. Metabolit sekunder tiap tanaman berbeda, sehingga
khasiat tiap-tiap tanaman pun berbeda.
Banyak analisis tumbuhan dipusatkan pada isolasi dan identifikasi
kandungan metabolit sekunder dalam kelompok jenis tumbuhan. Analisis ini
bertujuan untuk menemukan beberapa kandungan yang merupakan senyawa baru
ataupun tidak biasa. Selain itu, tujuan dilakukannya analisis fitokimia adalah
untuk menentukan senyawa aktif penyebab efek racun maupun bermanfaat
(Harborne, 1984).
Daun tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) atau
madeira vine dipercaya dapat mengobati kerusakan ginjal, diabetes,
pembengkakan jantung, muntah darah, tifus, wasir, rematik, pemulihan pasca
operasi, pemulihan pasca melahirkan, menyembuhkan segala luka dalam dan
1
2
khitanan, radang usus, melancarkan dan menormalkan peredaran dan tekanan
darah, sembelit, sesak napas, sariawan berat, pusing-pusing, sakit perut,
menurunkan panas tinggi, menyuburkan kandungan, maag, asam urat, keputihan,
pembengkakan hati, meningkatkan vitalitas dan daya tahan tubuh (Manoi, 2009).
Khasiat yang dipercaya ini, harus dapat dibuktikan melalui suatu penelitian bahwa
kandungan metabolit sekunder di dalam daun binahong dapat memenuhi khasiat
tersebut. Daun binahong menurut hasil penelitian sebelumnya secara kultur in
vitro mengandung flavonoid, alkaloid, terpenoid, dan saponin (Manoi, 2009).
Flavonoid, alkaloid, terpenoid, dan saponin merupakan suatu cara
penggolongan senyawa, dimana masing-masing golongan memiliki banyak
anggota senyawa. Oleh karena itu, dilakukan penelitian ini agar diketahui
kandungan senyawa metabolit sekunder dalam tanaman binahong.
Senyawa yang diteliti pada penelitian ini, dikhususkan pada senyawa-
senyawa metabolit sekunder yang non-polar yang larut dalam pelarut n-heksana
dalam ekstraksi daun tanaman binahong yang digunakan. Senyawa metabolit
sekunder yang non-polar yang kemungkinan besar terekstraksi ke dalam ekstrak
n-heksana daun binahong, terdiri dari golongan triterpenoid dan steroid.
Terpenoid diketahui sangat berguna bagi penyembuhan beberapa
penyakit seperti;
1. glikosida jantung sebagai peningkat kontraksi jantung,
2. saponin-spirostane, sitosterol, dan stigmasterol, untuk pengobatan steroidal
seperti kontrasepsi, anabolik, dan agen antiinflamasi,

3
3. berbagai macam anggota senyawa triterpenoid sebagai sitostatik, insektisida,
agen antiinflamasi, analgesik, dan sebagainya (Bruneton, 1999).
Aktivitas farmakologis dari triterpenoid dan steroid yaitu sebagai agen
antiinflamasi berkaitan erat dengan aktivitas farmakologis daun binahong sebagai
agen penyembuh luka. Sehingga muncul dugaan bahwa aktivitas daun binahong
sebagai penyembuh luka disebabkan oleh kandungan senyawa golongan
triterpenoid dan steroid. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk
mengetahui adanya triterpen dan steroid, dengan menganalisis struktur salah satu
senyawanya.
Analisis struktural dari salah satu senyawa yang terdapat dalam ekstrak
n-heksana daun binahong dilakukan dengan metode elusidasi. Hal ini untuk
memastikan senyawa yang terkandung dalam daun binahong. Penelitian struktur
senyawa ini bermanfaat dalam pengembangan obat dengan menggunakan
senyawa dari tanaman sebagai senyawa penuntun (lead compound) yang
bermanfaat dalam mensintesis senyawa baru yang memiliki efek farmakologis.
Selain itu, informasi struktur senyawa dari tanaman ini berguna untuk
mengembangkan obat tradisional yang semula berdasarkan pada keterangan
empiris, yaitu pengalaman yang diajarkan secara turun-temurun, berubah menjadi
obat tradisional yang memiliki khasiat berdasarkan bukti penelitian (evidence
based), serta sebagai awal dari proses standardisasi obat tradisional.
Bahan dari alam terutama tumbuhan, mengandung sangat banyak
senyawa didalamnya. Oleh karena itu, dalam menganalisis struktur salah satu
senyawa diperlukan proses penghilangan senyawa lain, sehingga jumlah senyawa

4
dalam fraksi yang dianalisis dapat diminimalkan. Untuk itu, perlu dilakukan
beberapa pemisahan yang dilakukan dengan proses kromatografi kolom yang
dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis preparatif.
Dari hasil kromatografi kolom eluat dikelompokkan menjadi 5 fraksi.
Fraksi I telah dianalisis oleh Du’a (2012), yaitu gabungan eluat dengan profil KLT
(kromatografi lapis tipis) dengan Rf 0,86-0,92 pada fase diam silika gel dan fase
gerak kloroform. Fraksi II, III, dan V tidak dianalisis karena berwarna hijau,
sehingga diperkirakan mengandung klorofil. Oleh karena itu, fraksi IV yang
dianalisis dalam penelitian ini.
Untuk menganalisis kandungan dalam fraksi IV, dilakukan isolasi
lanjutan dengan kromatografi lapis tipis, sehingga dapat dihasilkan isolat yang
murni secara KLT. Analisis struktur senyawa kimia dalam isolat tersebut dapat
dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri massa (MS) dan
spektrofotometri Ultraviolet-Visibel (UV-VIS).
B. Permasalahan
Dari latar belakang di atas, maka dapat disimpulkan bahwa permasalahan
yang dijumpai adalah:
1. Golongan senyawa metabolit sekunder apakah yang terkandung dalam fraksi
IV ekstrak n-heksana daun binahong?
2. Bagaimanakah struktur dari senyawa metabolit sekunder yang terkandung di
dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong?

5
C. Keaslian Penelitian
Penelitian yang telah dilakukan terhadap daun binahong lebih banyak
terkonsentrasi pada pengujian efek ekstraknya. Telah dilakukan penelitian
penetapan kadar asam ursolat dalam ekstrak kloroform daun binahong dengan
metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik (Wibisono, 2010). Dalam
penelitian tersebut dinyatakan bahwa dari kromatogram yang didapat, waktu
retensi salat satu peak sama dengan waktu retensi baku asam ursolat. Maka,
penelitian ini tidak sama dengan penelitian yang dilakukan Wibisono (2010).
Penelitian yang telah dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa kimia
dilakukan secara in vitro yang mengidentifikasikan adanya flavonoid, alkaloid,
terpenoid, dan saponin dalam daun Binahong (Manoi, 2009).
Penelitian lain dilakukan untuk mengisolasi senyawa triterpenoid dari
ekstrak metanol, dilakukan oleh Muhammad (2011) dan Saroh, Winarti, dan
Djamil (2012), yang didapatkan senyawa yang mirip dengan boussingosida
(Muhamad, 2011) serta diperkirakan terdapat senyawa adenin. Djamil, Wahyudi,
Wahono, dan Hanafi (2012), berhasil mengisolasi dan mengidentifikasi 8-
glucopyranosyl-4’,5,7,-trihydroxyflavone dari ekstrak methanol daun binahong.
Ketiga penelitian ini berbeda dengan penelitian yang dilakukan, dimana
identifikasi akan dilakukan pada ekstrak n-heksana daun Binahong. Karena
polaritas metanol dan n-heksana sangat berbeda, maka diperkirakan kandungan
senyawa dalam kedua ekstrak tersebut berbeda.
Penelitian terbaru dilakukan oleh Facrhiyah dan Kusrini (2012) yang
melakukan isolasi, identifikasi, dan uji sitotoksik senyawa steroid dari daun
6
binahong. Dalam penelitian ini, digunakan ekstrak n-heksana dengan isolasi
dengan metode kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis preparatif. Isolat
yang didapatkan dianalisis strukturnya dan didapatkan senyawa stigmasterol.
Penelitian ini berbeda dengan penelitian ini mengingat bahwa di dalam ekstrak n-
heksana masih terdapat banyak senyawa lain yang tidak teridentifikasi oleh
Facrhiyah dan Kusrini (2012).
D. Tujuan Penelitian
Tujuan dilakukan penelitian ini adalah untuk mengetahui golongan
senyawa serta untuk mengetahui struktur dari salah satu senyawa metabolit
sekunder yang terkandung dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong.
E. Manfaat Penelitian
1. Manfaat praktis
Manfaat dilakukannya penelitian ini adalah untuk mendapatkan informasi
mengenai salah satu kandungan senyawa dari daun tanaman binahong.
2. Manfaat teoretis
Manfaat teoretis dilakukannya penelitian ini adalah untuk
mengembangkan senyawa obat baru dengan memodifikasi struktur (sebagai lead
compound). Selain itu, serta sebagai awal dalam proses standardisasi obat
tradisional dan pengembangan obat tradisional yang berdasarkan pada bukti
penelitian (evidence based). Obat tradisional yang berdasarkan penelitian
maksudnya adalah dapat membuktikan khasiat, melalui kandungan kimia dalam

7
daun binahong. Standardisasi obat tradisional meliputi profil farmakologis
tanaman dan kadar zat berkhasiat dalam tanaman. Penelitian ini merupakan awal
dari standarisasi dimana, sebelum menetapkan profil farmakologis dan kadar zat
berkhasiat, diperlukan suatu analisis kandungan kimia tanaman itu sendiri.

BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Tanaman Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)
Gambar 1. Tanaman binahong
Tanaman binahong atau Anredera cordifolia (Ten.) Steenis, menurut
Wagner et al (cit. Starr, Starr, and Loope, 2003) masuk dalam family Basellaceae dan
genus Anredera yang terdiri dari 5-10 spesies dari Amerika bagian tropis. Anredera
cordifolia (Ten.) Steenis memiliki sinonim Bossingaultia cordifolia Ten.:
Boussingaultia gracilis Miers: serta Boussingaultia pseudobasselloides Haum. Nama
umum yang sering digunakan yaitu: Madeira vine, mignonette vine, lamb’s tail, serta
Anredera.
8
Tanaman binahong merupakan tanaman sepanjang tahun, tanaman
merambat, menutup semak atau tanah. Batang ramping, melilit, dan tanpa bulu
hingga sekitar 30 meter panjangnya, awalnya berwarna hijau kemerahan dan berupa
herba (berbatang basah), kemudian menjadi coklat, mengelupas dan menjadi berkayu
dan mencapai diameter 2–3 cm. Madeira vine menghasilkan umbi berdaging pada
kedua akar (rimpang dengan diameter sekitar 20 cm) dan pada buku-buku batangnya.
Umbi pada batang ini seperti kutil kecil yang tidak teratur berwarna cokelat terang
atau hijau dan variasi ukuran dengan diameter 5 mm-25 cm, sering membawa
sejumlah tunas pada ketiak daun. Daun subsessile atau hampir duduk pada batang,
berbentuk jantung atau dengan tangkai daun hingga 1–12 cm (dan jarang di atas 15
cm) panjangnya, secara luas berbentuk bulat telur, kadang berbentuk lanset, maupun
berbentuk jantung, berdaging hingga berair tergantung pada paparan; ujung daun
tumpul. Helaian daun berwarna hijau terang, hijau gelap pada permukaan atas,
mengkilap, terasa basah ketika disentuh, 1–15 cm panjangnya dan 0.8–11 cm
lebarnya (Smith, Lawson, Turnbull, dan Downey, 2007).
Bracteola atas rata dengan bunga, bulat hingga elips, bunga tandan tidak
bercabang atau bercabang 2-4 dengan malai tipis, panjang 4-25 cm; bractea lebih
rendah dari tangkai bunga, gigih; tangkai bunga 1,5-2 mm; bracteola terendah
berwarna putih kehijauan, sedikit lebih pendek dari perianth (kelopak dan mahkota
bunga), perianth berwarna putih, tingginya 5,5-8 mm, cuping bulat telur-lonjong,
tumpul; tangkai sari dan tangkai putik berwarna putih. Berasal dari daerah tropis di
10
Amerika Selatan, di Jawa dibudidayakan pada ketinggian rendah (Backer dan Van
den Brink, 1965).
Daun tanaman binahong atau madeira vine dipercaya dapat mengobati
kerusakan ginjal, diabetes, pembengkakan jantung, muntah darah, tifus, wasir,
rematik, pemulihan pasca operasi, pemulihan pasca melahirkan, menyembuhkan
segala luka dalam dan khitanan, radang usus, melancarkan dan menormalkan
peredaran dan tekanan darah, sembelit, sesak napas, sariawan berat, pusing-pusing,
sakit perut, menurunkan panas tinggi, menyuburkan kandungan, maag, asam urat,
keputihan, pembengkakan hati, meningkatkan vitalitas dan daya tahan tubuh (Manoi,
2009).
B. Ekstraksi
Ekstraksi merupakan penarikan zat utama yang diinginkan dari bahan
mentah obat dengan menggunakan pelarut yang dapat melarutkan zat yang diinginkan
tersebut (Ansel, 2005). Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI (1995)
dalam farmakope IV menyatakan bahwa : “Ekstrak adalah sediaan pekat yang
diperoleh dengan mengekstrasi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani
menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut
diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga
memenuhi baku yang ditetapkan”.
Pemilihan pelarut penting untuk menentukan senyawa metabolit eksoseluler
atau endoseluler yang dapat terekstraksi. Pada sampel kering, pelarut dengan polaritas
11
rendah sebagian besar hanya mengekstraksi metabolit eksoseluler saja. Tetapi pada
pelarut alkoholik dapat memecah membran sel dan mengekstraksi sebagian besar
material endoseluler (Colegate dan Molyneux, 1993).
Telah diketahui sebelumnya bahwa senyawa organik hanya dapat cenderung
larut dalam pelarut organik daripada larut dalam air, serta garam anorganik hanya
dapat larut dalam air. Hanya senyawa organik yang memiliki gugus polar seperti
hidroksil, sulfonat, nitrat dan gugus hidrofilik lainnya yang memiliki kemungkinan
yang cukup tinggi untuk larut dalam air (Basset, Denney, Jeffery, Mendham, 1994).
C. Metabolit Sekunder pada Tanaman
1. Senyawa fenolik
Senyawa fenolik merupakan suatu senyawa yang setidaknya memiliki satu
gugus aromatis yang terikat setidaknya satu gugus hidroksil, bebas, ataupun terikat
dengan gugus yang lain. Beberapa fenol dapat dilihat secara kasat mata, atau dapat
dilihat dibawah sinar UV ataupun dengan reaksi warna. Senyawa fenolik biasanya
berada dalam ekstrak etanolik suatu tumbuhan (Bruneton, 1999). Cara klasik untuk
mendeteksi senyawa fenol sederhana ialah dengan menambahkan larutan besi (III)
klorida 1 % dalam air atau etanol kepada larutan cuplikan, yang menimbulkan warna
hijau, merah, ungu, biru, atau hitam yang kuat (Harborne, 1984).
12
OH
Gambar 2. Struktur fenol
Secara umum, fenol larut dalam pelarut organik polar, larut di natrium
hidroksida, dan larutan karbonat. Asam fenolat larut dengan bikarbonat dan dapat
diekstraksi dengan pelarut organik dengan kondisi sedikit asam. Glikosida dari
komponen fenolik, umumnya larut di air. Semua senyawa fenolik tidak stabil. Semua
fenol dapat dengan segera teroksidasi khususnya pada kondisi basa (Bruneton, 1999).
a. Flavonoid. Flavonoid hampir selalu larut dalam air. Flavonoid adalah
senyawa yang bertanggung jawab pada pembentukkan warna pada tanaman.
Flavonoid yang tidak berwarna berkontribusi pada warna tanaman sebagai
kopigment: sebagai contoh kopigmen flavon dan flavonol yang tidak berwarna
melindungi antosianin. Dalam beberapa kasus, molekul menyerap daerah spektrum
dekat UV, yang berfungsi sebagai atraktan pada beberapa jenis serangga (Bruneton,
1999). .
O
Gambar 3. Kerangka umum senyawa golongan flavonoid (Bruneton, 1999).
13
Secara umum glikosida larut di air dan alkohol, hanya beberapa senyawa
yang sukar larut dalam air (rutin dan hesperidin). Aglikonnya kebanyakan larut di
pelarut nonpolar, ketika terdapat setidaknya satu gugus fenolik bebas, yang larut
dalam larutan alkali hidroksida (Bruneton, 1999).
Flavonoid lipofil dari jaringan “superficial leaf” secara langsung terekstrasi
dengan pelarut dengan polaritas medium (seperti diklormetan); kemudian harus
dipisahkan dari lilin dan lemak yang diekstraksi secara berkelanjutan (dapat dicuci
heksana) (Bruneton, 1999). .
Glikosida dapat terekstraksi, sering pada suhu tinggi dengan aseton atau
alkohol (etanol, metanol) yang dicampur dengan air (20 – 50 %). Petroleum eter
dengan ekstraksi cair-cair dapat menghilangkan klorofil dan lipid. Dietil eter akan
mengekstrak aglikon bebas, dan etil asetat dapat melarutkan sebagian besar glikosida.
Sakarida bebas tertinggal dalam fase air dengan glikosida yang sangat polar sedikit
terikut didalamnya (Bruneton, 1999).
Ada beberapa reaksi warna untuk mengidentifikasi flavonoid dalam bentuk
glikosida maupun aglikonnya.
i. Reaksi Cyanidin, dengan serbuk magnesium (untuk flavanon dan dihidroflavanol)
atau dengan zink, dengan adanya asam hidroklorida.
ii. Dengan dilihat dibawah sinar UV sebelumnya dan disemprot dengan ammonium
klorida dan setelah diuapi ammonia (perubahan warna maupun fluorosent yang
terjadi menunjukan tipe flavonoid) (Bruneton, 1999).

14
Tabel I. Warna flavonoid dengan sinar tampak dan sinar ultraviolet (Harborne,
1984)
Warna dengan UV
Warna Petunjuk
Sendiri Dengan amonia
Jingga
Jingga redup, merah Antosianidin-3-
Merah Biru
atau merah muda glikosida
Merah muda
Jingga Fluoresensi merah, Kebanyakan
Merah kuning, atau merah Biru Antosianidin-3-
Merah muda jambu glikosida
6-hidroksi flavonol
Coklat tua atau
dan flavon; beberapa
Coklat tua atau hitam
khalkon glikosida
hitam
Kuning redup Merah tua atau
Kebanyakan kalkon
jingga redup
Kuning redup atau Jingga redup atau
Auron
hijau kuning merah
Kuning redup atau Kebanyakan
Kuning pucat Coklat tua
coklat kuning glikosida flavonol
Kuning cerah-hijau, Kebanyakan
coklat tua glikosida flavon,
biflavonil.
Kebanyakan
Tak berwarna Merah tua Coklat pudar isoflavon dan
flavanonol
5-deoksiisoflavon
Biru lemah Biru kuat dan 7,8-dihidrokdi
flavanon
Flavanon dan
Kuning pucat atau
Merah tua flavanonol 7-
hijau kuning
glikosida
b. Tanin. Tanin merupakan bahan polimer dari tumbuhan yang merupakan
senyawa polifenol. Secara kimia terdapat 2 jenis tanin, yaitu tanin terkondensasi
(seperti protosianidin) dan tanin yang terhidrolisiskan (seperti asam galat dan asam
elagat). Penentuan struktur kimia tanin sukar dilakukan karena tingkat kerumitan
yang cukup tinggi (Harborne, 1984).

15
Dalam pengujiannya, tanin direaksikan dengan FeCl3 dan larutan gelatin.
Perubahan warna menjadi hijau kehitaman pada reaksi dengan FeCl3 menunjukkan
adanya tanin terhidrolisa, jika menjadi hijau kecoklatan menunjukkan adanya tanin
terkondensasi. Jika terbentuk endapan dengan larutan gelatin maka larutan uji positif
mengandung tanin (Levita, Musfiroh, Mustarichie, 2011).
2. Alkaloid
Penemu alkaloid, W. Meisner memperkenalkan senyawa alam yang bereaksi
seperti basa. Pada awalnya alkaloid didefinisikan sebagai senyawa yang mengandung
nitrogen. Karena berasal dari alam dan distribusinya yang terbatas, alkaloid memiliki
struktur yang kompleks (Bruneton, 1999).
Alkaloid memiliki range berat molekul dari 100 hingga 900. Dimana
kebanyakan basa tidak mengandung atom oksigen dalam bentuk cair, sedangkan yang
mengandung atom oksigen terdapat dalam bentuk kristal padat. Hampir semua kristal
basa memiliki rotasi optis, dan memiliki titik leleh yang tajam, tanpa terdekomposisi,
pada suhu dibawah 200°C. Secara umum alkaloid tidak larut atau sukar larut dalam
air, larut dalam nonpolar atau hanya sedikit yang larut dalam pelarut organik polar,
dan larut pada larutan asam hidroalkoholik encer (Bruneton, 1999).
Karakter umum alkaloid dalam tanaman berada dalam bentuk garam dengan
asam mineral (hidroklorit, sulfat, nitrat) atau asam organik (tartrat, sulfamat, maleat).
Garam alkaloid secara umum larut di air dan larutan alkohol, dan tidak larut dalam
pelarut organik (Bruneton, 1999).

16
Metode deteksi yang paling umum digunakan adalah dengan reaksi
pengendapan dengan menggunakan reagen umum untuk alakaloid. Reaksi
pengendapan dengan membentuk kombinasi alkaloid dengan metal dan metalloid:
bismuth, merkuri, tungsten, dan iodine. Dalam prakteknya, reagen yang biasa
digunakan adalah larutan yang mengandung iodine dan iodide, atau larutan yang
mengandung kalium iodide dan merkuri klorida (reagen Mayer), atau reagen yang
mengandung bismuth nitrat dan kalium iodide (reagen Dragendorff). Untuk pereaksi
semprot alkaloid pada KLT, digunakan reagen Dragendorff, larutan iodine-iodida,
kalium iodoplatinat, cerium dan ammonium sulfat (Bruneton, 1999).
3. Terpenoid
Triterpenoid dan steroid terbentuk dari beberapa jumlah 5 atom karbon pada
2-metilbutadiena (unit isoprena). Terpenoid di alam terbagi menjadi beberapa
golongan yaitu; monoterpen (minyak esensial, oleoresin, dan iridoid), monoterpen
ireguler (pyrethrins), sesquiterpen (minyak esensial dan sesquiterpen lakton),
diterpen, triterpen dan steroid (saponin, glikosida jantung, fitosterol, dan triterpen
termodifikasi), karotenoid, serta poliisopren) (Bruneton, 1999).
Cara umum deteksi ialah dengan menyemprot dengan KMnO4 0,2 % dalam
air, antimoni klorida dalam kloroform, H2SO4 pekat atau vanillin-H2SO4. Setelah
disemprot, pelat dipanaskan pada 100-105°C sampai pembentukan warna sempurna
(Harborne, 1984).
17
a. Triterpen dan steroid. Terdiri dari 30 atom karbon, yang berasal dari
siklisasi epoksi-3S-2,3-epoksi-2,3-dihidro-squalena. Steroid, seperti fitosterol,
saponin, ekdisteroid, glikosida jantung, dan steroidal alkamin memiliki kerangka
struktur yang sama. Glikosida jantung dapat meningkatkan kontraksi jantung, likorisa
sebagai pemanis rendah kalori, serta triterpen sebagai sitostatik, insektisida,
antiinflamasi, analgesik, dan sebagainya (Bruneton, 1999).
Uji yang banyak digunakan adalah reaksi Liebermann-Burchard (anhidrida
asetat-H2SO4 pekat) dengan kebanyakan triterpena dan sterol memberikan warna
hijau biru. Pereaksi Liebermann-Burchard telah disesuaikan untuk KLT. Pelat
disemprot dengan campuran H2SO4 pekat 1 mL, anhidrida asetat 20 mL, dan
kloroform 50 mL lalu dipanaskan 85°-95°C selama 15 menit. Untuk mendeteksi
steroid digunakan H2SO4 50 % lalu dipanaskan akan menghasilkan warna merah, dan
dengan UV berfluoresensi hijau (Harborne, 1984).
b. Saponin. Saponin merupakan senyawa glikosida, yang memiliki
karakteristik sebagai surfaktan. Secara structural, saponin dibagi menjadi 2, yaitu
steroidal saponin dan triterpenoid saponin (Araliaceae, Caryophyllaceae,
Cucurbitaceae, Fabales, Primulaceae, Ranunculaceae, Rosaceae, dan Sapindaceae)
(Bruneton, 1999).
Saponin larut di air atau menggunakan alkohol ataupun larutan
hidroalkoholik setelah partisi penghilangan lemak oleh petroleum eter. Pemisahan
saponin dengan kromatografi (kromatografi kolom terbuka, HPLC, KLT, maupun
flash chromatography). Saponin berfungsi sebagai hemolitik. Saponin dapat sebagai

18
agen antiinflamasi, mengobati batuk, dermatologi, serta sebagai adaptogen (Bruneton,
1999). Uji saponin yang sederhana ialah dengan mengocok ekstrak dengan air. Bila
terbentuk busa yang tahan lama pada permukaan cairan (Harborne, 1984).
c. Karotenoid. Merupakan tetraterpenoid dengan delapan unit isoprena,
memiliki karakteristik kromofor yang menyebabkan warna kuning atau oranye yang
sangat mudah teroksidasi, serta larut didalam lipid dalam tumbuhan. Banyak terdapat
pada daun, bunga, akar (wortel), dan biji (jagung). Misalnya β-karoten yang
merupakan pro-vitamin A. Karotenoid juga dapat melawan penyakit degeneratif, serta
sebagai pewarna alami (Bruneton, 1999).
Spektrum karotenoid sangat khas antara 400-500 nm, dua puncak utama
disekitar 450 nm dan biasanya ada dua puncak tambahan pada kedua sisi puncak
utama (Harborne, 1984).
D. Kromatografi Kolom
Kromatografi merupakan proses pemisahan campuran dimana analit-analit
dalam sampel terdistribusi dalam fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa
bahan padat atau porus dalam bentuk molekul kecil, atau dalam bentuk cairan yang
dilapiskan pada pendukung padat. Fase gerak dapat berupa gas maupun cairan.
(Rohman, 2009).
19
Gambar 4. Proses kromatografi kolom (Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991)
Menurut Székely (cit., Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995)
kombinasi proses isolasi untuk senyawa lipofil dapat dilakukan dengan; partisi cair-
cair dan kromatografi cair, kromatografi cair dan kromatografi padat (misalnya
kombinasi kolom terbuka dengan KLT preparatif menggunakan silika gel), ataupun
kombinasi kromatografi cair. Kromatografi kolom terbuka biasa dipakai secara luas
karena sederhana.
Kromatografi cair yang dilakukan di dalam kolom besar merupakan metode
terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar (lebih dari 1 g). Pada
kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada
bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau
bahkan tabung plastik. Fase gerak dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran
yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa akan
bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan dikumpulkan
berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom (Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991).
20
Ukuran partikel fase diam untuk kolom biasanya lebih besar daripada untuk
KLT. Untuk kolom yang dijalankan dengan gaya tarik bumi biasanya 63-250 µm.
sedangkan kolom yang dijalankan dengan tekanan mengandung partikel fase diam
dengan ukuran 40-63 µm. Silika gel (SiO2) atau asam silikat merupakan fase diam
yang paling banyak digunakan karena dapat dipakai dengan semua pelarut (Gritter,
Bobbit, dan Schwarting, 1991).
Fase diam dapat dikemas ke dalam tabung dengan cara basah maupun
kering. Umumnya cara basah lebih mudah dan lebih sering dipakai untuk silika gel.
Sedangkan cara kering lebih baik untuk alumina. Pada cara basah, fase diam
dimasukkan ke dalam kolom, dan tabung diisi sepertiganya dengan pelarut. Pelarut
yang dipakai pada proses pengemasan ini mungkin sama dengan fase gerak atau
pelarut lain yang kepolarannya lebih rendah. Fase diam dibuat suspensi dengan
pelarut, dan suspensi ini dituangkan ke dalam pelarut yang ada di tabung. Selama
proses pengendapan, tabung dapat diketuk-ketuk pada semua sisi secara perlahan agar
dapat diperoleh lapisan yang seragam (Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991)
Pendekatan untuk memilih fase gerak ada tiga. Pertama dengan penelusuran
pustaka, karena sebagian besar senyawa pada kimia analitik, biokimia, dan kimia obat
diketahui dan pernah dikromatografi. Ketika senyawa belum diketahui atau senyawa
yang tidak biasa, maka dapat dicari informasi mengenai senyawa yang ukuran serupa
dan memiliki gugus fungsi yang sama. Kedua adalah hubungan dengan KLT. Karena
KLT membutuhkan waktu yang singkat dengan menggunakan pelarut (fase gerak)
yang sesedikit mungkin, maka agak mudah untuk dapat menentukan kondisi untuk
21
pemisahan memakai kolom. Ketiga adalah dengan pemakai elusi landaian umum
mulai dari pelarut yang tidak menggerakan sampel sampai pelarut yang lebih polar
yang menggerakan sampel (Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991).
Sampel dilarutkan dalam sedikit pelarut, ditambahkan ke bagian atas kolom
dan dibiarkan mengalir ke bagian atas fase diam. Kemudian kromatogram
dikembangkan. Pada pengembangan ini, sampel yang berupa campuran akan terpisah.
(Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991)
Kecepatan migrasi tiap senyawa melalui fase diam ditentukan oleh
perbandingan distribusinya (D) yang ditentukan oleh afinitas relatif senyawa itu pada
kedua fase. Nilai D (koefisien distribusi) didefinisikan sebagai perbandingan
konsentrasi senyawa dalam fase diam dibanding dengan konsentrasi senyawa tersebut
dalam fase gerak. Semakin besar nilai D, maka migrasi senyawa semakin lambat, dan
semakin kecil nilai D, migrasinya akan semakin cepat. Semakin besar perbedaan
distribusi antar senyawa, maka campuran akan semakin mudah terpisah. (Rohman,
2009).
Secara umum pemantauan senyawa yang telah dipisahkan dilakukan dengan
membagi eluat menjadi beberapa fraksi. Fraksi dianalisis dengan menggunakan KLT
maupun KCKT sehingga hasilnya dapat digunakan sebagai petunjuk fraksi mana
yang harus digabung untuk mengisolasi produk. Sedangkan untuk isolasi produk,
fraksi kolom yang telah digabungkan atau mengandung senyawa yang sama, fase
geraknya diuapkan dengan tekanan rendah (Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991).
22
E. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan fisikokimia. Dimana
campuran yang akan dipisahkan ditotolkan berupa bercak atau pita. Pemisahan terjadi
dalam bejana tertutup rapat yang berisi fase gerak, dan pemisahan terjadi selama
perambatan kapiler (Stahl, 1985). KLT merupakan salah satu metode kromatografi
yang paling sederhana yang dapat memisahkan senyawa yang amat berbeda seperti
senyawa organik alam dan senyawa organik sintetik, kompleks anorganik, dan
bahkan ion anorganik, dapat dilakukan dalam waktu yang singkat dengan biaya yang
cukup rendah (Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991).
Bila KLT dibandingkan dengan kromatografi kertas, KLT memiliki
kelebihan yaitu keserbagunaan, kecepatan, dan kepekaannya. Keserbagunaan
disebabkan banyaknya jenis fase diam yang dapat digunakan (selulosa atau silika gel,
dan sebagainya). Kecepatan KLT yang lebih besar karena sifat penyerap yang lebih
padat dan merupakan keuntungan untuk menelaah senyawa yang kurang stabil.
Kepekaan KLT karena jumlah yang diperlukan hanya berjumlah dalam µg (Harborne,
1984).
Gambar 5. Proses kromatografi lapis tipis (Gritter, Bobbit, dan

Schwarting, 1991)
23
KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai
metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua, dipakai
untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam
kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritter, Bobbit, dan
Schwarting, 1991).
Lapisan buatan sendiri mempunyai beberapa kekurangan dan biasanya
memerlukan peralatan tertentu untuk membuatnya (Gritter, Bobbit, dan Schwarting,
1991). Untuk membuat pelat KLT, terlebih dahulu pelat kaca dibersihkan dengan
aseton untuk membersihkan lemak. Kemudian bubur silika harus di kocok kuat dalam
waktu yang cukup (90 detik) sebelum penyaputan. Setelah itu, pelat dikeringkan pada
suhu kamar, lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 100-110°C selama 30 menit
(Harborne, 1984)
Umumnya jumlah sampel yang ditotolkan sekitar 50-100 µg setiap bercak
untuk kromatografi adsorbsi. Untuk meningkatkan konsentrasi sampel pada bercak,
dapat dilakukan penotolan berulang (Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991).
Pada pengembangan lapisan KLT, terdapat 3 gerakan pelarut. Pertama
pelarut bergerak ke atas melalui lapisan. Kedua, uap pelarut akan terjerap oleh lapisan
di atas garis depan gerakan pertama pelarut. Ketiga, penguapan pelarut dibawah garis
depan pada lapisan. Sehingga untuk meminimalkan banyaknya gerakan pelarut, maka
dibutuhkan penjenuhan bejana. Penjenuhan bejana dapat dilakukan dengan melapisi
dinding bejana dengan kertas saring. Kertas harus dibasahkan dengan pelarut, dan
bejana yang tertutup harus dibiarkan sebentar sebelum lapisan fase diam diletakkan di
24
dalam bejana (Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991). Biasanya KLT dilakukan
dengan pengembangan naik dalam suatu bejana yang dindingnya dilapisi dengan
kertas saring sehingga bejana jenuh dengan pengembang yang digunakan (Harborne,
1984)
Pemisahan pada kromatografi planar (misalnya kromatografi lapis tipis)
pada umumnya akan dihentikan sebelum semua fase gerak melewati seluruh
permukaan fase diam. Analit dicirikan dengan faktor retardasi (Rf) atau jarak migrasi
analit terhadap jarak ujung fase geraknya. (Rohman, 2009)

Rf = (Rohman, 2009)………………………..(1)

Cara penampakan bercak yang tidak merusak dapat digunakan untuk KLT
preparatif dan kuantitatif. Cara khas merupakan cara yang umumnya digunakan
dengan menyemprot pelat dengan pereaksi yang akan menimbulkan warna jika
bereaksi dengan bercak cuplikan. Ada dua segi penting mengenai penggunaan
pereaksi semprot. Segi pertama ialah mengenai informasi gugus fungsi yang dapat
diperoleh. Serta segi kedua yaitu mengenai derajat warna yang kecil yang terjadi jika
pereaksi semprot ini dipakai (Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991).
F. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)
Salah satu metode pemisahan yang memerlukan biaya paling murah dan
menggunakan peralatan yang paling sederhana adalah kromatografi lapis tipis
preparatif (KLTP) (Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995). KLTP adalah

25
cara yang ideal untuk pemisahan cuplikan kecil (50 mg sampai 1 g) dari senyawa
yang kurang atsiri. Pada KLTP, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa
garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus
pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita
ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tidak berwarna, dan
fase diam, yang mengandung pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan
diekstraksi dari fase diam dengan pelarut polar (Gritter, Bobbit, dan Schwarting,
1991).
Fase diam yang paling umum digunakan adalah silika gel dan dipakai untuk
pemisahan campuran senyawa lipofil maupun hidrofil. Seperti biasa, silika gel lebih
banyak digunakan daripada fase diam lain. Ketebalan optimum untuk lapisan
preparatif sekitar 1-1,5 mm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran pelat akan
mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLTP. Pada umumnya,
suspensi yang dipakai untuk mencetak lapisan preparatif agak lebih kental daripada
yang dipakai untuk lapisan tipis. Lapisan harus dibiarkan mengering selama beberapa
jam pada suhu kamar sebelum diaktifkan. Ini akan mencegah peretakan dan
pengerasan pada bagian luar. Pengaktifan dilakukan pada suhu 100°C, sekurang-
kurangnya selama 1 jam (Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991).
Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat
KLTP. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah menguap, karena jika pelarut
kurang mudah menguap maka dapat terjadi pelebaran pita. Pemilihan pelarut
ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai KLT analitik. Karena

26
ukuran partikel penyerap sama, maka pelarut yang dipakai pada KLT analitik dapat
dipakai langsung pada KLTP (Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995).
Pelarut yang memiliki titik didih di antara 50-90°C cocok untuk pelarut cuplikan.
Pada penotolan dilakukan penyebaran larutan cuplikan yang volumenya agak besar
(sampai 2 ml) berbentuk pita seragam tipis (lebar 1 sampai 5 mm) tanpa mengganggu
permukaan lapisan secara berlebihan (Gritter, Bobbit, dan Schwarting, 1991).
Pengembangan pelat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang
dapat menampung beberapa pelat sekaligus. Bejana dijaga tetap jenuh dengan pelarut
pengembang dengan bantuan sehelai kertas saring yang tercelup di dalam
pengembang. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara pengembangan
berulang. Jika pemisahan secara KLTP telah dicapai, pelat dikeringkan kemudian
dimasukkan lagi ke dalam bejana (Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995).
Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari pelat dengan spatula
atau pengerok berbentuk tabung yang disambungkan dengan pengumpul vakum.
Senyawa harus diekstraksi dari penyerap dengan pelarut yang paling kurang polar
yang mungkin (sekitar 5 ml untuk 1 g penyerap). Semakin lama senyawa kontak
dengan penyerap, semakin besar kemungkinana penguraian. Ekstrak disaring melalui
kaca berpori 4 dan kemudian melalui membrane 0,2-0,45 µm. Kemudian pelarut
diuapkan dan komponen diisolasi (Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995).

27
G. Elusidasi Struktur
Setelah suatu senyawa tanaman terisolasi, struktur senyawa kemudian
dielusidasi struktur dan dikarakterisasi. Identitas struktural senyawa ditetapkan
dengan berbagai metode fisikokimia termasuk inframerah (IR), ultraviolet-Vis, 1H
dan 13C resonansi magnetik inti (NMR), dan spektrometri massa (MS), serta berbagai
sifat fisika dan data kromatografis seperti titik leleh, analisis element, data kelarutan,
parameter kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi, analisis
thermogravimetri, serta analisis DSC (differential scanning calorimetry) (Ho, Chi-
Tang, Shahidi, dan Fereidoon, 2000).
1. Kromatografi gas-spektrometri massa
Penggunaan spektrometer massa berkembang karena banyak senyawa
organic dapat diionisasi pada keadaan uap dan dicatat berat molekul senyawa dengan
mengukur perbandingan massa terhadap muatan (m/e). Kedua ion molekul dapat
diputus-putus lagi atau difragmentasi dalam fragmentasi yang lebih kecil yang dapat
berguna untuk penentuan struktur molekul (Kosela, 2010).
Gambar 6. Skema peralatan spektrometer massa (MS) (Sitorus, 2009)

28
Peralatan terdiri dari sebuah ruangan pemboman yang diisi sampel dalam
bentuk uap. Ruangan dihampakan agar tekanan uapnya rendah sehingga sampel padat
dan cairan mudah menguap. Selanjutnya ion molekuler (M) dan ion-ion anak
(pecahan) yang bermuatan positif yang terbentuk akan dipercepat oleh akselerator
oleh suatu muatan negatif yang terdapat pada ujung lainnya. Selanjutnya ion yang
melalui celah (slits) dilewatkan melalui medan magnet dan dibelokkan sesuai dengan
kecepatan yang tergantung pada perbandungan massa dan muatan menuju detektor.
Selanjutnya rekorder akan mencatat hasil berupa gambar antara limpahan relatif (LR)
atau relative abundance (RA) lawan m/e yang dikenal sebagai spektra massa (Sitorus,
2009)
Dalam spektrometer ini, sampel diubah dalam bentuk gas dan dengan
elektron berenergi cukup untuk mengalahkan potensial ionisasi pertama senyawa
tersebut. Tabrakan antara sebuah molekul organik dan salah satu elektron berenergi
tinggi menyebabkan lepasnya sebuah elektron dari molekul tersebut dan terbentuknya
suatu ion organik. Ion organik yang dihasilkan oleh penembakan berenergi tinggi
tersebut tidak stabil dan pecah menjadi fragmen yang lebih kecil, baik berbentuk
radikal bebas maupun ion-ion lain (Supratman, 2010).
Sampel dimasukkan, diuapkan dan diumpankan dalam suatu aliran yang
berkesinambungan dengan kamar pengionan yang dijaga tetap dalam keadaan tetap
vakum untuk meminimalkan tabrakan dan reaksi antara radikal, molekul udara, dan
lain-lain. Sampel melewati suatu aliran elektron berenergi tinggi yang menyebabkan
29
ionisasi beberapa molekul sampel menjadi ion-ion molekul, yang dapat mengalami
fragmentasi dan penataan ulang (Supratman, 2010).
Radikal ion dan partikel yang terbentuk diumpankan melewati dua elektroda,
lempeng pemercepat ion, yang memercepat partikel bermuatan positif. Dari sini,
partikel bermuatan positif menuju ke tabung analisator, dimana partikel ini dibelokan
oleh medan magnet sehingga lintasannya melengkung (Supratman, 2010).
Pada kuat medan dan tegangan listrik (voltase) yang sama, partikel dengan
m/e tinggi akan memiliki jari-jari yang besar. Sehingga, ketika voltase pemercepat
dikurangi perlahan dan kontinyu, maka kecepatan semua partikel akan berkurang, dan
jari-jari lintasan pun berkurang. Maka, partikel akan mengenai detektor dimulai
dengan m/e yang rendah (Supratman, 2010).
Elektron dalam orbital berenergi tertinggi (elektron yang paling longgar)
adalah elektron yang pertama kali akan lepas. Jika molekul memiliki elektron n (lone
pair electrons), maka salah satunya akan dilepaskan, jika tidak ada maka akan
dilepaskan sebuah elektron phi (π), jika tidak ada keduanya, maka ion molekul akan
terbentuk dengan lepasnya sebuah elektron sigma (σ) (Supratman, 2010).
Setelah ionisasi awal, ion molekul akan mengalami fragmentasi, suatu proses
dimana radikal bebas atau molekul netral kecil dilepaskan dari ion molekul. Ion
molekul tidak pecah secara acak, tetapi cenderung membentuk fragmen-fragmen
sestabil mungkin (Supratman, 2010).
Spektrum massa adalah alur kelimpahan (abundance) jumlah relatif fragmen
yang bermuatan positif berlainan versus massa per muatan (m/e) dari fragmen-
30
fragmen tersebut. Muatan ion dari kebanyakan partikel yang dideteksi adalah +1;
maka nilai m/e sama dengan massa molekulnya (M). bagaimana suatu molekul atau
ion pecah menjadi fragmen-fragmen kecil tergantung dari kerangka karbon dan gugus
fungsional yang ada. Oleh karena itu, struktur dari massa fragmen dapat memberikan
petunjuk mengenai struktur molekul induknya serta menentukan bobot molekulnya
(Supratman, 2010).
Spektrum massa dipaparkan sebagai grafik batangan. Setiap puncak dalam
spektrum menyatakan suatu fragmen molekul sehingga puncak ditata menurut
kenaikan m/e dari kiri ke kanan. Intensitas puncak sebanding dengan kelimpahan
relatif fragmen-fragmen bergantung pada stabilitas relatifnya. Puncak tertinggi dalam
spektrum disebut puncak dasar (base peak), diberi intensitas sebesar 100 %
(Supratman, 2010).
Ion limpahan yang paling tinggi yang disebut dengan puncak dasar (based
peak) menggambarkan fragmen yang paling stabil untuk molekul tersebut. Intensitas
fragmen yang lain relatif terhadap puncak dasar yang berarti stabilitasnya juga adalah
relatif (Sitorus, 2009).
Pada saat ini banyak alat spektrometer massa digabungkan dengan
kromatografi gas, sehingga setiap peak dari kromatogram dapat diukur berat molekul
serta bentuk framentasinya. Selain itu ratusan ribu senyawa organik sudah didata
dalam komputer, dan hasil pengukurannya dapat dibandingkan derajat kemiripannya.
Bila derajat kemiripannya lebih dari 90 % maka senyawa tersebut dapat dikatakan
sama atau identik (Kosela, 2010).

31
Kromatografi gas adalah suatu cara untuk memisahkan senyawa atsiri
dengan meneruskan arus gas melalui fase diam. Pada kromatografi gas, komponen
yang akan dipisahkan dibawa oleh gas melalui kolom. Campuran akan terbagi di
antara gas pembawa dan fase diam. Fase diam akan menahan komponen secara
selektif berdasarkan koefisien distribusinya sehingga terbentuk sejumlah pita yang
berlainan pada gas pembawa. Pita komponen ini keluar dari kolom bersama aliran gas
pembawa dan dicatat sebagai fungsi waktu. Detektor menunjukan adanya komponen
dalam eluen dan mengukur kuantitasnya (McNair dan Bonelli, 1988).
Gambar 7. Skema peralatan kromatografi gas-spektrofotometer massa (Sitorus,

2009)
2. Spektrometri ultraviolet-sinar tampak (UV-VIS)
Spekstroskopi adalah alat analisis yang menggunakan radiasi sebagai sumber
energi. Sinar atau radiasi adalah merupakan gelombang yang mempunyai energi
berbanding terbalik dengan panjang gelombang. Selain sinar atau radiasi, elektron
juga dapat digunakan sebagai sumber energi pada spektroskopi (Sitorus, 2009).
32
Elusidasi struktur sangat penting untuk senyawa organik Karena adanya
fenomena isomeri yaitu senyawa yang memiliki rumus molekul sama tetapi memiliki
struktur yang berbeda (Sitorus, 2009).
Bila energi atau sinar berinteraksi dengan molekul organik maka yang
dipengaruhi adalah ikatannya. Pada hakekatnya terdapat 3 jenis ikatan yaitu, ikatan
sigma (σ), ikatan pi (π), dan pasangan elektron bebas (n), dimana kekuatan ketiga
ikatan tersebut adalah sebagai berikut (Sitorus, 2009).
σ > π > n (Sitorus, 2009)………………………………………………..(2)
Tabel II. Klasifikasi sinar tampak dengan warna komplementernya

(Sitorus, 2009)
Panjang gelombang
Warna Warna Komplementer
(nm)
400-435 Violet /ungu /lembayung Hijau kekuningan
435-480 Biru Kuning
480-490 Biru kehijauan Jingga
490-500 Hijau kebiruan Merah
500-560 Hijau Ungu kebiruan
560-580 Hijau kekuningan Ungu
580-610 Jingga Biru kehijauan
610-680 Merah Hijau kebiruan
680-800 Ungu kemerah-merahan Hijau
Molekul menyerap energi dalam ultraviolet dan spektrum sinar tampak
tergantung pada daerah elektronik dari molekul. Energi serapan menghasilkan elevasi
elektron dari orbital dasar ke orbital lebih energi lebih tinggi di kedudukan tereksitasi.
Spektrofotometer ultraviolet akan memberikan informasi yang berguna pada sistem
terkonjugasi (Sitorus, 2009).

33
Energi yang diserap dalam daerah UV menghasilkan transisi elektron valensi
dalam molekul. Transisi ini terjadi karena elektron tereksitasi dari orbital molekul ke
energi orbital yang lebih tinggi (antibonding). Perpindahan dari ikatan orbital π ke
antibonding orbital π* dinyatakan sebagai π → π* (Kosela, 2010).
Baik radiasi UV maupun tampak berenergi lebih tinggi daripada radiasi
inframerah. Absorpsi cahaya ultraviolet dan tampak mengakibatkan transisi
elektronik, yaitu promosi elektron-elektron dari orbital keadaan dasar, highest
occupied molecular orbital (HOMO) berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi
berenergi lebih tinggi lowest unoccupied molecular orbital (LUMO). Transisi ini
menyerap energi yang selanjutnya terbuang sebagai kalor, cahaya, atau tersalurkan
dalam reaksi kimia (Supratman, 2010).
Gambar 8.Transisi elektronik oleh sinar UV-Vis (Sitorus, 2009)

Kromofor adalah gugus tak jenuh kovalen (σ) yang menyebabkan serapan
elektronik. Auksokrom adalah gugus jenuh yang bila terikat pada suatu kromofor
akan mempengaruhi panjang gelombang (λ) dan intensitas serapan maksimum
(Kosela, 2010).
34
Auksokrom adalah suatu gugus jenuh dengan elektron sunyi yang tidak
menyerap pada daerah ultraviolet-tampak tetapi jika terikat pada kromofor akan
mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan kromofor (gugus fungsi yang
mengalami transisi n→σ*) (Supratman, 2010).
Spektrum UV-Vis terdiri dari pita absorpsi lebar pada daerah panjang
gelombang yang lebar. Ini disebabkan oleh terbaginya keadaan dasar dan keadaan
eksistensi sebuah molekul dalam subtingkat-subtingkat rotasi dan vibrasi. Transisi
elektronik dapat terjadi dari subtingkat apa saja dari keadaan dasar ke subtingkat
keadaan apa saja dari keadaan eksitasi. Karena berbagai transisi ini berbeda energi
lebih sedikit dan menimbulkan pita lebar yang muncul dalam spektrum itu
(Supratman, 2010).
Spektrum ultraviolet dan visibel biasanya sangat encer, dan pelarut yang
digunakan harus tidak memberikan serapan pada panjang gelombang dimana
dilakukan pengukuran dan transparan terhadap sel silika (Supratman, 2010).
Panjang gelombang untuk transisi elektronik adalah spesifik yang dikenal
sebagai λmaks yaitu panjang gelombang yang memberikan absorbansi maksimum dan
merupakan dasar dari analisa kualitatif yang dapat ditentukan secara eksperimen
dengan membuat kurva antara A lawan λ (Sitorus, 2009).
Spektroskopi UV-Vis diperuntukkan untuk analisis senyawa dengan gugus
kromofor diena dan poliena serta enon terkonjugasi. Bila konjugasi ikatan rangkap
makin panjang maka akan menuju senyawa berwarna sehingga sinar yang digunakan
untuk spektroskopi adalah sinar tampak (Visible) (Sitorus, 2009).

35
a. Sistem butadien aturan Woodward. Panjang gelombang maksimum (λ)
sistem butadien (C=C-C=C) dimana butadien dibagi dalam dua katagori yaitu s-trans
butadien dan s-cis butadien. Dalam perhitungan Woodward harga induk (parent
value) di singkat HI untuk system s-trans butadien (heteroanular) sebesar 214 nm,
tapi harga induk s-cis-butadien (homoanular) sebesar 253 nm. Pengertian eksosiklik
yang disingkat dengan ES adalah ikatan rangkap diluar cincin dan setiap eksosiklik,
penambahannya 5 nm (Kosela, 2010).
b. Sistem butadien aturan Fieser-Kuhn. Aturan Woodward hanya berlaku
untuk sistem butadien dan perpanjangan paling banyak dua ikatan rangkap
terkonjugasi. Untuk ikatan rangkat lebih dari empat digunakan aturan Fieser Kuhn
dengan rumus sebagai berikut:
max( ) = 114 + 5 + (48,0 − 1,7 ) − 16,5 − 10 …….(3)
max( ) = (1,74 × 10 ) .........................................................................(4)
Dimana:
M = jumlah substituent alkil atau yang menyerupai alkil pada sistem
konjugasi
N = jumlah dari ikatan rangkap terkonjugasi
Rendo = jumlah ikatan rangkap dalam cincin pada sistem konjugasi
Rexo = jumlah ikatan rangkap di luar cincin pada sistem konjugasi
(Kosela, 2010)
36
Gambar 9. Skema peralatan spektrofotometer UV-Vis (Sitorus, 2009)
a. Sumber radiasi. Secara umum radiasi yang dihasilkan oleh material
bersumber listrik. Tegangan listrik akan menyebabkan eksitasi elektron pada benda
dan waktu elektron kembali ke tingkat energi yang lebih rendah akan menghasilkan
radiasi berupa emisi sejumlah energi tertentu yang merupakan sumber radiasi.
Sumber radiasi UV digunakan lampu hidrogen ataupun deuterium, sedangkan sumber
radiasi sinar tampak menggunakan lampu filamen tungsten (Sitorus, 2009)
b. Monokromator. Radiasi dari sumber radiasi adalah sinar polikromatis
(banyak panjang gelombang). Monokromator yang berupa bahan optik berbentuk
prisma ini, berfungsi untuk menguraikan sinar tersebut menjadi monokromatis sesuai
yang diinginkan (Sitorus, 2009)
c. Sel (tempat) sampel. Biasanya tempat sampel dikenal dengan istilah
kuvet. Syarat bahan yang dapat dijadikan kuvet adalah tidak menyerap sinar yang
37
dilewatkan sebagai sumber radiasi dan tidak bereaksi dengan sampel maupun pelarut
(Sitorus, 2009).
d. Detektor. Detektor berfungsi untuk mengubah tenaga radiasi menjadi
arus listrik atau peubah panas lainnya dan biasanya terintegrasi dengan pencatat
(Sitorus, 2009).
H. Kandungan Binahong
Daun binahong menurut hasil penelitian sebelumnya secara kultur in vitro
mengandung flavonoid, alkaloid, terpenoid, dan saponin (Manoi, 2009). Penelitian
Rachmawati (2007) mendapatkan bahwa terdapat saponin triterpenoid, flavonoid, dan
minyak atsiri dalam ekstrak n-heksana daun binahong, sedangkan Khunaifi (2010)
mendapatkan bahwa daun binahong mengandung flavonoid, alkaloid, polifenol.
Selain itu, daun binahong mengandung saponin treterpenoid dan saponin steroidal
(Astuti, 2011). Sedangkan Barboza, Cantero, Nunez, Pacciaroni, dan Espinar (2010)
menyatakan bahwa keseluruhan bagian tanaman binahong kering mengandung
steroid.
Muhammad (2011) mendapatkan senyawa yang mirip dengan
boussingosida, Saroh, Winarti, dan Djamil (2012) memperkirakan terdapat senyawa
adenine, Facrhiyah dan Kusrini (2012) menemukan senyawa stigmasterol, serta Titis,
Facriyah, dan Kusrini (2013) menemukan senyawa alkaloid betanidin pada daun
binahong.
38
Yang, Lin, dan Kuo (2008) menyebutkan bahwa terdapat flavonoid yaitu
kuersetin dalam daun binahong sebesar 0,6 mg/100gram daun. Tsai, Huang, Wu, dan
Lee (2005) mendapatkan kandungan oksalat dengan kadar 231,3 mg/100g daun segar
binahong. Djamil, Wahyudi, Wahono, dan Hanafi (2012), berhasil mengisolasi dan
mengidentifikasi 8-glucopyranosyl-4’,5,7,-trihydroxyflavone dari ekstrak methanol
daun binahong. Li (2006) menyatakan bahwa daun Boussingaultia gracilis Miers var
pseudobaselloides yang merupakan nama lain dari tanaman binahong, mengandung
isoproterenol. Narender, Khaliq, dan Madhur (2011) menemukan senyawa-senyawa
yang memiliki aktivitas antidiabetik dalam ekstrak methanol daun Boussingaultia
baselloides, yaitu beberapa senyawa bossingosida (gambar 10).
H
H
O
COOH
C
O OH
HOOC HO
O
HOOC O
HO
O HO
HO
HO O O
OH
OH
OH OH
O H
C O
OH
C
O OH
HOOC
O
HO
HO HOH2C O
HO O
HO
OH CH2OH
HO O O
OH CH2OH
OH OH
C
OH
OH
HOOC O
O
HO
O O
OH OH
OH
Gambar 10. Beberapa senyawa boussingosida dalam daun binahong (Narender,

Khaliq, dan Madhur, 2011)
39
I. Landasan Teori
Tanaman Binahong merupakan tanaman yang digunakan masyarakat untuk
mengobati atau mencegah berbagai penyakit. Karena itu, perlu dilakukan identifikasi
kandungan kimia dalam tanaman binahong sehingga dapat mengembangkan tanaman
binahong menjadi suatu bahan obat dengan bentuk sediaan tertentu.
Untuk mengidentifikasi senyawa dalam daun binahong, dapat dilakukan
dengan metode metabolomika. Pertama, dilakukan pengumpulan sampel daun, yang
diteruskan dengan ekstraksi. Pada ekstrak dilakukan pemisahan dan pemurnian,
sebelum dideteksi, identifikasi, dan dikuantifikasi dengan kromatografi gas-
spektrometri massa atau kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)-spektrometri massa
(SM), serta dengan metode spektrometri lain, seperti spektrometri UV-Vis,
spektrometri inframerah, dan sebagainya. Data yang dapatkan dikombinasikan untuk
didapatkan struktur senyawa-senyawa metabolitnya (Vinayavekhin dan Saghatelian,
2010).
Langkah lain dalam identifikasi kimia adalah proses isolasi senyawa, dimana
dilakukan proses ekstraksi, yaitu penyarian senyawa dari bahan, lalu dilakukan
pemisahan senyawa atau proses isolasi dengan proses kromatografi. Proses ini lebih
sederhana dan lebih mudah dilakukan, karena pada proses metabolomika harus
diperhatikan adanya kandungan senyawa dalan tanaman yang bisa mengganggu.
Misalnya, harus dilakukan terlebih dahulu pigmen (klorofil dan karotenoid) agar
sampel dapat dianalisis dengan KCKT-SM, serta perlu adanya proses optimasi
40
KCKT-SM agar hasil yang didapatkan lebih optimal (Vinayavekhin dan Saghatelian,
2010).
Ekstraksi dilakukan untuk menyari senyawa metabolit dalam tanaman ke
dalam pelarut yang sesuai. Di dalam ekstrak, senyawa yang tersari bukan merupakan
senyawa tunggal melainkan suatu campuran sehingga diperlukan pemisahan senyawa
dengan kromatografi. Székely (cit., Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995)
menyatakan bahwa salah satu cara isolasi dengan kromatografi adalah dengan
kombinasi kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis preparatif. Penggunaan
kombinasi ini dirasa sangat efisien karena kromatogafi kolom yang dapat digunakan
dalam jumlah sampel yang cukup besar, kemudian dilanjutkan kromatografi lapis
tipis yang memiliki daya pisah yang lebih baik.
Identifikasi kimia secara modern dilakukan dengan elusidasi struktur.
Elusidasi struktur dapat dilakukan dengan cara spektrometri massa dan spektrometri
ultraviolet-visibel (UV-Vis). Spektra massa akan menunjukkan berat molekul
senyawa serta pola fragmentasi senyawa tersebut yang dapat mengacu pada struktur
senyawa yang dianalisis. Sedangkan spektra UV-Vis menunjukkan keberadaan
kromofor dan auksokrom dengan mengetahui panjang gelombang maksimum dari
senyawa. Sehingga dapat diketahui struktur senyawa dari isolat yang dianalisis.
Menurut penelitian yang telah dilakukan secara in vitro, daun binahong
mengandung senyawa-senyawa golongan flavonoid, alkaloid, terpenoid, dan saponin.
Menurut Basset, Denney, Jeffery, dan Mendham (1994) kelarutan senyawa dalam
larutan berdasarkan pada banyaknya gugus polar yang terkandung dalam senyawa
41
organik, semakin banyak gugus polar maka semakin larut dalam pelarut polar seperti
air. Begitu pula sebaliknya, pelarut non-polar akan lebih sulit untuk melarutkan
senyawa-senyawa polar. Sehingga dapat dilihat bahwa senyawa fenolik (flavonoid
dan tanin) dan alkaloid larut dalam pelarut polar, karena memiliki gugus hidroksil,
sehingga memiliki kemungkinan yang kecil untuk tersari dalam pelarut n-heksana
(non-polar) yang digunakan dalam ekstraksi simplisia daun binahong. Sedangkan
terpenoid (triterpenoid, steroid, saponin, dan karotenoid) yang larut lipid dalam sel
tumbuhan dapat larut dalam pelarut n-heksana.
J. Hipotesis
Oleh karena itu, dapat dibuat hipotesis bahwa struktur senyawa metabolit
sekunder yang terkandung dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong
merupakan turunan golongan triterpenoid, steroid, saponin, dan karotenoid. Elusidasi
struktur senyawa golongan tersebut akan dapat dilakukan dengan spektrometri massa,
spektrometri ultraviolet-sinar tampak (UV-Vis), spektrometri inframerah (IR), dan
spektrometri resonansi magnetik inti hidrogen (RMI-H).

BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian non-eksperimental dengan
rancangan penelitian bersifat deskriptif analitik.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Klasifikasi Variabel
a. Variabel bebas: ekstrak n-heksana daun binahong.
b. Variabel tergantung: senyawa metabolit sekunder yang terkandung
dalam ekstrak n-heksana daun binahong.
2. Definisi Operasional
a. Ekstrak yang dianalisis dalam penelitian ini adalah ekstrak n-heksana
daun binahong dibuat dengan proses maserasi serbuk daun binahong dengan n-
heksana sebanyak tiga kali.
b. Fraksi merupakan gabungan eluat hasil pemisahan ekstrak n-heksana
daun binahong dengan kromatografi kolom yang memiliki profil KLT yang sama,
dengan fase diam silika gel dan fase gerak kloroform. Masing-masing fraksi diberi
nomor, dan fraksi IV merupakan fraksi dengan nomor empat.
c. Senyawa yang dielusidasi struktur adalah senyawa metabolit sekunder
yang terkandung dalam isolat yang didapatkan dari isolasi fraksi IV ekstrak n-
heksana daun binahong dengan kromatografi lapis tipis preparatif.
42
43
C. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman
binahong, air mengalir, akuades, n-heksana, Wagner LP, Mayer LP, Dagendorff
LP, HCL 2N, amonia pekat P, eter P, kloroform, natrium sulfat anhidrat P, asam
asetat anhidrat P, Molish LP, asam sulfat P, metanol P, Baljet LP, Kadde LP,
kalium hidroksida 1N, asam klorida pekat P, xantidrol P 0,01 % b/v dalam asam
asetat P, asam asetat P, besi (III) klorida 0,3 M, asam sulfat 2 N, benzena P,
natrium, hidroksida 2 N, serbuk seng P, asam klorida 2 N, asam klorida pekat P,
etanol (95 %) P, serbuk magnesium P, FeCl3 1 %, gelatin, asam klorida 2 N,
pereaksi Liebermann-Burchard, silika gel for column chromatography, silika gel
GF 254, kloroform p.a., dan metanol p.a.
D. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik,
oven, blender, pengayak nomor 40, shaker, erlenmeyer, kertas saring, pompa
vakum, labu hisap, sendok plastik, vakum rotary evaporator, labu alas bulat,
batang pengaduk, tabung reaksi, cawan arloji, cawan porselin, pipet ukur, pipet
tetes, penangas air, bunsen, kolom kromatografi 1,8 x 30 cm, flakon, stopwatch,
corong pisah, pipa kapiler, plat kaca 5 x 15 cm, plat kaca 20 x 20 cm, chamber
KLT, TLC Plate Coater, spatula, penyemprot KLT, spatula, UV cabinet,
desikator, millipore ukuran pori 0,45 µm, ultrasonikator, seperangkat alat
spektrometer UV-Vis, dan seperangkat alat kromatografi gas-spektrometer
massa,.
44
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi Tanaman Binahong
Determinasi tanaman binahong dilakukan dengan membandingkan
tanaman binahong yang akan digunakan dalam penelitian dengan keterangan pada
Flora of Java (Backer dan Van den Brink, 1965). Kemudian tanaman binahong
dibuat herbariumnya dalam bentuk kering meliputi akar, batang, daun, bunga, dan
rimpang.
2. Preparasi Sampel
a. Pemilihan sampel. Sampel yang dipilih adalah daun tanaman binahong
yang segar dan tidak berpenyakit (tidak dijangkiti oleh infeksi virus, bakteria atau
jamur). Pada saat mengumpulkan sampel, harus dipastikan bahwa daun tepisah
dari pencemar lain seperti tangkai binahong, atau bahan lain selain daun binahong.
Daun binahong yang dikumpulkan berasal dari daerah Yogyakarta. Daun
dikumpulkan pada pagi hari dan diambil dengan cara dipetik daun kelima dari
pucuk ke bawah. Daun yang diambil adalah daun dewasa yang berukuran panjang
5-10 cm, dengan warna daun hijau tua, serta daun yang utuh dan tidak berlekuk-
lekuk.
b. Pengeringan sampel. Daun segar tanaman binahong dibersihkan
sampai bersih dengan air mengalir dan dipisahkan dari pengotor lain (debu, tanah,
tangkai daun, batang, dan rimpang). Daun yang telah dicuci ditiriskan dan
dikeringanginkan untuk menghilangkan air sisa pencucian. Daun segar
dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 40-60⁰C. Simplisia dalam

45
bentuk daun kering kemudian diserbuk dengan blender dan diayak dengan
pengayak nomor 40.
c. Ekstraksi sampel. Serbuk daun binahong, dibagi dalam beberapa
Erlenmeyer bertutup dimana masing-masingnya berisi 25,0 gram serbuk daun
binahong, dimaserasi dengan 250 mL n-heksana selama 3 jam. Ekstrak hasil
maserasi kemudian disaring menggunakan kertas saring dengan bantuan pompa
vakum. Terhadap bagian residu diekstraksi kembali dengan n-heksana dan
dilakukan sebanyak dua kali. Filtrat yang didapatkan dari tiap ekstraksi dicampur
dan dievaporasi dengan rotary evaporator pada suhu 40⁰C sampai terbentuk
ekstrak kental.
3. Uji Pendahuluan Ekstrak
a. Identifikasi flavonoid. Terdapat tiga cara dalam mengidentifikasi
flavonoid dalam ekstrak yaitu:
i. 1 mL ekstrak diuapkan hingga kering, kemudian dilarutkan dalam 1
mL sampai 2 mL etanol (95%) P; tambahkan 0,5 mg serbuk seng P dan 2 mL
asam klorida 2 N, diamkan selama 1 menit. tambahkan 10 tetes asam klorida
pekat P; jika dalam waktu 2 sampai 5 menit terjadi warna merah intensif,
menunjukan adanya flavonoid (glikosida 3-flavonol).
ii. 1 mL ekstrak diuapkan hingga kering, kemudian dilarutkan dalam 1
mL etanol (95%) P, tambahkan 0,1 g serbuk magnesium P, jika terjadi warna
merah jingga sampai merah ungu, menunjukan adanya flavonoid. jika terjadi
warna kuning jingga, menunjukan adanya flavon, kalkon, dan auron.

46
iii. ekstrak ditotolkan pada plat KLT yang telah dibuat. Kemudian plat
dikembangkan dengan pelarut kloroform di dalam chamber KLT yang telah
dijenuhkan. Penjenuhan dilakukan sebelumnya dengan pelarut kloroform. Setelah
pelarut mencapai atas pengembangan, plat dikeluarkan dan dikeringkan.
Kemudian plat disemprot dengan amonia.
b. Identifikasi tanin. Ada dua uji identifikasi adanya senyawa tanin yaitu:
i. uji dengan FeCl3: Ekstrak ditambahkan dengan 2-3 tetes larutan FeCl3
1 %, kemudian digojok kuat dan didiamkan hingga larutan memisah. Jika larutan
menghasilkan warna hijau kehitaman atau biru tinta pada lapisan bawah, maka
bahan tersebut mengandung tanin.
ii. uji dengan larutan gelatin: Ekstrak dimasukkan dalam tabung reaksi
ditambah dengan larutan gelatin, kemudian digojok kuat dan didiamkan hingga
larutan memisah. Jika terbentuk endapan putih pada lapisan bawah, menunjukkan
adanya tanin dalam larutan uji.
c. Identifikasi alkaloida
i. reaksi pengendapan: Ekstrak sebanyak 25 mL ditambahkan 1 mL HCl
2 N dan 9 mL air, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, dinginkan dan
saring.
Larutan percobaan untuk pengendapan alkaloid dibagi menjadi 2
golongan sebagai berikut :
a) Larutan percobaan yang direaksikan dengan Wagner LP (alkaloid
membentuk senyawa kompleks bebas, kemudian membentuk endapan).

47
b) Larutan percobaan direaksikan dengan mayer LP dan dragendorff LP
(alkaloida akan membentuk senyawa adisi yang tidak larut).
ii.pengujian dengan KLT: Ekstrak ditotolkan pada plat KLT yang telah
dibuat. Kemudian plat dikembangkan dengan pelarut kloroform di dalam chamber
KLT yang telah dijenuhkan. Penjenuhan dilakukan sebelumnya dengan pelarut
kloroform. Setelah pelarut mencapai atas pengembangan, plat dikeluarkan dan
dikeringkan. Kemudian plat disemprot dengan reagen Dragendroff dan H2SO4.
d. Identifikasi saponin. Ekstrak sebanyak 1 mL dimasukkan dalam
tabung reaksi ditambah 10 mL air sambil dikocok kuat selama 1 menit, apabila
menimbulkan busa ditambahkan 2 tetes HCl 1 N, bila busa yang terbentuk bisa
tetap stabil maka ekstrak positif mengandung saponin.
e. Identifikasi triterpenoid dan steroid
i. Ekstrak dimasukkan dalam tabung reaksi, dilarutkan dalam 0,5 mL
kloroform lalu dipanaskan dan didinginkan. Diambil 1 mL dan dimasukkan dalam
tabung reaksi lalu diteteskan pereaksi Lieberman-burchard. Jika hasil yang
diperoleh berupa cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut
menunjukkan adanya triterpenoid, sedangkan jika terbentuk warna hijau kebiruan
menunjukkan adanya steroid.
ii. Ekstrak ditotolkan pada plat KLT yang telah dibuat. Kemudian plat
dikembangkan dengan pelarut kloroform di dalam chamber KLT yang telah
dijenuhkan. Penjenuhan dilakukan sebelumnya dengan pelarut kloroform. Setelah
pelarut mencapai atas pengembangan, plat dikeluarkan dan dikeringkan.

48
Kemudian plat disemprot dengan reagen Liebermann Burchard dan H2SO4-
metanol (1:1).
4. Fraksinasi Ekstrak N-Heksana Daun Binahong dengan Kromatografi
Kolom (KK)
Untuk mengisolasi dari ekstrak dengan menggunakan metode
kromatografi kolom (KK), maka perlu dilakukan optimasi fase gerak dengan
menggunakan KLT terlebih dahulu.
a. Optimasi fase gerak dengan kromatografi lapis tipis (KLT)
Untuk membuat plat KLT, sebanyak 7 g adsorben (silika gel) yang akan
digunakan untuk pelapis dibuat bubur dengan 21 mL pelarut (aquadest). Bubur
yang telah ada kemudian diratakan pada plat kaca dengan ukuran 5 x 15cm
dengan menggunakan alat TLC Plate Coater, dengan ketebalan 0,25 mm. Setelah
adsorben pada plat kaca rata, plat lapis tipis yang terbentuk dikeringkan dalam
oven pada suhu 100 – 120oC selama paling kurang satu jam.
Ekstrak kental n-heksana daun binahong ditotolkan pada plat KLT yang
telah dibuat. Plat kemudian dielusikan dengan menggunakan 5 larutan
pengembang berupa asetonitril, n-heksana, kloroform, kloroform:metanol (1:1),
dan metanol.
Dari hasil elusi dilihat fase gerak mana yang menghasilkan pemisahan
terbaik. Fase gerak yang memberikan pemisahan terbaik kemudian digunakan
sebagai fase gerak pada kromatografi kolom.

49
b. Kromatografi kolom
Pada proses KK, preparasi kolom dilakukan dengan membuat suspensi
silica gel G dalam kloroform kemudian dimasukan kedalam kolom dengan tinggi
silica gel adalam 20 cm pada kolom 1,8 x 30 cm. penuangan suspensi silika
dilakukan dengan hati-hati dan meminimalisir timbulnya gelembung udara
maupun aliran turbulen, serta dijaga agar silika dalam kolom tidak kering dengan
menjaga aliran eluen yang kontinyu. Untuk itu, pada bagian atas kolom
dihubungkan dengan corong pisah yang berisi eluen (kloroform).
Sebanyak 0,5 mL ekstrak dimasukan ke dalam kolom, lalu eluen
dialirkan secara kontinyu ke dalam kolom, sehingga ekstrak yang berupa
campuran dapat terpisah menjadi beberapa bagian. Eluat yang keluar ditampung
setiap 3 menit.
c. Analisis Kualitatif eluat dengan KLT
Masing-masing eluat ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan ke dalam
chamber yang telah dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase gerak kloroform,
kloroform : metanol (1:1), dan metanol.
Isolat dinyatakan murni apabila hanya terdapat satu bercak. Jika terdapat
lebih dari satu bercak, proses kormatografi lapis tipis dapat dilakukan pada eluat
yang dihasilkan.
d. Uji Fitokimia Tiap Fraksi
Eluat yang memiliki profil kromatogram yang sama dikumpulkan.
Sehingga mendapatkan 4 fraksi. Tiap fraksi kemudian diuapkan dengan vacuum
rotary evaporator untuk mendapatkan fraksi kental.

50
Tiap fraksi ditotolkan pada plat KLT 5 x 15 cm, dan dielusi dengan tiga
fase gerak yaitu kloroform, kloroform : metanol (1:1), dan metanol. Kemudian
dari hasil elusi, plat disemprot dengan reagen Liebermann-Burchard.
Fraksi yang digunakan merupakan fraksi yang memberikan hasil positif
terhadap reaksi Liebermann-Burchard, atau dengan kata lain, mengandung
triterpenoid atau steroid.
5. Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)
a. Optimasi fase gerak untuk KLTP
Untuk membuat plat KLT, sebanyak 7 g adsorben (silika gel) yang akan
digunakan untuk pelapis dibuat bubur dengan 21 mL pelarut (akuades). Bubur
yang telah ada kemudian diratakan pada plat kaca dengan ukuran 5x15cm dengan
menggunakan alat TLC Plate Coater, dengan ketebalan 0,25 mm. Setelah
adsorben pada plat kaca rata, plat lapis tipis yang terbentuk dikeringkan dalam
oven pada suhu 100 – 120oC selama paling kurang satu jam.
Fraksi kental yang mengandung steroid atau triterpen, ditotolkan pada
plat KLT yang telah dibuat. Plat kemudian dielusikan dengan menggunakan 3
larutan pengembang berupa kloroform, kloroform:metanol (1:1), dan metanol.
Dari hasil elusi dilihat fase gerak mana yang menghasilkan pemisahan
terbaik. Fase gerak yang memberikan pemisahan terbaik kemudian digunakan
sebagai fase gerak pada kromatografi lapis tipis preparatif.
b. Tahap KLTP
Sebanyak 7 g adsorben (silika gel) yang akan digunakan untuk pelapis
dibuat bubur dengan 21 mL pelarut (akuades). Bubur yang telah ada kemudian
51
diratakan pada plat kaca dengan ukuran 20 x 20cm dengan menggunakan alat TLC
Plate Coater, dengan ketebalan 0,5 mm. Setelah adsorben pada plat kaca rata, plat
lapis tipis yang terbentuk dikeringkan dalam oven pada suhu 100 – 120oC selama
1 jam.
Fraksi hasil isolasi dengan kromatografi kolom kemudian ditotolkan
berupa pita pada plat KLT yang telah dibuat. Plat kemudian dielusikan dengan
menggunakan larutan pengembang berupa kloroform, yaitu hasil optimasi
sebelumnya.
Hasil elusi kemudian dikeringkan dan bercak yang pada pengujian
sebelumnya positif terhadap Liebermann Burchard, dikerok dengan menggunakan
spatula kemudian ditampung dan diekstraksi dengan menggunakan pelarut
kloroform. Hasil ekstraksi lalu dipekatkan dengan menggunakan rotary vaccum
evaporator.
c. Analisis Kualitatif Isolat dengan KLT
Masing-masing eluat ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan ke dalam
chamber yang telah dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase gerak kloroform,
kloroform : metanol (1:1), dan metanol.
Isolat dinyatakan murni apabila hanya terdapat satu bercak. Jika terdapat
lebih dari satu bercak, proses kormatografi lapis tipis dapat dilakukan pada eluat
yang dihasilkan. Jika dari hasil elusi telah diperoleh senyawa yang murni secara
KLT maka dapat dielusidasi dengan metode spektrofotometri.

52
6. Elusidasi Struktur
Senyawa hasil isolasi diidentifikasi strukturnya dengan menggunakan
spektrofotometri massa dan spektrofotometri UV-VIS.
a. Spektrometri massa
Senyawa hasil isolasi sebanyak 1 mg dilarutkan dalam 10,0 mL
methanol. Larutan tersebut di milipore dan di degassing dengan ultrasonikator,
lalu diinjeksikan pada kromatografi gas-spektrometri massa (KG-SM). Sehingga
didapatkan peak hasil pemisahan campuran, serta spektra massanya.
b. Spektrometri UV-VIS
Senyawa hasil isolasi sebanyak 1 mg dilarutkan dengan pelarut
kloroform 10,0 mL, kemudian larutan dimilipore. Pada larutan tersebut dilakukan
scanning panjang gelombang dari 200 nm – 800 nm. Sehingga didapatkan spektra
untuk mengetahui gugus-gugus yang mengandung kromofor.
F. Analisis Hasil
Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini adalah analisis kualitatif
dengan membaca spektra massa dan spektra UV-VIS. Analisis ini dilakukan
dengan membandingkan spektra yang didapat dengan pustaka yang diacu.
Sehingga diketahui senyawa dengan berat molekulnya dengan spektra massa. Dari
spektra massa yang didapatkan dibandingkan dengan database yang ada.
Kepastian senyawa dapat dilihat dari similarity index yang ditampilkan, serta
dibuktikan dengan reaksi fragmentasinya. Semakin mendekati 100, similarity
index-nya, maka semakin besar kemungkinan kesamaan senyawanya. Sedangkan

53
dari spektra UV-VIS dapat diketahui adanya system kromofor dan auksokrom
pada senyawa dalam isolat. Sehingga dapat diketahui gambaran struktur
kandungan senyawa dalam isolat yang dianalisis.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada bab ini, akan di tampilkan hasil penelitian dan pembahasannya
tentang proses determinasi tanaman, preparasi simplisia, ekstraksi, serta proses
isolasi yang dilanjutkan dengan elusidasi struktur. Proses isolasi yang dilakukan
dengan kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis, sedangkan elusidasi
struktur menggunakan metode spektrometri massa dan spektrofotometri UV-Vis.
A. Determinasi Tanaman
Tanaman binahong yang digunakan dalam penelitian ini dilakukan oleh
Laboratorium Kebun Obat Fakultas Farmasi Sanata Dharma dengan mengacu
pada Backer dan Van de Brink (1963). Adapun taksonomi dari hasil determinasi
adalah sebagai berikut:
Famili : Basellaceae
Genus : Anredera
Spesies : Anredera cordifolia (Ten.) Steenis
B. Preparasi Serbuk Simplisia Daun Binahong
Penyiapan sampel dimulai dengan pemetikan daun binahong segar. Daun
yang dipetik adalah daun dewasa, yaitu daun yang telah berwarna hijau tua dan
memiliki ukuran panjang 5-10 cm. Dipilih daun dewasa karena pada tahap ini,
kandungan dalam daun telah lengkap. Selain itu, daun dipilih yang utuh dan
54
55
memiliki bentuk daun yang baik. Jika daun sobek, senyawa-senyawa dalam daun
dapat teroksidasi oleh udara. Daun yang tidak utuh atau memiliki bentuk daun
yang tidak normal, menandakan adanya invasi organisme lain. Invasi dari
organisme ini memungkinkan adanya senyawa yang masuk ke dalam daun
tanaman binahong. Senyawa ini dapat bertindak sebagai elicitor. Elicitor
merupakan senyawa patogen atau non-patogen yang berasal dari organisme lain
yang masuk dan menginduksi sistem pertahanan tanaman untuk merespon dengan
mensintesis senyawa baru yang bertindak sebagai sistem kekebalan dari tanaman
tersebut (Teniente, dkk, 2010).
Daun kemudian dibersihkan dari debu dan kotoran dengan pencucian.
Pengotor tidak hanya berupa benda asing seperti tanah, batu, debu, ataupun polusi
serta residu pestisida, tetapi juga bagian tanaman selain daun, seperti, akar,
batang, tangkai daun, serta bunga. Hal ini, karena bagian tanaman lain memiliki
fungsi yang berbeda dari daun, sehingga kemungkinan kandungan yang berbeda.
Daun binahong kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 40-60C.
Pengeringan dilakukan untuk menjaga stabilitas daun dari pertumbuhan mikroba
dan proses pembusukan daun yang dapat terjadi secara enzimatis dengan media
air. Mikroba dapat menguraikan senyawa-senyawa tertentu dalam tanaman,
sehingga semakin banyak mikroba, maka semakin banyak pula penguraian
senyawa yang dapat terjadi dalam simplisia. Selain itu, air juga dapat
mengaktifkan enzim-enzim, misalnya hidrolase, sehingga senyawa-senyawa yang
mudah terhidrolisis akan cepat terdegradasi oleh adanya enzim ini. Pengeringan
juga dapat membantu proses ekstraksi, dimana dengan dikeringkan membran sel
56
daun akan mati dan rusak. Rusaknya membrane sel dapat memudahkan
pengambilan senyawa yang ada di dalam sel.
Pengeringan tidak dapat dilakukan langsung dengan sinar matahari,
karena dalam sinar matahari juga terdapat sinar UV yang dapat mendegradasi
senyawa-senyawa dalam daun. Selain itu, proses pengeringan dijaga pada suhu
dibawah 60C karena suhu yang tinggi dapat merusak senyawa yang mudah
teroksidasi.
Pada penelitian ini, senyawa-senyawa non-polar yang tersari merupakan
senyawa tanaman golongan terpenoid, khususnya triterpenoid dan tetraterpenoid.
Senyawa-senyawa triterpenoid umumnya stabil terhadap panas, karena memiliki
titik lebur lebih dari 150°C (O’Neil, dkk, 2001), serta memiliki struktur yang
rigid. Sedangkan senyawa-senyawa tetraterpenoid, menurut O’Neil, dkk (2001)
lebih mudah mengalami fotooksidasi. Oleh karena itu, proses pengeringan
dilakukan dengan menggunakan oven untuk mempercepat pengeringan serta
menghindari cahaya matahari langsung terhadap daun binahong.
Daun binahong kering kemudian diubah menjadi bentuk serbuk dan
diayak dengan pengayak ukuran 40 mesh. Penyerbukan dilakukan agar
memperluas permukaan daun binahong, agar ketika diekstraksi luas permukaan
daun yang kontak dengan pelarut besar, sehingga dapat meningkatkan efektifitas
ekstraksi.
57
C. Ekstraksi Serbuk Simplisia Daun Binahong
Serbuk daun binahong kemudian disari kandungan kimianya dengan
proses ekstraksi. Proses ini terjadi karena adanya perbedaan gradient kadar,
dimana pelarut memiliki kadar senyawa sama dengan nol, sedangkan serbuk daun
binahong memiliki kadar kandungan yang cukup tinggi. Oleh karena itu, senyawa
akan berdifusi dari serbuk ke dalam pelarut hingga jenuh. Suatu sistem ekstraksi
dinyatakan jenuh ketika kadar senyawa di kedua fase padat dan cair (fase padat
yaitu serbuk simplisia dan fase cair yaitu pelarut), sehingga tidak terjadi lagi
proses difusi.
Proses ekstraksi serbuk daun binahong dilakukan dengan menggunakan
pelarut n-heksana, yakni pelarut non-polar (indeks polaritas = 0,1 menurut Garrett
(1998)). Pemilihan pelarut non-polar ini akan menyari senyawa-senyawa non-
polar (Basset, Denney, Jeffery, Mendham, 1994). Sehingga senyawa-senyawa
yang tersari adalah senyawa dengan polaritas rendah, seperti triterpenoid dan
steroid.
Ekstraksi dilakukan dengan maserasi sebanyak tiga (3) kali terhadap
simplisia selama 3 jam. Pengulangan ini bertujuan untuk memaksimalkan
keefektifan maserasi. Ketika maserasi hanya dilakukan 1 kali, maka sistem
ekstraksi dapat jenuh, atau dengan kata lain pelarut telah menampung senyawa
secara maksimal. Sehingga masih terdapat senyawa tertinggal dalam simplisia.
Ekstrak cair yang didapat dievaporasi dengan vacuum rotary evaporator
untuk mendapatkan ekstrak yang lebih pekat. Prinsip vacuum rotary evaporator
adalah penguapan pelarut yang dilakukan pada tekanan yang rendah, sehingga
58
dapat menurunkan titik didih pelarut. Maka, suhu ekstrak dijaga pada 40⁰C agar
meminimalkan kerusakan senyawa dalam ekstrak.
Dari percobaan didapatkan dari 983,91 gram serbuk daun binahong
dihasilkan ekstrak sebanyak 89,65 gram, maka rendemen ektrak n-heksana yang
didapatkan adalah sebesar 9,11 %.
D. Uji Pendahuluan Ekstrak
Uji pendahuluan ekstrak merupakan uji fitokimia yang dilakukan secara
uji kualitatif dengan menggunakan reagen. Dimana, ekstrak n-heksana direaksikan
dengan reagen-reagen sehingga dapat menggambarkan golongan senyawa-
senyawa yang terdapat dalam ekstrak n-heksana. Golongan senyawa inilah
sebagai gambaran awal, perkiraan senyawa yang akan diisolasi dan elusidasi
struktur.
1. Identifikasi flavonoid
Ekstrak setara dengan 3 gram simplisia atau 273,1 mg ekstrak dilarutkan
dengan 2 mL metanol untuk menyari glikosida. Larutan ini merupakan larutan
percobaan yang akan digunakan untuk uji flavonoid.
Larutan percobaan diuapkan dilarutkan dalam etanol (95%) P akan diuji
menggunakan reaksi sianidin dimana akan ditambahkan masing-masing serbuk
seng dan serbuk magnesium dalam suasana asam (asam klorida).
Kompleks flavonoid-Zn2+ akan berwarna merah intensif (menunjukkan
adanya glikosida 3-flavonol), sedangkan flavonoid-Mg2+ akan menimbulkan

59
warna kuning sampai jingga (menunjukan adanya flavon, kalkon, dan auron)
(Harborne, 1984).
Gambar 11. Hasil uji flavonoid dengan (a) serbuk seng dan (b) serbuk
magnesium
Dari hasil kedua uji (Gambar 11), didapatkan larutan bening dengan
serbuk seng dan serbuk magnesium yang tidak larut. Oleh karena itu, dari
percobaan ini, dapat disimpulkan bahwa ekstrak tidak mengandung glikosida
flavonoid.
Gambar 12. Hasil KLT identifikasi flavonoid

60
Tabel III. Hasil identifikasi flavonoid dengan KLT
Warna sebelum Warna setelah

Gambar No. bercak Nilai Rf disemprot disemprot
amonia amonia
12 1 0,03 Hijau kehitaman Hijau kehitaman
2 0,20 Kuning Kuning
3 0,31 Hijau Hijau
4 0,48 Hijau tua Hijau tua
5 0,75 Kuning Kuning
Dari hasil KLT (Gambar 12) didapatkan bahwa tidak terjadi perubahan
warna, jika ekstrak direaksikan dengan amonia. Hal ini menunjukkan bahwa
ekstrak n-heksana daun binahong tidak mengandung flavonoid. Hal ini karena
flavonoid menurut Bruneton (1999) akan mengalami perubahan warna jika
direaksikan dengan amonia.
2. Identifikasi tanin
a. Uji dengan FeCl3. Dalam identifikasi ini, ekstrak direaksikan dengan
larutan FeCl3 1%. Tanin akan bereaksi dengan FeCl3 1% menurut reaksi
pembentukan kompleks Fe2+ dengan OH-fenolik pada tanin. Kompleks ini akan
menghasilkan warna hijau kehitaman pada tanin terhidrolisa dan warna hijau
kecoklatan pada tanin terkondensasi (Levita, Musfiroh, Mustarichie, 2011).
Gambar 13. Hasil reaksi uji identifikasi tanin dengan FeCl3

61
Pada percobaan ini, didapatkan bahwa larutan FeCl3 1% dalam air tidak
bercampur dengan ekstrak dengan pelarut n-heksana karena adanya perbedaan
polaritas yang sangat besar antara n-heksana dan air. Oleh karena itu, dilakukan
penggojokkan dengan kuat dengan maksud agar tanin yang mungkin terdapat
dalam ekstrak n-heksana dapat tersari dalam larutan FeCl3 1% dalam air, sehingga
dapat terjadi reaksi warna.
Hasil reaksi (Gambar 13) menunjukkan bahwa lapisan bawah yang
merupakan larutan FeCl3 1% dalam air tidak berubah warna menjadi biru, hal ini
menunjukkan bahwa dalam ekstrak n-heksana tidak mengandung tanin.
b. Uji dengan Larutan Gelatin. Pengujian ini dilakukan dengan
mereaksikan ekstrak dengan gelatin. Tanin akan bereaksi dengan gelatin dengan
membentuk ikatan hidrogen sehingga memiliki bobot yang besar yang tidak larut
dalam medium air. Jika terbentuk endapan dengan larutan gelatin maka larutan uji
positif mengandung tanin (Levita, Musfiroh, Mustarichie, 2011).
Gambar 14. Hasil uji identifikasi tanin dengan larutan gelatin

Pada percobaan ini, didapatkan bahwa larutan gelatin dalam air tidak
bercampur dengan ekstrak dengan pelarut n-heksana karena adanya perbedaan
polaritas yang sangat besar antara n-heksana dan air. Oleh karena itu, dilakukan
62
penggojokkan dengan kuat dengan maksud agar tanin lebih memungkinkan untuk
bereaksi dengan gelatin dan membentuk endapan.
Dari hasil percobaan (Gambar 14) didapatkan bahwa, lapisan bawah
larutan gelatin tidak terlihat adanya endapan yang menunjukkan bahwa tidak
terdapat tanin dalam ekstran n-heksana daun binahong.
Dari hasil pengujian terhadap tanin dapat diketahui bahwa ekstrak tidak
mengandung tannin karena senyawa-senyawa dalam ekstrak sangat non-polar
karena larut dalam n-heksana, sedangkan tanin memiliki polaritas yang tinggi
sehingga dapat bercampur dengan air karena memiliki jumlah OH-fenolik yang
cukup banyak.
3. Identifikasi alkaloida
Ekstrak n-heksana setara 500 mg simplisia ditambahkan 1 mL HCl 2 N
dan 9 mL air, kemudian dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit,
didinginkan dan disaring. Proses ini, bertujuan untuk mengambil alkaloid yang
dengan HCl dapat berubah menjadi bentuk garam sehingga larut dalam air.
Larutan kemudian direaksikan dengan beberapa reagen yaitu:
a. Uji dengan Wagner LP.
Gambar 15. Hasil Uji Identifikasi Alkaloid dengan Wagner LP

63
Pada uji alkaloid dengan Wagner LP bahwa endapan hasil reaksi adalah
kalium alkaloid, iodium akan bereaksi dengan I- dari kalium iodide menjadi I3-
yang berwarna cokelat (Levita, Jutti, dkk, 2011).
Dan dari hasil (gambar 15), larutan tidak berubah warna menjadi cokelat
dan tidak timbul endapan, atau dengan kata lain, tidak terkandung alkaloid dalam
ekstrak.
b. Uji dengan Mayer LP
Gambar 16. Hasil Uji Identifikasi Alkaloid dengan Mayer LP

Dari reaksi didapatkan bahwa reaksi Mayer menghasilkan kompleks
alkaloid-Hg2+ yang dapat mengendap (Harborne, 1984). Karena dari hasil
percobaan (Gambar 16) tidak didapatkan endapan putih dengan reagen Mayer,
maka disimpulkan bahwa ekstrak tidak mengandung alkaloid.
c. Uji dengan Dragendorff LP
Gambar 17. Hasil Uji Identifikasi Alkaloid dengan Dragendorff LP

64
Dari reaksi alkaloid dengan Dragendorff LP didapatkan bahwa dihasilkan
kompleks yang mengendap dan menurut Popl, Fänrich, dan Tatar (1990) berwarna
jingga. Dan dari hasil reaksi (Gambar 17) antara ekstrak dan reagen Dragendorff
LP didapatkan larutan yang berwarna merah kecoklatan dan tidak timbul adanya
endapan. Maka dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat alkaloid dalam ekstrak.
Dari ketiga hasil percobaan terhadap alkaloid, tidak terdapat adanya
endapan dengan mereaksikan ekstrak dengan masing-masing reagen, yang berarti
tidak terdapat alkaloid dalam ekstrak n-heksana daun binahong. Tetapi hasil ini
dapat menjadi bias, dimana terjadi karena endapan juga dapat tidak terlihat secara
kasat mata. Oleh karena itu, dilakukan pengujian identifikasi alkaloid dengan
menggunakan kromatografi lapis tipis, dimana deteksi bercak menggunakan
reagen Dragendorff.
Gambar 18. Hasil KLT identifikasi alkaloid dengan reagen Dragendorff

65
Tabel IV. Hasil identifikasi alkaloid dengan KLT

No. ditambahkan ditambahkan
Gambar Nilai Rf
bercak reagen reagen
Dragendorff Dragendorff
18 1 0,06 Hijau kehitaman Coklat kehitaman
2 0,30 Kuning Hijau
3 0,47 Hijau Hijau tua
4 0,58 Hijau kehitaman Hijau kehitaman
5 0,82 Kuning Hijau kebiruan
Dari hasil kromatografi lapis tipis didapatkan bahwa pada bercak (1), (2),
dan (5) mengalami perubahan warna. Tapi tidak ada bercak yang berubah warna
menjadi warna oranye yang menunjukkan adanya alkaloid. Hal ini sesuai dengan
teori, dimana alkaloid yang pada tanaman kebanyakan berbentuk garam, sehingga
hanya dapat diekstraksi menggunakan pelarut polar dan tidak dapat terekstraksi
dengan pelarut non-polar seperti n-heksana yang menjadi pelarut dalam ekstrak.
4. Identifikasi saponin
Pengujian saponin dilakukan dengan mencampur ekstrak n-heksana daun
binahong dengan air, kemudian digojok. Penggojogan ini bertujuan untuk
mengetahui sifat saponin seperti surfaktan dengan terbentuknya busa (Harborne,
1984). Hal ini karena, saponin yang mengandung rantai sapogenin yang non-polar
serta rantai samping yang polar karena adanya gula dapat membuat sifat saponin
seperti surfaktan yang dapat menurunkan tegangan permukaan. Oleh karena itu,
ketika larutan sampel dikocok, atau ditambahkan energi, saponin akan
menurunkan tegangan permukaan antara larutan dan udara. Sehingga udara yang
masuk ke dalam larutan terjebak dan menimbulkan busa.

66
Gambar 19. Hasil uji identifikasi saponin
Dari hasil percobaan (Gambar 19), tidak timbul busa pada larutan. Atau
dengan kata lain, ekstrak n-heksana daun binahong tidak mengandung saponin.
Hasil ini sesuai dengan teori di atas dimana saponin yang mengandung gugus gula
lebih larut pada pelarut polar sehingga tidak tersari kedalam ekstrak yang non-
polar.
5. Identifikasi triterpenoid dan steroid
HOAc/H2SO4
Ac2O
HO
Ion karbonium 3,5-diena (SO3)
+ SO2
HOO2S
Asam Sulfonat Kolestaheksaena Kation Pentaenylat
max 410 nm max 620 nm
Gambar 20. Reaksi steroid dengan reagen Liebermann-Burchard (Burke,
Diamondstone, Velapoldi, dan Menis, 1974)
67
Dalam pengujian ini, ekstrak direaksikan dengan reagen Liebermann-
Burchard. Ekstrak dilarutkan terlebih dahulu dengan kloroform untuk menyari
triterpenoid dengan steroid dari ekstrak. Kemudian diteteskan pereaksi
Lieberman-burchard yaitu asetat anhidrat dalam asam sulfat pekat. Jika hasil yang
diperoleh berupa cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut
menunjukkan adanya triterpenoid. Sedangkan berdasarkan reaksi menurut Burke,
Diamondstone, Velapoldi, dan Menis (1974), steroid akan menghasilkan warna
hijau dengan reagen Liebermann-Burchard.
Gambar 21. Hasil uji identifikasi triterpenoid dan steroid
Dari hasil diatas (Gambar 21), terlihat warna larutan yang berwarna hijau
kebiruan. Maka dapat disimpulkan bahwa ekstrak n-heksana daun binahong
mengandung steroid. Tetapi hasil ini dapat menjadi bias karena warna hijau
kebiruan pada hasil juga dapat dipengaruhi oleh warna alami ekstrak yang
berwarna hijau.
Karena hasil yang bias, maka dilakukan identifikasi triterpenoid dan
steroid dengan terlebih dahulu menotolkan ekstrak pada plat kromatografi lapis
tipis dan kemudian di kembangkan dengan kloroform. Setelah itu, plat disemprot
reagen Liebermann-Burchard dan H2SO4-metanol (1:1).

68
Gambar 22. Identifikasi Triterpenoid dan Steroid dengan Kromatografi

Lapis Tipis, (a) sebelum disemprot reagen, (b) setelah disemprot reagen
Liebermann Burchard, dan (c) setelah disemprot H2SO4-metanol (1:1) dan
dipanaskan 110°C.
Tabel V. Hasil KLT Identifikasi Triterpenoid dan Steroid
Warna setelah
ditambahkan
No. Nilai ditambahkan ditambahkan
Gambar H2SO4-
bercak Rf reagen LB
metanol
(a) (b)
(c)
Coklat
22 1 0,02 Hijau Hijau
kehitaman
2 0,06 Hijau tua Hijau tua Coklat tua
3 0,12 - Hijau Ungu muda
4 0,25 - - Merah
5 0,30 - Hijau muda Merah muda
6 0,42 Kuning Hijau muda Ungu muda
7 0,60 - Hijau Ungu
8 0,65 - - Ungu
9 0,71 Hijau Hijau tua Merah muda
Hijau Hijau
10 0,83 Kuning
kekuningan Kecoklatan
69
Dari hasil kromatografi di atas (Gambar), di dapatkan bahwa bercak 6
dan 10 yang berwarna kuning berubah menjadi hijau, serta bercak 3, 5 dan 7 yang
tidak berwarna berubah warna menjadi warna hijau dengan reagen Liebermann-
Burchard. Perubahan warna menjadi hijau ini menunjukkan terdapatnya
kandungan steroid dalam ekstrak n-heksana daun binahong.
Selain itu, identifikasi steroid juga ditegaskan oleh reaksi dengan H2SO4-
metanol (1:1) yang menghasilkan bercak 4, 5, dan 9 yang berubah warna menjadi
warna merah, serta 3, 6, 7, dan 8 yang berubah warna menjadi warna ungu.
Menurut Harborne (1984), sampel positif mengandung steroid bila berubah
menjadi merah, oleh karena itu, disimpulkan bahwa ekstrak n-heksana daun
binahong mengandung steroid dengan uji Liebermann-Burchard dan H2SO4.
Dari seluruh uji identifikasi, hasilnya disatukan dalam tabel. Tabel VI.
Menunjukkan ada tidaknya kandungan golongan senyawa tertentu dalam ekstrak
n-heksana daun binahong.
Tabel VI. Hasil uji fitokimia ekstrak n-heksana daun binahong
Golongan senyawa Hasil uji pendahuluan

Flavonoid -
Tanin -
Alkaloid -
Saponin -
Triterpenoid -
Steroid +
Keterangan: +: ada
-: tidak ada
70
Uji identifikasi senyawa dalam ekstrak n-heksana daun binahong
menunjukkan hasil positif hanya pada uji steroid. Uji identifikasi dengan uji
warna ini sangat memiliki kekurangan. Dimana dalam uji ini, tidak bisa untuk
menganalisis golongan senyawa dalam ekstrak dengan kadar yang kecil, karena
perubahan yang sangat kecil sulit dilihat secara visual. Oleh karena itu, akan
dilakukan identifikasi yang lebih lanjut dengan proses elusidasi struktur.
E. Isolasi dengan Kromatografi Kolom
Proses elusidasi struktur membutuhkan sampel dengan kandungan
senyawa murni. Oleh karena di dalam ekstrak masih terdapat bermacam-macam
senyawa harus terlebih dahulu dimurnikan atau dipisahkan dari senyawa lain.
Pemurnian senyawa ini dapat dilakukan dengan cara kromatografi.
Ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini merupakan ekstrak dengan
pelarut n-heksana, maka senyawa-senyawa yang terkandung didalamnya
merupakan senyawa lipofil (non-polar). Oleh karena itu, pemilihan kromatografi
kolom dalam awal proses isolasi merujuk pada Székely (cit., Hostettmann,
Hostettmann, dan Marston, 1995), dimana krombinasi yang dapat dilakukan
dalam mengisolasi senyawa lipofil, salah satunya dengan menggunakan
kromatografi cair dan kromatografi padat, misalnya menggunakan kombinasi
kolom terbuka yang dilanjutkan dengan KLT preparatif.
Selain itu, pemilihan kromatografi kolom karena dapat digunakan dengan
volume sampel yang cukup besar. Dalam proses ini, tidak diberikan tekanan untuk
mempercepat aliran fase gerak agar pemisahan dapat lebih dimaksimalkan.

71
Kromatografi kolom dilakukan untuk memisahkan senyawa-senyawa
dalam ekstrak yang merupakan campuran banyak senyawa. Pemisahan ini
bertujuan untuk mendapatkan fraksi, atau dengan kata lain, masih terdapat
senyawa lain dalam eluat yang tertampung.
1. Optimasi fase gerak kromatografi kolom dengan metode pendekatan KLT
Menurut Gritter, Bobbit, dan Schwarting (1991), pemilihan fase gerak
untuk melakukan proses kromatografi kolom dapat dilakukan dengan 3
pendekatan, yaitu dengan penelusuran pustaka, pendekatan dengan kromatografi
lapis tipis, serta menggunakan elusi landaian umum mulai dari pelarut non-polar
hingga pelarut polar. Penelusuran pustaka sangat sulit dilakukan karena belum
diketahuinya senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak n-heksana daun
binahong yang akan dipisahkan, sedangkan menggunakan elusi landaian umum,
menggunakan fase gerak yang banyak dan cukup rumit untuk dilakukan karena
menggunakan campuran pelarut yang diubah kepolarannya secara bertahap dan
kontinyu. Oleh karena itu pendekatan dengan kromatografi lapis tipis (KLT)
merupakan pendekatan yang paling mudah dan efisien dalam mengoptimasi fase
gerak yang akan digunakan dalam proses kromatografi kolom.
Oleh karena akan digunakan silika gel sebagai fase diam dalam
kromatografi kolom, sistem kromatografi ini merupakan fase normal. Fase normal
berarti bahwa fase diam yang digunakan adalah polar, dan fase gerak yang
digunakan adalah non-polar. Sistem kromatografi fase normal inilah yang juga
digunakan dalam KLT untuk menentukan sistem terbaik dalam kromatografi
kolom, sehingga fase diam yang digunakan dalam KLT juga silika gel. Untuk
72
mendapatkan eluen yang ideal, dilakukan percobaan sederhana, yakni dengan
mengelusi ekstrak n-heksana pada kromatografi lapis tipis dengan sejumlah
pelarut yang berbeda kepolarannya.
Pada proses ini optimasi ini, ekstrak n-heksana pekat ditotolkan pada
pelat silika yang telah dibuat dengan ketebalan silika 0,25 mm dan diaktifkan
sebelumnya selama kurang lebih 1 jam. Penotolan dilakukan dengan
menggunakan pipa kapiler. Totolan yang dihasilkan tidak boleh melebar, karena
akan menurunkan kualitas pemisahan. Pelat yang telah ditotolkan dengan ekstrak
dimasukan dalan chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak masing-
masing, untuk dikembangkan.
Tabel VII. Kepolaran fase gerak yang digunakan (Garrett,1998)

Fase Gerak Kepolaran
n-heksana 0,1
Acetonitril 5,8
Kloroform 4,1
Kloroform:Metanol (1:1) 4,8
Metanol 5,1
Setelah pengembangan telah mencapai 10 cm dari totolan awal, pelat
dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan. Kemudian diamati profil kromatogram
ekstrak yang terbentuk pada tiap fase gerak yang berbeda.

73
Gambar 23. Hasil KLT ekstrak dengan fase gerak (a) n-heksana, (b)
asetonitril, (c) kloroform, (e) metanol:kloroform 1:1.
74
Tabel VIII. Hasil KLT ekstrak dengan berbagai fase gerak

Gambar No. bercak Nilai Rf Warna
23 (a) 1 0,06 Hijau kehitaman
2 0,17 Kuning
3 0,35 Kuning
23 (b) 1 0,04 Hijau kehitaman
2 0,38 Kuning kehijauan
23 (c) 1 0 Hijau kehitaman
2 0,05 Hijau tua
3 0,3 Hijau
4 0,35 Kuning
5 0,45 Hijau
6 0,66 Hijau tua
7 0,74 Hijau
8 0,85 Kuning
23 (d) 1 0 Hijau kehitaman
2 0,22 Kuning muda
3 0,37 Hijau tua
4 0,46 Hijau kehitaman
5 0,51 Kuning
23 (e) 1 0 Hijau tua
2 0,26 Hijau kehitaman
3 0,34 Kuning
Dari hasil kromatogram, didapatkan bahwa kromatogram ekstrak dengan
eluen n-heksana menghasilkan 2 bercak yang terpisah dimana bercak 1 dan 3
mengekor. Kromatogram dengan eluen asetonitril menghasilkan 2 bercak yang
tidak memisah dimana bercak 2 mengekor. Kromatogram dengan eluen kloroform
menghasilkan 8 bercak yang terpisah dengan baik, kecuali bercak 2 yang
mengekor. Kromatogram dengan eluen kloroform:metanol (1:1) menghasilkan 5
bercak yang tidak memisah serta mengekor. Kromatogram dengan eluen metanol
menghasilkan 3 bercak yang tidak memisah dan mengekor.

75
Pemisahan terbaik didapatkan pada kromatogram dengan eluen
kloroform yang menghasilkan bercak paling banyak dan terpisah dari bercak
lainnya, serta banyak bercak yang tidak mengekor. Sehingga dapat disimpulkan
bahwa eluen terbaik untuk proses kromatografi kolom adalah kloroform.
2. Proses kromatografi kolom
Karena eluen yang digunakan adalah kloroform, maka silika gel yang
akan dimasukkan ke dalam kolom, terlebih dahulu disuspensikan ke dalam
kloroform. Penuangan suspensi kloroform ke dalam kolom harus dilakukan secara
hati-hati dengan meminimalkan timbulkan gelembung udara maupun aliran
turbulen. Gelembung udara ini dapat menyebabkan ketidakkompakan silika,
sehingga akan mengganggu proses pemisahan. Selain itu, kolom dijaga dari
keringnya silika dengan menjaga aliran eluen yang kontinyu (4 tetes tiap 3 detik).
Sehingga pada bagian atas kolom dihubungkan dengan corong pisah yang berisi
eluen (kloroform).
Fase diam yang digunakan adalah silika gel untuk column
chromatography yang dimasukkan ke dalam kolom kaca yang dilengkapi dengan
pengatur aliran (semacam keran) serta suatu saringan yang berfungsi untuk
menyangga fase diam. Suspensi silika gel dimasukkan ke dalam kolom hingga
padatan silika memiliki tinggi 20 cm.
Sebanyak 0,5 mL ekstrak n-heksana daun binahong dipipet ke bagian
atas silika gel di dalam kolom kaca, kemudian eluen (kloroform) dialirkan
kedalam kolom sesuai dengan kecepatan aliran eluen keluar dari kolom. Eluat
yang keluar ditampung setiap 3 menit.

76
Gambar 24. Kromatografi Kolom Ekstrak n-Heksana Daun Binahong
3. Uji kemurnian eluat kromatografi kolom dengan metode KLT
Untuk menganalisis kemurnian eluat yang didapatkan, dilakukan proses
kromatografi lapis tipis, dimana masing-masing eluat ditotolkan pada plat silika
gel GF254 dan kemudian dielusi dengan kloroform. Setelah pengembangan
dilakukan dengan jarak 10 cm, plat dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan,
serta dianalisis profil kromatogramnya.

77
Gambar 25. Hasil KLT masing-masing eluat dari kromatografi kolom
Tabel IX. Hasil KLT eluat dari kromatografi kolom

25 (a) 1 0,88 Kuning
25 (b) 1 0,89 Kuning
2 0,81 Hijau
25 (c) 1 0,70 Hijau
2 0,82 Hijau kekuningan
3 0,89 Kuning
25 (d) 1 0,66 Hijau
25 (e) 1 0,65 Hijau
25 (f) 1 0,65 Hijau
25 (g) 1 0,35 Hijau
25 (h) 1 0,36 Hijau
25 (i) 1 0 Hijau tua
2 0,33 Kuning
25 (j) 1 0 Hijau tua
2 0,32 Kuning
25 (k) 1 0 Hijau tua
2 0,32 Kuning
78
Eluat dengan profil kromatogram yang sama digabung. Maksudnya
adalah eluat yang menghasilkan bercak dengan Rf dan warna yang sama. Eluat-
eluat yang didapatkan dibagi menjadi 4 fraksi yang merupakan gabungan dari
eluat dengan profil yang sama.
Fraksi pertama (I) merupakan gabungan eluat dengan bercak yang
dihasilkan pada kromatogram dengan fase gerak kloroform dengan Rf 0,86-0,92
dan berwarna kuning. Fraksi kedua (II) merupakan gabungan eluat dengan Rf
0,70-0,85 dengan warna hijau tua. Fraksi ketiga (III) merupakan gabungan eluat
dengan Rf 0,4-0,68 dengan warna hijau tua. Serta, fraksi keempat (IV) memiliki
Rf 0,20-0,40. Serta fraksi kelima (V) yang memiliki Rf 0-0,05 (tidak terelusi)
dengan warna hijau tua.
Fraksi I telah dianalisis oleh Du’a (2012) dengan menggunakan KG-SM,
spektroskopi UV-Vis, serta dengan menggunakan Spektroskopi inframerah.
Dalam penelitiannya, didapatkan bahwa fraksi I ekstrak n-heksana daun binahong
mengandung steroid serta beberapa asam lemak dan turunannya.
Fraksi II, III, dan V tidak dianalisis karena adanya dugaan kuat
merupakan klorofil dengan jenis yang berbeda karena berwarna hijau.
Fraksi IV sangat berpotensial untuk dianalisis karena kecil kemungkinan
mengandung klorofil karena berwarna kuning, serta menghasilkan reaksi positif
untuk Liebermann-Burchard menjadi warna hijau, yang menunjukkan adanya
steroid. Analisis ini juga dilakukan untuk memastikan struktur steroid apa yang
terkandung dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong.

79
Fraksi IV yang telah dikumpulkan, dipekatkan dengan diuapkan
pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator dengan suhu 40°C, agar didapatkan
fraksi kental yang senyawanya tidak terdegradasi.
Gambar 26. Hasil uji identifikasi fraksi IV ekstrak n-heksana daun

binahong, a) dengan eluen kloroform, b) eluen kloroform setelah disemprot
reagen Liebermann-Burchard, c) eluen kloroform:metanol (1:1), d) eluen
kloroform:metanol (1:1) setelah disemprot reagen Liebermann Burchard, (e)
eluen metanol, dan (f) eluen metanol setelah disemprot reagen Liebermann-
Burchard
Tabel X. Hasil identifikasi fraksi IV dengan KLT

Warna Sebelum Warna Setelah
Gambar No. bercak Nilai Rf
Disemprot LB Disemprot LB
26 (a), (b) 1 0,02 Hijau kecoklatan Hijau kecoklatan
2 0,17 Kuning Hijau
26 (c), (d) 1 0,54 Kuning Hijau
26 (e), (f) 1 0,59 Kuning Hijau
80
F. Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis preparatif (KLTP)
Oleh karena, pemilihan kromatografi kolom dalam awal proses isolasi
merujuk pada Székely (cit., Hostettmann, Hostettmann, dan Marston, 1995),
dimana krombinasi yang dapat dilakukan adalah dengan menggunakan kombinasi
kolom terbuka yang dilanjutkan dengan KLT preparatif (KLTP).
Pada KLTP, plat yang digunakan berbeda dengan yang digunakan pada
KLT pada umumnya. Plat yang digunakan berukuran lebih besar yaitu 20 x 20
cm, serta fase diam yang digunakan lebih tebal dari plat KLT biasa. Pada
penelitian ini digunakan fase diam silika gel GF254 dengan ketebalan 0,5 mm,
selain itu, jarak pengembangan diperpanjang menjadi 15 cm. pemanjangan jarak
pengembangan dilakukan untuk memaksimalkan pemisahan yang terjadi.
Pada penelitian ini tidak dilakukan optimasi fase gerak terlebih dahulu.
Fase gerak yang digunakan berdasarkan hasil uji fraksi IV yang telah dilakukan.
Dari ketiga fase gerak, kromatogram dengan fase gerak kloroform menghasilkan 2
bercak yang memisah dengan baik. Oleh karena itu, kloroform kembali digunakan
untuk mengisolasi senyawa dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong.
Dalam mengisolasi, plat yang telah dibuat terlebih dahulu diaktifkan
dalam oven selama 1 jam dengan suhu 110°C. Setelah plat dingin, plat ditotolkan
dengan fraksi IV. Penotolan dilakukan membentuk pita, dengan menotolkan fraksi
IV berjejer dan rapat. Setelah pelarutnya menguap, plat dimasukan kedalam
chamber yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan kloroform sebagai fase gerak,
dan dikembangkan dengan jarak pengembangan 15 cm. Setelah mencapai
pengembangan yang diinginkan, plat dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan.

81
Gambar 27. Hasil KLTP
Tabel XI. Hasil KLTP

Gambar No. bercak Jarak Bercak Nilai Rf Warna
27 1 0 0 Hijau muda
2 3,5 0,23 Kuning
3 5,8 0,38 Kuning
Dari gambar hasil KLTP dapat dilihat adanya tiga pita yang menunjukan
adanya tiga senyawa. Yang diisolasi adalah senyawa pada pita pertama karena
pita ini menunjukkan pemisahan yang baik dan pita tidak mengekor. Pita pertama
kemudian dikerok dan diekstraksi dengan menggunakan kloroform. Isolat encer
ini kemudian dikentalkan dengan menggunakan rotary vacuum evaporator.

82
Gambar 28. Isolat pekat dari proses isolasi
Isolat yang didapatkan dianalisis kemurniannya menggunakan metode
kromatografi lapis tipis. Plat KLT aktif dengan fase diam silika ditotolkan dengan
isolat kental. Kemudian plat KLT tadi dikembangkan dengan 3 fase gerak yang
berbeda kepolarannya, yaitu dengan fase gerak kloroform, kloroform:metanol
(1:1), dan metanol.
Gambar 29. Uji kemurnian isolat: a) dengan eluen kloroform, b) dengan

eluen metanol-kloroform (1:1), dan c) dengan eluen metanol
83
Tabel XII. Uji kemurnian isolat

29. a 1 0,18 Kuning
29. b 1 0,55 Kuning
29. c 1 0,58 Kuning
Dari kromatogram didapatkan bahwa, dari ketiga fase gerak yang
berbeda, dihasilkan hanya 1 bercak dan tidak mengekor. Sehingga dapat
disimpulkan bahwa isolat yang dihasilkan telah murni secara kromatografi lapis
tipis. Karena telah dapat dikatakan murni, isolat dapat dielusidasi strukturnya
dengan metode spektroskopi.
G. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)
Dalam elusidasi struktur, salah satu metode yang digunakan adalah
spektroskopi massa (SM). Penggunaan spektrometri massa dilakukan untuk
mengetahui berat molekul senyawa yang dianalisis.
Penggunaan kromatografi gas yang digabung dengan spektroskopi massa
lebih efektif, karena pada KG-SM, sampel yang menguap akan memisahkan
senyawa-senyawa dari campuran maupun pengotornya, dimana masing-masing
akan senyawa yang telah terpisah dianalisis tersendiri dalam spektroskopi massa.
Spektra yang didapatkan tidak hanya dapat memberikan informasi
mengenai berat molekulnya saja, tetapi juga dapat mengetahui informasi tentang
struktur molekulnya dengan interpretasi fragmentasinya.
Selain itu, menurut Kosela (2010), mengidentifikasi struktur senyawa
saat ini lebih mudah karena telah disusunnya database spektra berbagai senyawa
organik, sehingga spektra sampel yang dianalisis dibandingkan dengan spektra

84
dari database yang ada dengan derajat kemiripan tertentu. Semakin tinggi derajat
kemiripannya, semakin besar kemungkinan kedua senyawa identik.
Dalam proses ini, pertama-tama isolat pekat yang didapatkan diinjekkan
pada sistem KG-MS, dengan kolom Rastek RXi-5MS dengan fase diam
merupakan campuran 95% dimenthil 5% difenil polisiloksan, dengan panjang
kolom 30 meter dan diameter 0,25 mm. Gas pembawa yang digunakan merupakan
gas inert yaitu gas helium.
Dalam proses kromatografi, isolat teruapkan dan terbawa masuk ke
dalam kolom. Suhu awal kolom 80°C yang dinaikan secara kontinyu hingga
305°C dan tetap selama 20 menit. Pemrograman suhu dilakukan untuk
memperbesar kemungkinan isolat seluruhnya teruapkan dan stabil dalam kondisi
uap selama di dalam kolom.
Gambar 30. Kromatogram KG-SM isolat

85
Kromatogram isolat (Gambar 30) menunjukkan bahwa terdapat 22 peak,
atau dengan kata lain, terdapat 22 senyawa dalam isolat. Tetapi hanya ada 1 peak
yang menonjol dengan % area sebesar 69,11 % adalah peak 14, serta 1 peak yang
memiliki presentasi lebih besar dari peak lainnya adalah peak 1 dengan 4,75 %
area.
Spektroskopi massa merupakan detektor yang digunakan dalam
kromatografi gas ini. Dimana sistem yang digunakan adalah electron ionization
(EI). Pada sistem ini, sampel yang merupakan senyawa-senyawa hasil pemisahan
kromatografi gas ditembak oleh seberkas elektron dan mengalami ionisasi. Ion
yang terbentuk tidak stabil dan akan berubah menjadi fragmen-fragmen yang
dapat dideteksi sehingga menimbulkan sinyal pada detektor. Tetapi, hanya ion
positif saja yang dapat terdeteksi, sedangkan molekul netral dan ion negatif tidak
dapat dideteksi oleh detektor dan muncul sebagai peak dalam spektra massa.
Fragmen-fragmen yang tercermin dalam peak, merupakan petunjuk untuk
menentukan struktur molekul senyawa dalam isolat karena fragmen tercipta sesuai
dengan reaksi yang logis.
Peak yang dianalisis dalam penelitian ini selain peak 14 dan peak 1
adalah peak dengan similarity index yang tinggi yaitu lebih dari atau sama dengan
95%, dimana pada nilai tersebut dapat dikatakan senyawa tersebut identik
(Kosela, 2010). Peak-peak tersebut antara lain peak 3, peak 4, peak 10, peak 11,
dan peak 16.

86
1. Peak 1
Peak 1 dalam kromatogram dengan waktu retensi 8,190 menit dengan
base peak pada m/e 128.
Gambar 31. Spektra peak 1 KG-SM isolat
Menurut Mc Lafferty (1988), ion molekul yang mungkin untuk Mz 128
ialah C8H16O, C9H20, C7H12O2, C6H8O3, dan C10H8. Dari hasil fragmentasi tidak
dijumpai adanya pengeluaran air (selisih m/e 18) yang mengindikasi adanya atom
oksigen. C9H20 merupakan alkana (CnH2n+2) rantai lurus dimana base peak alkana
berada pada C3 dan C4 (m/e 43 dan 57). Base peak yang sama dengan berat
molekul menurut Mc Lafferty (1988) mengindikasikan suatu aromatis serta
heterosiklis C10H8.
Terdapat dua kemungkinan yaitu siklopentasikloheksena dan naftalen.
Kestabilan naftalen lebih tinggi dari siklopentasikloheksena karena siklilisasi
cincin-6 lebih stabil dibandingkan dengan siklilisasi cincin-5 maupun cincin-7.
Sehingga diusulkan struktur molekulnya senyawa pada peak 1 adalah naftalen.
Hasil ini dapat dibuktikan dengan similarity index sebesar 95 %.

87
Gambar 32. Struktur Naftalen
2. Peak 3
M/e 41, 55, 69, 83, 97, 111 menunjukkan adanya alkena (Mc Lafferty,
1988). Base peak 41 menunjukkan adanya fragmen C3H5+ yang ditunjukkan oleh
reaksi fragmentasi alkena pada Gambar 38, fragmen ini terbentuk oleh ion
molekul 1-alkena.
H2 H2
R C C C CH2 R CH2 + H2C C CH2
H
m/e 41
Gambar 34. Fragmentasi 1-alkena
88
Dari hasil penyesuaian dengan database ada tiga senyawa yang memiliki
similarity index paling tinggi (95%) yaitu 1-pentadekena (BM= 210), 1-
heksadekena (BM= 224), dan 1-heptadekena (BM= 238). Senyawa yang paling
mungkin merupakan senyawa pada peak 3 adalah 1-pentadekena, karena terdapat
peak pada m/e 210 yang merupakan berat molekul dari 1-pentadekena.
C10H21
-e
C10H21 C10H21 +
m/e 41
H C7H15
CH2
H
CH2
CH C8H17
H2C
-C3H7
-CH3
C6H13 C6H13
C8H17
-e
m/e 126
-e
H CH3
CH2 C8H17
C4H9 +
m/e 41
m/e 154
H
-C3H7
CH2
CH C2H5
H2C C6H13 +
m/e 41
-e -CH3
C2H5
H C3H7
-e CH2 H
-C3H7
CH2
m/e 42 CH C4H9
C2H5 H2C
-e -CH3
m/e 70
C4H9
m/e 98
Gambar 35. Fragmentasi senyawa 1-pentadekena
89
3. Peak 4
M/e 43, 57 menunjukkan adanya alkil, sedangkan 55, 69, 83, dan 111
menunjukkan adanya ikatan rangkap C C , yang merupakan senyawa alkena.
Dari hasil perbandingan spektra dengan database didapatkan 3 senyawa dengan
similarity index tertinggi (95%) yaitu; 1-heptadekena (BM=238), 1-oktadekena
(BM=252), dan 3-eikosena (BM=280). Spektra peak 4 bukan merupakan 3-
eikosena karena memiliki base peak yang berbeda yaitu pada m/e 57.
Senyawa pada peak 4 (Gambar 36) merupakan 1-oktadekena karena
spektra peak 4 lebih mirip dengan spektra 1-oktadekena. Dimana terdapat peak
m/e 182 dan m/e 252 dalam peak 1-oktadekena pada database, dan m/e 183 dan
m/e 250 pada peak 4. Serta terdapat peak 504 yang merupakan dua kali berat
molekul 1-oktadekena. Hal ini karena 1-alkena dapat bereaksi dengan sesamanya
menjadi lebih panjang dengan dua kali berat molekulnya.

90
C13H27
-e
C13H27 C13H27 +
m/e 41
H C10H21
CH2
H
CH2
CH C11H23
H2C
-C3H7
-CH3
C9H19 C9H19
C11H23
-e
m/e 168
-e
H C4H9
CH2 C11H23
C7H15 +
m/e 41
m/e 196
H
-C3H7
CH2
C3H7 CH C5H11
H2C C9H19 +
m/e 41
-e -CH3
C5H11
H C6H13
C3H7 -e CH2 H
-C3H7
CH2
m/e 84 CH C7H15
C5H11 H2C
-e -CH3
m/e 112
C7H15
m/e 140
Gambar 37. Fragmentasi senyawa 1-oktadekena
91
4. Peak 8
M/e 43, 57 merupakan petunjuk adanya rantai alkil dengan fragmen
C3H7+ atau C4H9+, sedangkan m/e 55, 69, 83, 97, 111 merupakan petunjuk adanya
alkena ataupun alkohol. Menurut Silverstein, Webster, dan Kiemie (2005), dalam
spektra alkohol terdapat juga peak-peak alkena karena dalam fragmentasinya
alkohol akan melepaskan molekul netral maupun ion alkena. Oleh karena itu,
senyawa yang memungkinkan adalah alkena atau alkohol.
Dari hasil didapatkan empat senyawa dengan similarity index paling
tinggi (96 %) yaitu; 4-tetradekanol, 1-oktadekena, 1-heptadekena, dan 3-eikosena.
3-eikosena tidak sesuai dengan spektra peak 8 karena base peak yang berbeda
dimana base peak spektra peak 8 adalah m/e 43 sedangkan base peak 3-eikosena
adalah 57. Selain itu, pada spektra 1-oktadekena dan 1-heptadekena terdapat peak
pada m/e 168 serta pada 252 (1-oktadekena) atau pada m/e 238 (1-heptadekena).
92
Oleh karena itu, diusulkan bahwa senyawa pada peak 8 dari KG-MS adalah 4-
tetradekanol.
Menurut Mc Lafferty (1988), senyawa alkohol dalam fragmentasinya
akan menghasilkan molekul air dan molekul alkena. Hal ini dibuktikan pada m/e
153, yang memiliki selisih 61 dengan berat molekul 4-tetradekanol yaitu 214.
Selisih 61 merupakan pengeluaran molekul netral yang tidak terdeteksi yaitu air
(massa=18) dan propil (C3H7, dengan massa=43). Menurut Gross (2004), alkohol
memiliki dua kemungkinan reaksi fragmentasi yaitu dengan pemutusan rantai
karbon-α dan tata ulang hidrogen sesuai dengan tata ulang Mc Lafferty.
C9H19
OH
 
-C3H7 -C3H7
C8H17
OH
OH H
C7H15 H
-H2O
H C8H17
C OH2
+ HC OH2
C7H15 CH2 2
CH
-H2O
C8H17 C
H
H2C CH m/e 153
(a)
rH
-H2O +
OH
C7H15
C7H15 H
m/e 125
(b)
Gambar 39. Fragmentasi 4-tetradekanol dengan pemutusan-α (a) dan
tata ulang hidrogen (b)
93
5. Peak 10
Gambar 40. Spektra Peak 10 KG-SM isolat
M/e 43 dan 57 menunjukan adanya rantai alkil dengan fragmen C3H7+
atau C4H9+. Spektra ini lebih menunjukkan suatu alkohol daripada alkena karena
peak m/e 57 lebih tinggi kelimpahannya dibandingkan dengan m/e 55. Senyawa
yang mungkin adalah 4-tetradekanol dan trikosil alkohol (trikosanol).
Pada spektra terdapat peak pada m/e 168 yang dapat dihasilkan oleh
trikosanol dan tidak dapat dihasilkan oleh 4-tetradekanol. 4-Tetradekanol
memiliki fragmen terbesar pada m/e 153 (Gambar 40). Sedangkan trikosanol
memungkinkan untuk menghasilkan fragmen pada m/e 168 (C12H24+) karena
fragmen yang terbentuk berupa rantai alkil yang lebih panjang yaitu C22H45· dan
C21H42·+, yang dapat membentuk peak dengan selisih 14 (-CH2-). Hal ini
dibuktikan dengan similarity indeks trikosanol yaitu 96%.

94
OH 
C21H43 C21H43 CH2 + H2C OH
(a)
rH
H2C CH2 +
OH -H2O C18H37
C19H39 H
+ H2C CH3 rH
C13H27 C17H35 CH2 +
m/e 41
(b)
Gambar 41. Fragmentasi Trikosanol dengan pemutusan-α (a) dan tata ulang
hidrogen (b)
6. Peak 11
Gambar 42. Spektra Peak 11 KG-SM isolat
Dari spektra (Gambar 42) m/e 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, dan 141
menunjukkan pemutusan metil secara berkelanjutan yang menunjukkan rantai

95
panjang alkil. Base peak m/e 43 dan peak 57 merupakan peak tertinggi dalam
spektra yang menunjukkan ion molekul C3H7+ dan C4H9+. Base peak ini sesuai
dengan peak-peak utama alkana yaitu pada C3 dan C4 (Mc Lafferty, 1988).
Selain itu, dari spektra juga didapatkan peak pada m/e 55, 69, 83, 97,
111, 125, 139, 153, dan 224 dengan kata lain peak dengan rumus molekul CnH2n-1,
dimana peak-peak tersebut menurut Silverstein, Webster, dan Kiemie (2005)
merupakan petunjuk senyawa sikloalkana. Oleh karena itu diusulkan senyawa
siklotetrakosana, yang dibuktikan dengan nilai similarity index sebesar 95%.
(CH2)6
H (CH2)18
CH2 CH2 (CH2)17 CH2
-e -C3H7
(CH2)6
m/e 293
-CH2+ -e
(CH2)15 CH2 (CH2)16 CH2
-CH2+ (CH2)17 CH2
m/e 265 m/e 279
-C3H5+
dan seterusnya (CH2)7 CH2 H (CH2)12
hingga -CH2+ m/e 153 (CH2)11 CH2 -e CH2 CH2
m/e 209 -C3H7
-CH2+
-C3H5+ m/e 252
(CH2)5 CH2 (CH2)6 CH2
-CH2+ H (CH2)6
m/e 125 m/e 139 CH2 CH2
(CH2)5 CH2
-e
-CH2+ -C3H7 m/e 125
m/e 168 -C3H5+
(CH2)3 CH2
(CH2)4 CH2 -CH2 +
m/e 111 m/e 97

H CH2
+ CH2
-CH2 m/e 84
(CH2)2 CH2 +
m/e 83 m/e 41
Gambar 43. Fragmentasi senyawa siklotetrakosana
Dari spektra didapatkan bahwa base peak senyawa siklotetrakosana
adalah m/e 43 yang menunjukkan kebolehjadian yang sangat tinggi untuk terjadi.
96
Fragmen m/e 43 ini dalam reaksi fragmentasi dihasilkan dari proses tata ulang Mc
Lafferty yang menghasilkan radikal C3H7· yang dikenai berkas elektron sehingga
mengeluarkan sepasang elektron menjadi C3H7+.
7. Peak 14
Peak 14 dalam kromatogram memiliki waktu retensi sebesar 24,345
menit dengan 69,11 % area. Area yang besar ini secara kualitatif menunjukkan
kadarnya yang besar dalam isolat, dibandingkan dengan senyawa lain yang
terdeteksi oleh spektrometer massa.
Base peak pada m/e 149 menunjukkan adanya suatu ftalat, yang
didukung oleh pengeluaran air dari selisih m/e 167-149. Sedangkan Selisih m/e
279-167 yaitu 112 merupakan C8H17 yang merupakan alkil yang terikat pada
ftalat. M/e 57 menunjukan C4H9 yang menunjukan bahwa terdapat percabangan
yang menghasilkan ion C4H9+. Oleh karena itu, diusulkan struktur senyawa yang
dianalisis adalah bis-(2-etilheksil) ftalat, yang juga dibuktikan dengan similarity
index sebesar 97 %.
97
C2H5 C2H5
H
O C OH
H
CH2
O O
rH
C2H5
H H
O C O C
C C
H2 H2 C2H5
C2H5
O O
M/e 390
rH
OH C2 H 5
HO OH
OH
O +
H
CH O C
H C C2H5
O H2 C2H5
M/e 279 O
H O
HO
O
+ OH -H2O OH
M/e 167 O M/e 149 O

Gambar 45. Fragmentasi bis-(2-etilheksil) ftalat
Reaksi fragmentasi di atas menunjukkan alasan munculnya beberapa
peak yang timbul dalam spektra. Base peak terjadi pada ion molekul yang paling
stabil. Ion isobenzofuran-1,3-dion yang terbentuk dapat menstabilkan kekurangan
elektron (muatan positif) yang dimiliki karena adanya rangkap konjugasi serta
bentuknya yang menyerupai heterosiklis.
8. Peak 16
Peak 1 dalam kromatogram dengan waktu retensi 25,312 memiliki area
yang cukup yakni 0,98 %, dengan base peak pada m/e 57.
98
Dari spektra (Gambar 46), m/e 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155,
169, 211 menunjukkan pemutusan metil secara berkelanjutan yang menunjukkan
rantai panjang alkil. Base peak m/e 57 merupakan ion molekul C4H9+. Base peak
ini sesuai dengan peak-peak utama alkana yaitu pada C3 dan C4 (Mc Lafferty,
1988). Oleh karena itu diusulkan senyawa oktadekana, yang dibuktikan dengan
nilai similarity index sebesar 95%.
Dari Fragmentasi (Gambar 46) oktadekana didapatkan bahwa besar
kemungkinan untuk mendapatkan semua fragmen alkil (CnH2n+1)yang lebih kecil
dari C18. Hal ini karena kebolehjadian pemutusan tiap ikatan sigma pada rantai
alkana sama besar, oleh karena itu, kebolehjadian untuk mendapatkan berbagai
rantai alkil juga tinggi. Fragmentasi oktadekana sesuai dengan spektra karena
menghasilkan fragmen pada m/e 211, 197, 183, 169, 155, hingga 43.
99
CH3 e- CH3
H3C (CH2)13
H3C (CH2)13
CH3
-CH3 H3C (CH2)13 CH2
H3C (CH2)13
m/e 239
CH2
CH3
-C2H5 H3C (CH2)13
H3C (CH2)13
m/e 225
CH3 H3C (CH2)13
H3 C (CH2)13
-C3H7
m/e 211
(CH2)12
(CH2)12 CH3
-C4H9 H3C CH2
H3 C (CH2)2
m/e 197
(CH2)11
(CH2)11 CH3
-C5H11 H3C CH2
H3C (CH2)3
m/e 183
(CH2)10
(CH2)10 CH3
-C6H13 H3C CH2
H3C (CH2)4
m/e 169
dan seterusnya
Gambar 47. Fragmentasi senyawa 1-oktadekana
Dari 8 peak yang dapat dianalisis, senyawa yang terkandung dalam fraksi
IV ekstrak n-heksana daun binahong, antara lain seperti yang terdapat pada tabel
X di bawah ini:
Tabel XIII. Hasil Kromatografi Gas-Spektrometri Massa
No. TR Area SI
Formula BM Nama dan Struktur Senyawa
Peak (menit) (%) (%)
1 8,190 4,75 95 C10H8 128
Naftalen
100
No. TR Area SI
Formula BM Nama dan Struktur Senyawa
Peak (menit) (%) (%)
3 14,667 0,74 95 C15H30 210

1-pentadekena
4 17,058 1,62 95 C18H36 252

1-oktadekena
OH
8 19, 200 2,62 96 C14H30O 214

4-tetradekanol
10 21,128 2,48 96 C23H48O 340 OH

Trikosil alkohol
11 22,892 2,25 95 C24H48 336

Siklotetrakosana
C2 H5
O O CH
C
H2
69,1 H2
14 24,342 97 C24H38O4 390 C
1 O CH
O
C2H5
Bis-(2-etilheksil)-ftalat
16 25,308 0,98 95 C18H38 254

N-oktadekana
Dari hasil kromatografi gas-spektrofotometer massa, didapatkan bahwa
isolat yang didapatkan mengandung bis-(2-etilheksil)-ftalat serta naftalen, 1-
pentadekena, 1-heptadekena, 1-oktadekena, 4-tetradekanol, trikosil alkohol, dan
n-oktadekana.
H. Spektroskopi Ultraviolet-Visibel (UV-Vis)
Dalam spektroskopi UV-Vis, sampel dikenai energi melalui sinar
ultraviolet maupun sinar tampak (visibel). Senyawa dalam sampel akan menyerap
101
energi dan mengalami transisi elektron dari energi rendah ke posisi energi tinggi.
Transisi ini tergantung dari daerah elektronik molekul senyawa yang terkena sinar
UV-Vis, yang menentukan besarnya energi yang diserap oleh molekul (Sitorus,
2009). Daerah elektronik tercermin adanya gugus polar serta adanya ikatan
rangkap konjugasi. Karena kepolaran dan ada, serta panjang ikatan rangkap
konjugasi tiap senyawa berbeda, energi yang diserap molekul akan berbeda.
Sehingga metode spektroskopi UV-Vis dapat digunakan dalam menganalisis
struktur molekul suatu senyawa yang tidak diketahui.
Isolat pekat yang didapatkan dilarutkan dalam kloroform, kemudian
dibaca absorbansinya dengan spektrometer UV-Vis dari panjang gelombang 200 –
800 nm.
Gambar 48. Spektra UV-Vis isolat dengan pelarut kloroform

102
Tabel XIV. Panjang gelombang maksimum isolat dalam spektra UV-Vis

dengan pelarut kloroform
Panjang gelombang maksimum (nm) Serapan
334,0 0,405
406,0 0,514
429,0 0,567
450,0 0,516
479,0 0,367
661,0 0,012
Dari spektra UV-Vis dengan pelarut kloroform (Gambar 47) didapatkan
bahwa panjang gelombang maksimum lebih dari satu dan berada di sekitar 334 –
661 nm. Panjang gelombang maksimum dibawah 250 nm tidak dapat diamati
dekat dengan UV cut off pelarut yakni kloroform, yang menurut teori berada pada
panjang gelombang 245 nm.
Hasil spektra ini mirip dengan teori bahwa rentang 400 – 450 nm, dengan
dua puncak utama disekitar 450 nm dan dua puncak tambahan pada kedua sisi
puncak yang merupakan spektra dari golongan karotenoid (Harborne, 1984). Oleh
karena itu, spektra yang didapatkan dicocokan dengan teori panjang gelombang
maksimum dari berbagai senyawa karotenoid.
Tabel XV. Spektra UV-Vis beberapa karotenoid dalam pelarut kloroform

Maksimum Spektrum (nm) Maksimum
Spektrum
Pigmen Harborne Goodwin O’Neil, dkk
Perhitungan
(1984) (1954) (2001)
(nm)
Hidrokarbon
 α-karotena −, 454, 485 420, 445, 475 485, 454 447,5
 β-karotena −, 466, 497 450, 480, 497, 466 453,3
 γ-karotena 447, 475, 508 435, 460, 490, 508,5, 475, 446 453,3
 δ-karotena - 503, 485, 456 - 441,8
 ε-karotena 418, 442 - - 438,3
 likopena 456, 485, 520 - - 453,3
103
Maksimum Spektrum (nm) Maksimum

Spektrum
Pigmen Harborne Goodwin O’Neil, dkk Perhitungan
(1984) (1954) (2001) (nm)
Xantofil
 lutein 428, 456, 487 487, 456, 428, 481, 453, 333 447,5
 violaxantin 424, 452, 482 482, 451,5, 424 - 438,3
 zeaxantin 429, 462, 494 494, 462, 429 - 453,3
 rubixantin 439, 474, 509 - 509, 474, 439 453,3
 kriptoxantin 433, 463, 497 497, 463, 433, 452, 480 448,3
 flavoxantin - 459, 430 459, 430 419,2
- 546, 510, 482 - 459,8
 rodhoxantin
Dari tabel dapat dilihat bahwa yang paling sesuai dan paling mendekati
dengan panjang gelombang maksimum dalam spektra isolat adalah lutein, yaitu:
1. peak pada panjang gelombang 428 nm yang sama dengan Harborne
(1984), Goodwin (1954), serta berselisih 1 nm dengan O’Neil, dkk (2001) yaitu
429 nm,
2. peak pada panjang gelombang 334 nm sesuai dengan O’Neil, dkk
(2001) yaitu 333 nm,
3. peak pada panjang gelombang 479 nm hanya berselisih 2 nm dengan
O’Neil, dkk (2001) yaitu 481 nm,
4. peak panjang gelombang 450 nm mendekati nilai panjang gelombang
teoretis yang dihitung menurut persamaan Fieser-Kuhn yaitu 447,5 nm. Peak ini
juga mendekai nilai panjang gelombang lutein menurut O’Neil, dkk (2001) yaitu
453 nm.
OH
HO
Gambar 49. Struktur lutein

104
Oleh karena itu, dapat diduga kuat bahwa fraksi IV ekstrak n-heksana
daun binahong mengandung lutein.
Selain dengan pelarut kloroform, isolat juga dibaca absorbansinya
dengan spektrometer UV-Vis dengan pelarut metanol. Hal ini dilakukan karena
kloroform memiliki UV cut off yang lebih besar dari metanol yaitu 205 nm,
sehingga dapat diamati profil UV-Vis isolat dibawah panjang gelombang 250 nm.
Gambar 50. Spektra UV-Vis isolat dengan pelarut metanol
Tabel XIV. Panjang gelombang maksimum isolat dalam spektra UV-Vis

dengan pelarut metanol
Panjang gelombang maksimum (nm) Serapan
267,5 0,928
273,5 0,921
365,0 0,497
395,0 0,484
418,0 0,421
661,0 0,017
Dari spektra UV-Vis dengan pelarut metanol didapatkan adanya peak
yang berhimpit pada panjang gelombang 267,5 nm dan 273,5 nm. Peak pada
105
panjang gelombang 273,5 nm ini menunjukkan adanya suatu senyawa yang
memiliki kerangka steroid yaitu kolesta-2,4-diena (Supratman, 2010).
Adapun perhitungan panjang gelombang maksimum menurut aturan
Woodward adalah sebagai berikut:
Harga dasar diena homoanular = 253 nm
3 residu cincin = 15 nm
1 ikatan rangkap di luar lingkar (eksosiklik) =5 nm +
λ maks (perhitungan) = 273 nm
λ maks (pengamatan) = 273,5 nm
Gambar 51. Kerangka kolesta-2,4-diena
Dari hasil perhitungan didapatkan bahwa panjang gelombang maksimum
teoretis kolesta-2,4-diena adalah 273 nm, sedangkan panjang gelombang
maksimum pengamatan adalah 273,5 nm. Perbedaan panjang gelombang teoretis
dan pengamatan yang diperbolehkan adalah sebesar 2 nm (Supratman, 2010).
Oleh karena selisih panjang gelombang teoretis dan pengamatan adalah 0,5 nm,
maka dapat disimpulkan bahwa isolat mengandung steroid dengan kerangka
kolesta-2,4-diena.
106
I. Analisis Hasil
Dari hasil uji fitokimia didapatkan bahwa fraksi IV ekstrak n-heksana
daun binahong mengandung senyawa dari golongan steroid. Senyawa ini tidak
dapat teridentifikasi dengan kromatografi gas-spektrometer massa (KG-MS)
karena titik didihnya yang tinggi sehingga sukar menguap pada sistem
kromatografi dan tidak terdeteksi oleh spektrometer massa. Senyawa golongan
steroid juga sukar diidentifikasi dengan spektrometer UV-Vis karena panjang
gelombang maksimum kerangka steroid yang berada disekitar 230 – 290 nm
(Supratman, 2010), karena berada dekat dengan UV cut off pelarut kloroform.
Pada spektrometer UV-Vis dengan pelarut metanol didapatkan adanya senyawa
dengan kerangka kolesta-2,4-diena yang dapat mengindikasikan adanya suatu
senyawa golongan steroid yang menguatkan uji fitokimia.
Dari hasil kromatografi gas-spektrometer massa didapatkan bahwa isolat
mengandung bis-(2-etilheksil) ftalat, naftalen, 1-pentadekena, 1-heptadekena, 1-
oktadekena, 4-tetradekanol, trikosil alkohol, dan n-oktadekana. Ftalat dan naftalen
yang terdapat pada isolat diduga kuat berasal dari pengotor pada silika gel yang
digunakan pada proses kromatografi lapis tipis preparatif yang menggunakan
silika gel yang berfuorosensi. Jenis pengotor ini ditegaskan oleh Székely (1983)
dengan menganalisis silika gel pada pelat silika dengan metode gravimetri,
spektrofotometri inframerah, dan spektrofotometri resonansi magnetik inti
hidrogen yang mendapatkan adanya ftalat dan poliester. Selain itu, Hostettmann,
Hostettmann, dan A. Marston (1995) menyebutkan adanya suatu senyawa
fluoresen yang berfungsi sebagai pendeteksi dalam KLT. Oleh karena naftalen
107
memiliki sifat sebagai fluoresens maka dapat disimpulkan bahwa naftalen
merupakan pengotor dalam isolat.
Dari hasil spektrofotometri UV-Vis diduga bahwa isolat mengandung
senyawa golongan tetraterpenoid yaitu lutein. Serapan yang diduga merupakan
serapan dari lutein tidak terganggu oleh serapan bis-(2-etilheksil) ftalat dan
naftalen. Hal ini karena ftalat tercermin dalam spektra pada 315 nm yang terlihat
dalam spektra sebagai suatu bagian dalam peak. Sedangkan naftalen dengan
panjang gelombang 278 dapat dilihat dalam spektra yang muncul berdampingan
dengan UV cut off kloroform dan tidak muncul pada spektra UV-Vis isolat
dengan pelarut metanol.
Lutein merupakan xantofil atau suatu pigmen berwarna yang sering
terdapat pada daun. Lutein merupakan senyawa yang mengandung 40 atom
harbon dengan dua gugus hidroksil, sehingga cenderung non-polar dan larut
dalam n-heksana. Lutein tidak terdeteksi oleh KG-MS karena memiliki titik didih
yang tinggi sehingga tidak menguap pada sistem kromatografi gas.
Dari hasil penelitian didapatkan bahwa dalam isolat masih terdapat
campuran yakni senyawa golongan steroid, bis-(2-etilheksil) ftalat, naftalen, 1-
pentadekena, 1-heptadekena, 1-oktadekena, 4-tetradekanol, trikosil alkohol, dan
n-oktadekana dan lutein. Campuran ini, dengan spektrometer massa, spektrometer
inframerah, dan spektrometer resonansi magnetik inti, tidak dapat teridentifikasi
senyawa-senyawa didalamnya. Untuk mendeteksi keseluruhan campuran
dibutuhkan suatu metode yang dapat memisahkan senyawa-senyawa tersebut
yaitu kromatografi cair kinerja tinggi-spektrometer massa. Atau dapat dilakukan

108
isolasi lanjutan dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi preparatif
sehingga lebih murni, dan dapat dilakukan elusidasi struktur dengan spektrometer
inframerah untuk mengetahui gugus fungsional senyawa dan spektrometer
resonansi magnetik inti karbon untuk mengetahui kerangka karbon yang menjadi
penyusun senyawa tersebut.
Penelitian ini mendapatkan kandungan senyawa dalam fraksi IV ekstrak
n-heksana daun binahong yaitu senyawa golongan steroid yang terbukti dengan
teridentifikasinya kerangka karbon cholesta-2-diena, lutein yang merupakan
golongan karotenoid, serta senyawa golongan alkohol, alkana, dan alkena. Hasil
penelitian ini sesuai dengan hipotesis yang diajukan dimana didapatkan senyawa
yang merupakan golongan steroid dan karotenoid, sedangkan triterpen dan
saponin tidak teridentifikasi dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong.

BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Pada penelitian ini dapat disimpulkan bahwa: Isolat yang didapatkan dalam
proses isolasi dari fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong mengandung senyawa
golongan steroid dengan kerangka kolesta-2,4-diena, lutein, 1-pentadekena, 1-
heptadekena, 1-oktadekena, 4-tetradekanol, trikosil alkohol, dan n-oktadekana.
B. Saran
Perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut mengenai kandungan senyawa
dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun binahong. Identifikasi dapat dilakukan
dengan memisahkan lagi isolat yang didapatkan, dengan metode kromatografi cair
kinerja tinggi preparatif (KCKTP) yang memiliki daya pisah yang lebih baik dari
KLTP.
109
DAFTAR PUSTAKA
Ansel, H.C., 2005, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, Edisi keempat,

diterjemahkan oleh Ibrahim, Farida, Hal. 605-619, Penerbit Universitas
Indonesia, Jakarta.
Astuti, S. M., 2011, Determination of Saponin Compound from Anredera

cordifolia (Ten) Steenis Plant (Binahong) to Potential Treatment for
Several Diseases, Journal of Agricultural Science, Vol. 3, No.4, 224-232.
Backer, C.A., and Van den Brink Jr, R.C.B., 1965, Flora of Java, Volume 1, The
Rijksherbarium, Leyden, Netherlands.
Barboza, G.E., Cantero, J.J., Nunez, C., Pacciaroni, A., and Espinar, L.A., 2009,
Medicinal Plants: A General Review and a Phytochemical and
Ethnopharmacological Screening of the Native Argentine Flora, Tomo,
34 (1-2), 7-365.
Basset, J., Denney, R. C., Jeffery, G. H., Mendham, J., 1994, Buku Ajar Vogel
Kimia Analisis, diterjemahkan oleh Hadyana Pudjaatmaka, L. Setiono,
hal. 167 Penerbit Buku Kedokteran, EGC, Jakarta.
Bruneton, J., 1999, Pharmacognosy: Phytochemistry Medicinal Plants, 2nd

edition, 123-133, 225-231, 310-322, 463-1065, Lavoisier Publishing Inc.,
U.S.A.
Burke, R.W., Diamondstone, B.I., Velapoldi, R.A., dan Menis, O., 1974,
Mechanisms of the Liebermann-Burchard and Zak Color Reactions for
Cholesterol, Clicical Chemistry, Vo. 20, No. 7, 794-801.
Colegate, S.M, and Molyneux, R. J., 1993, Bioactive Natural Products;

Detection, Isolation, and Structural Determination, pp. 26-33.
Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope

Indonesia, edisi IV, hal 7, Departemen Kesehatan Republik Indonesia,
Jakarta.
Djamil, R., Wahyudi, P.S., Wahono, S., dan Hanafi M., 2012, Antioxidant
Activity of Flavonoid form Anredera cordifolia (Ten) Steenis Leaves,
International Research Journal of Pharmacy, 3 (9), 241-243.
Du’a, W., 2012, Identifikasi Fraksi I Ekstrak N-Heksan Daun Binahong (Anredera
cordifolia (Ten.) Steenis), Skripsi, 53-82, Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta.
110
111
Facrhiyah, E., dan Kusrini, D., 2012, Isolasi, Identifikasi, dan Uji Sitotoksik
Senyawa Steroid dari Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.)
Steenis), Skripsi, 1, Universitas Diponegoro, Semarang.
Garrett, S.J., 1998, CEM 333, Instrumental Analysis, page 16.13, Michigan State
University, Michigan.
Goodwin, T.W., 1954, Carotenoids; Their Comparative biochemistry, Hal. 1-69,

Chemical Publishing Co., Inc., New York.
Gritter, R.J., Bobbit, J.M., and Schwarting, A.E., 1991, Pengantar Kromatografi,
Edisi kedua, 5-179, Penerjemah Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB,
Bandung
Gross, J.H., 2004, Mass Spectrometry, A Textbook, 223-330, Springer, Berlin.
Harborne, J. B., 1984, Metode Fitokimia; Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., dan Soediro, Iwang,
hal. 1-169, 234-264, Penerbit ITB, Bandung.
Ho, Chi-Tang, dan Shahidi, Fereidoon, 2000, Phytochemicals and

Phytopharmaceuticals, AOCS Press, USA, pp. 54-59.
Hostettmann, K., Hostettmann, M., dan Marston, A., 1995, Cara Kromatografi
Preparatif; Penggunaan pada Isolasi Senyawa Alam, 1-11,
diterjemahkan oleh Padmawinata, Kosasih, Penerbit ITB, Bandung.
Kosela, S., 2010, Cara Mudah dan Sederhana, Penentuan Struktur Molekul
Berdasarkan Spektra Data (NMR, Mass, IR, UV), hal. 137-178, 201-226,
Lembaga Penerbit Fakultas Ekonomi Universitas Indonesia, Jakarta.
Khunaifi, M., 2010, Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Binahong (Anredera
cordifolia (Ten.) Steenis) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus dan
Pseudomonas aeruginosa., skripsi, Universitas Islam Negeri Malana
Malik Ibrahim, Malang.
Levita, J., Musfiroh, I., Mustarichie, R., 2011, Metode Penelitian Tanaman Obat,
Teori dan Implementasi Penelitian Tanaman untuk Pengobatan, 9-20,
43, Widya Padjajaran, Bandung.
Li, T.S.C., 2006, Taiwanese Native Medicinal Plants, Phytopharmacology and

Therapeutic Values, 15, Taylor & Francis, LLC, USA.
Manoi, F., 2009, Binahong (Anredera cordifolia) Sebagai Obat, Warta Penelitian
dan Pengembangan Tanaman 4 Industri, Volume 15 Nomor 1.
Mclafferty, F.W., 1988, Interpretasi Spektra Massa, edisi ketiga, penerjemah

Hardjono Sastrohamidjojo, UGM press, Yogyakarta, pp. 150-176.
112
McNair, H.M., dan Bonelli, E.J., 1988, Dasar Kromatografi Gas, diterjemahkan
oleh Kosasih Padmawinata, hal. 1-13, Penerbit ITB, Bandung
Muhamad, 2011, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Triterpenoid Aktif Sebagai

Antimikroba dari Ekstrak Metanol Daun Binahong (Anredera cordifolia
(Ten.) Steenis), Skripsi, Universitas Airlangga, Surabaya.
Narender, T., Khaliq, T., and Mahur, G., 2011, Naturally Occurring
Antihyperglycemic and Antidyslipidemic Agents, Opportunity,
Challenge, and Scope of Natural Products In Medicinal Chemistry, 155-
185.
O’Neil, M.J., Smith, A., Heckelman, P.E., Obenchain, J.R., Gallipeau, J.A.R.,
D’Arecca, M.A., dan Budavari, S., 2001, The Merk Index; An
Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, 13th edition, 313,
456, 617, 724, 1007-1009, 1142, 1321, 1488, 1782, 1795-1796, 1807-
1808, Merck Research Laboratories, USA.
Popl, M., Fähnrich, J., and Tatar, V., 1990, Chromatographic Analysis of
Alkaloids, 279-282, Marcel Dekker, Inc., New York, USA.
Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, edisi pertama, Hal. 1-5, 45-
53, Graha Ilmu, Yogyakarta.
Rachmawati, S. 2007. Studi Makroskopi, Dan Skrining Fitokimia Daun Anredera

Cordifolia (Ten.) Steenis. Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Airlangga,
Surabaya.
Saroh, Y.N., Winarti, W., dan Djamil, R., 2012, Isolasi dan Elusidasi Senyawa Kimia
Aktif Dalam Fraksi 7 Fase Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Binahong
(Anredera cordifolia (Ten.) Steenis), Sripsi, 1, Universitas Pancasila,
Jakarta.
Silverstein, R.M., Webster, F.X., dan Kiemie, D.J., 2005, Spectrometric

Identification of Organic Compound, Seventh Edition, 19-24, John Wiley
& Sons, Inc., USA
Sitorus, M., 2009, Spektroskopi; Elusidasi Struktur Molekul Organik, 1-27 dan
69-89, Graha Ilmu, Yogyakarta.
Smith, G.V., Lawson, B.E., Turnbull, I., and Downey, P.O., 2007, Review, The
Biology of Australian Weeds: Anredera cordifolia (Ten.) Steenis, Plant
Protection Quarterly, Vol. 22, (1), 2-10.
Supratman, U., 2010, Elusidasi Struktur Senyawa Organik, Metode Spektroskopi

untuk Penentuan Struktur Senyawa Organik, hal. 1-58, 260-315, Widya
Padjajaran, Bandung.
113
Stahl, E., 1973, Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi,

diterjemahkan oleh Padmawinata, K., dan Soediro, Iwang, Hal. 3-18,
Penerbit ITB, Bandung
Starr, F., Starr, K., and Loope, L., 2003, Anredera cordifolia, hal. 1, United States
Geological Survey-Biological Resources Division, Hawai.
Teniente, L.M., 2010, Use of Elicitors as an Appproach for Sustainable

Agriculture, African Journal of Biotechnology, Vol. 9 (54), 9155-9162.
Titis, M., Fachriyah, E., dan Kusrini, D., 2013, Isolasi, Identifikasi, dan Uji
Aktifitas Senyawa Alkaloid Daun Binahong (Anredera cordifolia
(Tenore) Steenis), Chem Info, Vol.1, No. 1, 196-201.
Tsai, J.Y., Huang J.K., Wu, T.T., and Lee, Y.H., 2005, Comparison of Oxalate
Content in Foods and Beverages in Taiwan, JTUA, Vo. 16, No. 3, 93-98.
Vinayavekhin, N., and Saghatelian, A., 2010, Untargeted Metabolomics, Current

Protocols in Molecular Biology 30.0.1, www.interscience.wiley.com,
diakses tanggal 12 Februari 2012.
Wibisono, R.S., 2010, Penetapan Kadar Asam Ursolat Dalam Ekstrak Daun
Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) Dengan Metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik, hal 23-38,
Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Yang, R.Y., Lin, S., and Kuo, G., 2008, Content and Distribution of Flavonoids
Among 91 Edible Plant Species, Asia Pac. J. Clin. Nutr., Vol. 17, 275-
279.
LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Determinasi Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)
114
115
Lampiran 2. Perhitungan Rendemen Ekstrak
I. Penimbangan Ekstrak Kental
Berat wadah ekstrak kosong = 129,21 gram
Berat wadah ekstrak + ekstrak kental = 218,86 gram
Berat Ekstrak = 89,65 gram
II. Perhitungan Rendemen Ekstrak

Rendemen = × 100%

,
= × 100 %
,
= 9,11 %
Lampiran 3. Perhitungan kepolaran fase gerak kloroform:methanol (1:1)
Kepolaran kloroform:methanol (1:1)

=
× +(

× )
= × 4,1 + ( × 5,1)
= 4,8
Lampiran 4. Contoh Perhitungan Rf pada kromatografi lapis tipis

Rf =
Kromatografi Lapis Tipis Uji Kemurnian Isolat
I. Fase gerak kloroform

,
Rf = = 0,18
116
II. Fase gerak kloroform : metanol (1:1)

,
Rf = = 0,55
III. Fase gerak metanol

,
Rf = = 0,58
Lampiran 5. Hasil Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)
I. Kromatogram KG-SM
117
II. Kondisi KG-SM

118
119
III. Spektra Massa

120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
Lampiran 6. Spektra Ultraviolet-Sinar Tampak (UV-Vis)

142
Lampiran 7. Perhitungan Panjang Gelombang Maksimum Teoretis
Berdasarkan Teori Fieser-Kuhn
Rumus dasar:
max( ) = 114 + 5 + (48,0 − 1,7 ) − 16,5 − 10
max( ) = (1,74 × 10 )
Dimana;
M = jumlah substituent alkil atau yang menyerupai alkil pada sistem konjugasi
N = jumlah dari ikatan rangkap terkonjugasi
Rendo = jumlah cincin dengan ikatan rangkap dalam pada sistem konjugasi
Rexo = jumlah cincin dengan ikatan rangkap di luar cincin pada sistem konjugasi
1. α-karotena
M=8, n=10, Rendo=1, dan Rexo=0
max( ) = 114 + (5 × 8) + 10(48,0 − 1,7 × 10) − 16,5 × 1 − 10 × 0
max( ) = 447,5
2. β-karotena

143
max( ) = 114 + (5 × 10) + 11(48,0 − 1,7 × 11) − 16,5 × 2 − 10 × 0
max( ) = 453,3
3. γ-karotena
max( ) = 114 + (5 × 10) + 11(48,0 − 1,7 × 11) − 16,5 × 2 − 10 × 0
max( ) = 453,3
4. δ-karotena
max( ) = 114 + (5 × 10) + 13(48,0 − 1,7 × 13) − 16,5 × 1 − 10 × 0
max( ) = 441,8
5. ε-karotena
max( ) = 114 + (5 × 6) + 9(48,0 − 1,7 × 9) − 16,5 × 0 − 10 × 0
max( ) = 438,3
144
6. Likopena
M=10, n=11, Rendo=2, Rexo=0
max( ) = 114 + (5 × 10) + 11(48,0 − 1,7 × 11) − 16,5 × 2 − 10 × 0
max( ) = 114 + 50 + 322,3 − 33
max( ) = 453,3
7. Lutein
OH
HO
max( ) = 114 + (5 × 8) + 10(48,0 − 1,7 × 10) − 16,5 × 1 − 10 × 0
max( ) = 447,5
8. Violaxantin
OH
HO
max( ) = 114 + (5 × 6) + 9(48,0 − 1,7 × 9) − 16,5 × 0 − 10 × 0
max( ) = 438,3
145
9. Zeaxantin
OH
HO
max( ) = 114 + (5 × 10) + 11(48,0 − 1,7 × 11) − 16,5 × 2 − 10 × 0
max( ) = 453,3
10. Rubixantin
HO
max( ) = 114 + (5 × 10) + 11(48,0 − 1,7 × 11) − 16,5 × 2 − 10 × 0
max( ) = 453,3
11. Kriptoxantin
HO
max( ) = 114 + (5 × 9) + 11(48,0 − 1,7 × 11) − 16,5 × 2 − 10 × 0
max( ) = 448,3
146
12. Flavoxantin
O
OH
HO
max( ) = 114 + (5 × 6) + 8(48,0 − 1,7 × 8) − 16,5 × 0 − 10 × 0
max( ) = 419,2
13. Rodhoxantin
O
max( ) = 114 + (5 × 12) + 14(48,0 − 1,7 × 14) − 16,5 × 2 − 10 × 2
max( ) = 459,8
BIOGRAFI PENULIS
Margaretha Efa Putri lahir di Kupang – Nusa

Tenggara Timur pada tanggal 30 Maret 1991. Anak pertama
dari empat bersaudara dari pasangan Tri Daryono dan Dra.
Elisabeth Sukanti Widiharsani. Penulis skripsi yang berjudul
“Identifikasi senyawa dalam fraksi IV ekstrak n-heksana daun
binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)” ini pernah
menempuh pendidikan di Taman Kanak-kanak St. Yoseph,
Kupang pada tahun 1995-1997. Dilanjutkan ke Sekolah Dasar
Katolik St. Yoseph III Kupang pada tahun 1997-2003.
Pendidikan Menengah dilakukan di Sekolah Menengah
Pertama Katolik Sta. Theresia, Kupang pada tahun 2003-2006 dan pada tahun
2006-2008 melanjutkan di Sekolah Menengah Atas (SMA) Katolik Giovanni,
Kupang. Setamat dari SMA, penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi
Sanata Dharma pada Tahun 2008.
Selama menempuh kuliah, penulis aktif dalam beberapa kegiatan

kemahasiswaan, yaitu panitia dalam Pembekalan Liturgi dan Kepanitiaan Tim
Kerja Paskah 2009, panitia Seminar POFASADHA “MEMAHAMI ANAK
MUDA” 2009, koordinator sie dana dan usaha dalam Pelepasan Wisuda Fakultas
Farmasi “DAN CERITA DIMULAI…” 2010, serta panitia pelantikan apoteker
angkatan XX tahun 2011. Selain itu, penulis juga aktif dalam kegiatan akademik
dengan menjadi Asisten Dosen Praktikum Kimia Dasar tahun 2009, Kimia
Organik tahun 2010, Formulasi Teknologi Sediaan Solid tahun 2012, dan Analisis
Kosmetik Farmasi Fisika pada tahun 2012.
147

Full

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Full

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

IDENTIFIKASI SENYAWA DALAM FRAKSI IV EKSTRAK

N-HEKSANA DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi

Program Studi Farmasi

Margaretha Efa Putri

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

IDENTIFIKASI SENYAWA DALAM FRAKSI IV EKSTRAK

N-HEKSANA DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi

Program Studi Farmasi

Margaretha Efa Putri

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

“Dalam hal inilah Bapa-Ku dipermuliakan,

Karya Kecil ini KupersembahKan untuK:

Guru sejatiku, Yesus, yang senantiasa mengajar, membimbing, dan

Serta adik-adikku tersayang, Satrio, Hiro, dan Agung yang terus

dengan berkat dan pertolongan-Nya, penulis dapat menyelesaikan penelitian dan

penyusunan skripsi yang berjudul ”Identifikasi Senyawa Fraksi IV Ekstrak n-

Heksana Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)”. Skripsi ini

Selama penelitian hingga penyusunan skripsi ini, penulis banyak

mendapat bantuan dari berbagai pihak berupa bimbingan, pengarahan, saran,

dukungan, maupun sarana. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan

penghargaan dan ucapan terima kasih kepada:

memberikan petunjuk, saran, arahan, dan bimbingan kepada penulis dalam

proses penyusunan skripsi ini,

demi kesempurnaan skripsi ini,

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta,

4. Bapak-bapak Laboran dan staf laboratorium yang telah membantu dalam

proses penyelesaian skripsi di laboratorium Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta,

5. Bapak Supoyo, selaku laboran di laboratorium Gas Chromatography-Mass

Spectrometer (GC-MS) Fakultas MIPA Universitas Gadjah Mada, yang telah

membantu proses pengerjaan kromatografi gas-spektrometri massa serta

diskusi yang membantu dalam pengerjaan penelitian ini,

duka selama proses pengerjaan skripsi,

7. Wilfrida, teman sekelompok skripsi yang telah membantu dan menemani

selama proses pengerjaan skripsi,

sampel daun binahong,

9. Seluruh teman-teman dari fakultas farmasi USD, khususnya kelas B angkatan

10. Semua teman-teman, yang selalu mendukung, menemani dan menyemangati

dapat disebutkan satu per satu.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan

dan kelemahan karena keterbatasan kemampuan dan pengalaman penulis. Untuk

serta turut member sumbangan pada perkembangan ilmu pengetahuan.

HALAMAN JUDUL ........................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.................................... ii

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN .............................................................. iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................... v

PERNYATAAN PERSTUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ...... vi

PRAKATA .......................................................................................... vii

DAFTAR ISI ....................................................................................... ix

DAFTAR TABEL ............................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................ xvii

INTISARI ............................................................................................ xviii

ABSTRACT .......................................................................................... xix

BAB I PENGANTAR .......................................................................... 1

A. Latar Belakang Masalah ................................................................. 1

C. Keaslian Penelitian ......................................................................... 5