Skripsi
Oleh:
Dina Christiana Dewi
NIM : 088114014
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2012
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Skripsi
Oleh:
Dina Christiana Dewi
NIM : 088114014
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2012
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
Kupersembahkan karyaku ini untuk kedua orang tuaku Yohanes Agus Yunanto,
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah melindungi
Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Yogyakarta.
dukungan, bantuan, dan motivasi dari banyak pihak. Penulis mengucapkan terima
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
saran, masukan, kritikan dan solusi kepada penulis selama penyusunan skripsi
ini.
3. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan masukan, kritik, solusi dan motivasi kepada penulis untuk skripsi
ini.
masukan, kritik, saran dan solusi yang bermanfaat kepada penulis untuk skripsi
ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5. Ibu Rini Dwi Astuti, M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi
penelitian.
7. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu dan pengalaman sehingga berharga
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, terutama Mas Bimo, Pak Parlan, dan
10. Keluargaku tercinta, Bapak Agus Yunanto, Ibu Sri Mulyani, Mas Mada
Prabawa yang tidak pernah berhenti memberikan semangat dan doa sampai
11. DF. Fani Rista Maji, Bernadet Brigita dan Leonardus Damar yang selalu
12. Ayesa Syenina dan Amelia Ernesta selaku teman seperjuangan, sahabat dan
teman berbagi cerita, terima kasih atas semangat, perhatian, motivasi, diskusi
13. Teman-teman skripsi nikotin KLT-Densito: Novi, Citra, Helen atas diskusi,
14. Teman-teman di laboratorium : Felicia, Prasilya, Sasa, Susan, Nona, Sari, Tere
15. Teman-teman KKN Alternatif XXXIX Tematik di Desa Pariwiata Pindul atas
16. Teman-teman FST-A dan kelompok praktikum A, terima kasih atas kerjasama,
17. Teman-teman Fakultas Farmasi angkatan 2008, terima kasih atas pengalaman,
19. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran
untuk membantu penulis dalam penyempurnaan skripsi ini. Akhir kata, semoga
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL................................................................................... i
INTISARI.................................................................................................... xix
ABSTRACT ................................................................................................ xx
1. Permasalahan ................................................................................ 4
2. Keaslian Penelitian........................................................................ 4
A. Tembakau ............................................................................................. 6
a. Akar .......................................................................................... 6
b. Batang ...................................................................................... 6
c. Daun ......................................................................................... 6
d. Bunga ....................................................................................... 6
e. Buah ......................................................................................... 7
3. Tanaman C3 .................................................................................. 7
B. Nikotin ................................................................................................. 9
1. Simplisia .......................................................................................... 11
b. Penyejunan .................................................................................. 11
3. Curing .............................................................................................. 12
a. Penguningan .............................................................................. 12
C. Ekstraksi ............................................................................................... 13
1. Ekstrak .......................................................................................... 13
2. Ekstraksi ........................................................................................ 13
4. Soxhlet .......................................................................................... 14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
D. Spektrofotometri UV............................................................................ 15
1. Transisi * ............................................................................ 16
2. Transisi n * ............................................................................. 16
F. Landasan Teori..................................................................................... 22
G. Hipotesis .............................................................................................. 23
B. Variabel ................................................................................................ 24
A. Kesimpulan...................................................................................... 54
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
B. Saran .............................................................................................. . 54
LAMPIRAN ................................................................................................ 58
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
Gambar 14. Grafik hubungan antara konsentrasi analit dengan AUC .... 37
DAFTAR LAMPIRAN
INTISARI
ABSTRACT
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
tanaman tembakau (Nicotiana tabacum) dengan kadar 0,3 sampai 5% dari berat
kering tembakau dari hasil biosintesis di akar dan terakumulasi di daun (Anonim,
(Anonim, 2006).
VBN ditanam pada bulan Juni mulai panen bulan Juli, diberikan waring
pada pertengahan bulan September dan mulai panen akhir Oktober, tidak
jika tidak ada hujan tetap diberikan pengairan buatan. Naungan mempengaruhi
intesitas cahaya matahari pada tanaman tembakau yang berpengaruh pada kadar
nikotin.
ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO dan mengetahui perdebaan kadar
nikotin dalam ekstrak etanolik kedua daun tembakau. Daun tembakau diektraksi
diperlukan lebih sedikit daripada metode ekstraksi lainnya, proses sirkulasi yang
yang digunakan adalah etanol karena dapat melarutkan alkaloid basa, panas yang
multikomponen dengan hasil pemisahan yang baik, dan waktu yang relatif
kromofor dan memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang teoritis 262
nm (Cordell, 1981).
penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau yang meliputi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
tahap optimasi dan validasi metode. Pada penelitian tentang optimasi metode
penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau dengan metode
KCKT fase terbalik menggunakan kolom fase diam oktadesilsilan (C18) dan fase
1,5679, tailing factor 1,25, jumlah lempeng teoritis 2247,163 dan nilai HETP
0,0111 (Ernesta, 2011). Pada tahap validasi penetapan kadar nikotin dalam
ekstrak etanolik daun tembakau dengan metode KCKT fase terbalik memenuhi
parameter selektivitas dengan nilai resolusi (Rs) 1,531, linearitas dengan nilai
koefisien korelasi (r) 0,9996, presisi dan akurasi pada konsentrasi 0,05 dan 0,09
1. Permasalahan
antara lain:
a. berapakah kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO?
b. apakah kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO
berbeda bermakna?
2. Keaslian Penelitian
nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO dengan metode
KCKT fase terbalik belum pernah dilakukan. Penelitian tentang penetapan kadar
nikotin yang pernah dilakukan adalah penetapan kadar nikotin dalam sampel
3. Manfaat penelitian
informasi dalam dunia farmasi dan masyarakat tentang kadar nikotin dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO dengan metode kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik dan perbandingan kadar antara kedua jenis
tembakau tersebut.
B. Tujuan Penelitian
a. kadar nikotin yang terdapat dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Tembakau
1. Keterangan Botani
2. Deskripsi tanaman
kedalaman 50-75 cm, akar serabutnya dapat menyebar ke samping dan memiliki
bulu-bulu akar. Perakaran akan berkembang baik jika tanahnya gembur, mudah
menyerap air
lunak tetapi kuat, semakin ke ujung semakin kecil. Ruas-ruas batang mengalami
daun agak bergelombang dan licin. Lapisan atas daun terdiri atas lapisan palisade
parenkim dan spongy parenkim pada bagian bawah. Jumlah daun dalam satu
tandan, kelopak banyak buluh dengan banyak gigi yang tidak sama panjang,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
mahkota bunga yang berbentuk terompet, tepinya berlekuk 5, panjang yang tidak
dasar bunga dan terdiri atas dua ruang yang dapat membesar. Jika masak pecah
3. Tanaman C3
respirasi suatu. Kebutuhan intesitas cahaya berbeda untuk setiap jenis tanaman
dikenal tiga tipe tanaman yaitu : C3, C4 dan CAM. Tanaman C3 adalah kelompok
atom C pada proses pengikatan C02 oleh yang terjadi secara spontan sehingga
tanaman tersebut sebesar 70% (PT. Perkebunan Nusantara XIX (Persero), 1998).
a
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b
Gambar 1. Daun tembakau (a) VBN dan (b) NO (PT. Perkebunan XIX, 1998)
B. Nikotin
CH3
apabila terkena paparan sinar matahari dan udara. Berbau tajam serasa terbakar.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Sangat larut dalam alkohol, kloroform, eter, petroleum eter, kerosin, dan minyak
Nikotin
N- N+
CH3
H
Asetilkolin
O_
H2 H2
CH3 C O C C N+(CH3)3
Gambar 4. Struktur nikotin dan asetilkolin (Domino, 1999)
nikotin yang merupakan pendonor elektron yang memiliki kesamaan dengan keto
oksigen pada gugus asetilkolin. Muatan positif atom N kuarterner pada asetilkolin
(Domino,1999).
neurotransmiter yang berperan dalam regulasi sistem saraf tubuh dan membawa
pesan dari ke otak. Nikotin di dalam tubuh mampu menyalin asetilkolin, sehingga
juga. Dengan cara ini, nikotin dapat memicu pelepasan neurotransmiter lain.
dipecah dalam proses glikolisis menjadi asam piruvat. Asam piruvat akan
dirombak untuk masuk dalam siklus krebs menjadi asetil Co-A. Asetil Co-A
Ross, 1995).
1. Simplisia
belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain simplisia
Makanan, 1979).
di tempat yang teduh disortasi terlebih dahulu sebelum tahap pengolahan daun.
bagian pangkal gagang daun/ibu tulang daun atau pada bagian ruas batang di
antara dua dua daun. Tujuan dari penyejunan yaitu : memudahkan dalam penataan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dari kadar air 80-90% menjadi 10-15% dan perubahan warna dari zat hijau daun
kuning karena hilangnya zat hijau daun ke zat kuning daun dan terjadi penguraian
zat tepung menjadi gula. Perubahan ini terjadi pada suhu 32-42ºC berlangsung
orange dari lembar daun sampai tulang daun, maka secara perlahan suhu
dinaikkan. Suhu yang digunakan 43-52ºC waktu yang diperlukan sekitar 18 jam
kadar air di dalam lembar daun dengan cara menaikkan suhu 53-62ºC. Ciri-ciri
proses ini, daun sudah terasa kering apabila dipegang, namun tulang daun masih
terasa basah, daun terlihat keriput atau keriting. Waktu yang dibutuhkan lebih
memerlukan waktu normal 30-32 jam. Ciri-ciri tahapan ini selesai apabila seluruh
tulang daun sudah kering dan jika ditekuk batangnya akan patah dan berbunyi
D. Ekstraksi
1. Ekstrak
aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang
sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau
serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah
menyari bahan tumbuhan dengan pelarut tertentu. Terdapat beberapa jenis ekstrak
yaitu : ekstrak cair, ekstrak kental, dan ekstrak kering (Saifudin, 2011).
2. Ekstraksi
penarikan zat aktif yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat
larut dengan pelarut cair. Pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat dapat
maka ekstraksi tidak akan sempurna karena terjadi kesetimbangan antara larutan
zat aktif di luar sel dan larutan zat aktif di dalam sel (Direktorat Jendral
3. Cairan Penyari
Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut : murah dan mudah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
diperoleh, stabil secara fisika dan kimia, bereaksi netral, tidak mudah menguap
dan tidak mudah terbakar, selektif yaitu mudah menarik zat berkhasiat yang
dan kuman sulit tumbuh dalam etanol 20%, tidak beracun, netral, absorpsinya
baik dan panas yang digunakan untuk pemekatan lebih sedikit. Etanol dapat
4. Soxhletasi
dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah
soxhletasi menggunakan larutan yang dipanaskan terus menerus sehingga zat aktif
yang tidak tahan pemanasan kurang cocok (Direktorat Jendral Pengawasan Obat
ditempatkan pada kertas saring dan diletakkan pada tabung. Cairan penyari
dipanaskan hingga mendidih, kemudian uap penyari akan naik ke atas melalui
pipa samping, kemudian diembunkan kembali oleh pendingin tegak. Cairan turun
ke labu melalui tabung yang berisi serbuk simplisia. Cairan penyari sambil turun
melarutkan zat aktif serbuk simplisia, karena terdapat sifon sehingga setelah
cairan mencapai permukaan sifon, seluruh cairan akan kembali ke labu (Direktorat
yang masih tinggi dapat diubah menjadi bentuk ekstrak kental. Proses pengentalan
ini dapat dilakukan melalui penguapan dengan menggunakan alat Vacuum Rotary
Evaporator. Cara kerjanya yaitu perputaran labu dalam sebuah pemanas pada
air, suhu penangas, hampa udara dan suhu pendingin membuat kondisi optimal
(Voight, 1994).
E. Spektrofotometri UV
molekul akan menyerap REM yang energinya sesuai. Interaksi antara molekul
dengan REM akan meningkatkan energi potensial elektron pada tingkat keadaan
tereksitasi. Transisi elektronik yang terjadi diantara tingkat energi dalam suatu
1.Transisi *
Energi yang diperlukan untuk transisi ini besarnya sesuai dengan energi
sinar yang frekuensinya terletak diantara UV vakum (>180 nm) sehingga kurang
2. Transisi n *
Jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh yang mengandung
atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (elektron n). Energi yang
sinar yang diabsorpsi memiliki panjang gelombang lebih panjang (150-250 nm)
3. Transisi n * dan *
mempunyai gugus fungsional yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap dalam
gugus tersebut memberikan orbital phi yang diperlukan (Gandjar dan Rohman,
2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 8. Pengaruh pelarut polar pada transisi * (Gandjar dan Rohman, 2007)
polar dibandingkan keadaan eksitasi. Jika pelarut polar digunakan pada molekul
yang mengalami transisi ini, maka menyebabkan pelarut polar berinteraksi lebih
energi transisi * pada pelarut polar ini lebih kecil. Menyebabkan terjadinya
pasangan elektron yang tidak berpasangan pada molekul dalam keadaan dasar
2007).
Gambar 9. Pengaruh pelarut polar pada transisi n * (Gandjar dan Rohman, 2007)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
spektrum UV-Vis dapat untuk tujuan analisis kualitatif dan kuantitatif (Mulja dan
Suharman, 1995).
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk
atau dalam sediaan farmasetik, serta dalam cairan biologis (Rohman, 2009).
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas : wadah fase gerak, pompa,
penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam
a. Wadah fase gerak dan fase gerak, alat KCKT yang baru dilengkapi
dengan satu atau lebih wadah gelas, yang mengandung 500 mL atau lebih fase
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
gerak. Sonikasi (penghilangan gas) biasanya dilakukan terlebih dahulu pada fase
gerak untuk menghilangkan gas yang mungkin terdapat di dalamnya. Adanya gas
dapat menyebabkan flow rate yang tidak reprodusibel serta dapat mengganggu
detektor (Skoog, Holler, Crouch, 1998). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri
atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan
asetonotril dengan air atau dengan larutan buffer. Untuk analit yang bersifat asam
atau basa lemah, peranan pH sangat penting karena jika pH fase gerak tidak diatur
maka analit akan mengalami ionisasi sehingga ikatan dengan fase diam akan
menjadi lemah jika dibandingkan dengan bentuk tidak terionisasi, spesies yang
hendaknya memiliki UV cut-off yang jauh dari panjang gelombang serapan analit.
Hal ini karena pada panjang gelombang tersebut kepekaan detektor UV sangat
lemah (Mulja dan Suharman, 1995). Karakteristik beberapa pelarut yang sering
b. Pompa, dalam alat KCKT pompa yang memenuhi syarat wadah pelarut,
yakni : pompa harus inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya
mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih
Pada KCKT fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.
Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus
silanol (Si-OH). ODS atau C18 merupakan fase diam yang paling banyak
rendah, sedang, maupun tinggi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan
waktu retensi yang bervariasi karena adanya kandungan air yang digunakan
baik memberikan respon yang linier terhadap konsentrasi analit, dapat bekerja dari
dan kecepatan dari fase gerak, mudah didapat dan mudah dioperasikan, selektif
terhadap berbagai macam analit di dalam fase gerak, tidak merusak sampel, dapat
baku dan senyawa yang tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi
secara berurutan dalam kondisi alat yang stabil dengan perbedaan waktu
puncak atau dengan luas puncak. Tinggi puncak diukur sebagai jarak dari garis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dasar ke puncak maksimum. Sedangkan luas puncak diukur sebagai hasil kali
tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi (W1/2) (Gandjar dan Rohman, 2007).
G. Landasan Teori
yang tinggi menyebabkan terjadinya pengikatan CO2 secara spontan oleh RDP hal
ini disebabkan O2 lebih banyak sehingga CO2 yang berperan dalam proses
ornithine yang dihasilkan dari tahap Glikolisis dan Siklus Krebs sebagai prekusor
digunakan untuk menetapkan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau
multikomponen dengan waktu yang relatif singkst. Metode KCKT fase terbalik
Under Curve) antara sampel ekstrak etanolik daun tembakau dengan AUC standar
baku nikotin. Persamaan kurva baku nikotin yang didapat merupakan kurva
hubungan antara konsentrasi baku nikotin dengan nilai AUC yang dihasilkan,
maka AUC sampel dimasukkan dalam persamaan, kemudian kadar dari sampel
H. Hipotesis
BAB III
METODE PENELITIAN
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak etanolik daun tembakau VBN
dan NO.
2. Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar nikotin yang terdapat
kemurnian tinggi.
b. larutan baku nikotin yang bersifat mudah teroksidasi oleh udara dan
alat gelas.
C. Definisi Operasional
2. Ekstrak etanolik daun tembakau yang digunakan adalah VBN dan NO.
3. Kadar nikotin dalam 1 gram ekstrak dinyatakan dalam satuan % b/b ± SD.
D. Bahan Penelitian
analysis kecuali dinyatakan lain yakni baku nikotin (E. Merck), ammonium asetat
(E. Merck), natrium asetat (E. Merck), asam asetat glasial (E. Merck), asetonitril
(E. Merck), metanol (E. Merck), natrium hidroksida 4M (E. Merck), kloroform (E.
Merck), asam klorida (teknis), etanol (teknis), aquades, aquabides dan ekstrak
E. Alat Penelitian
SP-300 Plus), seperangkat alat KCKT fase terbalik terdiri : pompa (merek
seperangkat alat komputer (merek Dell Vostro 220, printer merek HP D2566),
ukuran pori 0,45 m dan diameter 47 mm, nerca analitik merek Ohaus, milipore,
0,5599 g natrium asetat dan diambil 0,406 mL asam asetat glasial. Ketiga zat
aquabides hingga batas tanda. (Larutan buffer ini harus selalu dibuat baru untuk
Sampel yang digunakan berupa lembaran daun tembakau kering VBN dan
NO. Teknik pengambilan yaitu daun tembakau diambil secara acak mewakili
dengan cara mengambil sebanyak 10 L baku nikotin dan dimasukkan dalam labu
b. Pembuatan seri larutan baku nikotin. Lima seri larutan baku nikotin
dibuat dengan konsentrasi 0,01; 0,03; 0,05; 0,07; 0,09 ppm dengan cara
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
mengambil larutan stok nikotin dengan mikropipet sebanyak 25; 75; 125; 175;
225 L, dimasukkan dalam labu ukur 5,0 mL dan diencerkan dengan fase gerak
5. Penetapan maksimum
Tiga seri larutan baku nikotin dengan konsentrasi 0,005; 0,007; 0,009
225-325 nm. Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang
memberikan serapan terbesar dan sama pada 3 seri konsentrasi larutan baku
nikotin.
Seri larutan baku dengan konsentrasi 0,01; 0,03; 0,05; 0,07 dan 0,09
diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik dengan fase diam C18 dan fase gerak
Asam klorida pekat (HCl P) 22,6 mL dimasukkan dalam labu takar 10,0
8. Pembuatan NaOH 4 M
dimasukkan dalam labu takar 25,0 mL larutkan dan encerkan dengan aquabidest
hingga tanda.
9. Preparasi Sampel
kemudian dilarutkan dengan fase gerak ke dalam labu takar 5,0 mL dan
diencerkan dengan cara pipet 100 L larutan ke dalam labu takar 10,0 mL hingga
dan dimasukkan dalam tabung soxhlet dengan 130 ml etanol teknis 96% dalam
LAB. Optimasi lama waktu ekstraksi dilakukan pada waktu 7; 8; 9; dan 10 jam
dengan suhu waterbath 80-90 ºC. Filtrat yang didapat diuapkan dengan vacuum
diperoleh ekstrak agak kental dan dituangkan dalam cawan porselin. Diuapkan di
sama dengan optimasi lama waktu ekstraksi dengan menggunakan waktu optimal
regresi linear baku nikotin dari hasil validasi sehingga diperoleh kadar sampel.
G. Analisis Hasil
sampel ke dalam persamaan regresi linear yang diperoleh dari kurva baku nikotin
%b/b ± SD.
nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO berbeda bermakna
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
atau tidak. Uji statistik yang digunakan adalah uji normalitas Shapiro-Wilk untuk
mengetahui data yang diperoleh normal atau tidak, uji t tidak berpasangan untuk
mengetahui kadar yang diperoleh dari kedua sampel tersebut berbeda bermakna
atau tidak.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV
Penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan
(KCKT) fase terbalik karena metode yang digunakan telah dioptimasi dan
Pada tahap optimasi diperoleh kondisi optimum yaitu kolom fase diam
260 nm dengan nilai resolusi 1,5679, tailing factor 1,25; jumlah lempeng teoritis
Pada tahap validasi metode diperoleh bahwa metode KCKT fase terbalik
1,531, linearitas dengan nilai koefisien korelasi (r) 0,9996, presisi dan akurasi
pada konsentrasi 0,05 dan 0,09 ppm. Metode KCKT fase terbalik ini memenuhi
kriteria validasi metode pada rentang konsentrasi 0,05-0,09 ppm (Syenina, 2011).
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari hasil
fase terbalik karena fase gerak lebih polar dibandingkan fase diam oktadesilsilan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Menurut (Kazakevich, 2007) fase gerak yang paling sering digunakan untuk
pemisahan KCKT fase terbalik adalah modifikasi metanol dan asetonitril karena
memiliki eluent strenght yang kuat. Metanol memiliki eluent strenght 1,0
sedangkan asetonitril memiliki eluent strenght 3,1. Semakin besar nilai eluent
strenght, semakin besar kemampuan elusinya sehingga waktu retensi dari sampel
Buffer asetat adalah salah satu komponen dalam fase gerak yang
digunakan dalam penelitian ini terdiri dari asam lemah (asam asetat glasial) dan
basa konjugatnya (natrium asetat dan amonium asetat) yang bertujuan agar nikotin
(senyawa yang akan dianalisis) mudah terion. Pemilihan buffer berdasarkan nilai
pKa dari senyawa yang akan dianalisis. Menurut Kazakevich dan LoBrutto
(2007), pH buffer yang digunakan ± 2 unit dari pKa analit agar analit berada
dalam bentuk tunggal yakni bentuk terion atau bentuk molekul utuh.
Nikotin memiliki nilai pKa 8,5 (Landoni, 1991). Dalam penelitian ini,
buffer asetat dibuat pada pH 4. Campuran fase gerak terdapat 54 % metanol dan
pH yaitu 0,2 unit sehingga pKa nikotin mengalami pergeseran 7,3 dan pH dari
buffer asam mengalami pergeseran sebanyak 1,2 unit ke atas. Pada penelitian ini,
pH dari buffer yang digunakan 2 unit di bawah pKa nikotin agar nikotin menjadi
bentuk terion sehingga lebih cepat terelusi oleh fase gerak (Kazakevich dan
LoBrutto, 2007). Sehingga pH dari buffer asetat maksimum 4,1 agar nikotin tetap
N
CH3
N
N
H2O / H+
H3C H
N
+
dalam larutan fase gerak yang dapat menyumbat kolom, kemudian larutan
udara yang mempengaruhi tekanan pada pompa KCKT yang berpengaruh pada
waktu retensi.
ekstrak etanolik daun tembakau VBN dan NO. Teknik pengambilan yaitu daun
tembakau diambil secara acak mewakili setiap deret tanaman tembakau di lahan
30%, sehingga intensitas cahaya yang diperoleh tanaman tembakau sebesar 70%
Kadar nikotin yang terdapat pada berat kering tembakau 0,6-3% dengan
proses biosintesis di akar dan terakumulasi di daun, sehingga pada penelitian ini
tembakau setelah dipanen tidak jauh berbeda dengan proses pembuatan simplisia
mutu, tahap selanjutnya penyejunan dan proses curing. Tahapan tersebut tidak
sehingga daun tembakau VBN dan NO untuk penelitian ini sudah diperoleh berupa
Terpadu (LPPT) UGM dengan ukuran lubang pengayakan serbuk 1mm. Tujuan
dari pengayakan untuk memperoleh serbuk sedikit halus, tidak lolos dari kertas
saring yang akan digunakan untuk ekstraksi. Menurut Farmakope Indonesia edisi
IV, ukuran lubang pengayak 1,00 mm menunjukkan nomor pengayak 18. Derajat
halus serbuk dalam Farmakope Indonesia edisi III dinyatakan dengan nomor
pengayak. Apabila derajat halus suatu serbuk dinyatakan dengan satu nomor,
tersebut. Nomor pengayak 18 berarti semua serbuk dapat melalui pengayak nomor
18.
nikotin E.merck dalam pelarut. Pelarut yang digunakan adalah sama dengan fase
terjadinya perbedaan solvent strength antara pelarut dan fase gerak. Solvent
kemudian dibuat 5 seri konsentrasi larutan baku nikotin yaitu : 0,01; 0,03; 0,05;
maks dilakukan pada 3 seri konsentrasi yaitu rendah (0,005 ppm), tengah (0,007
ppm), dan tinggi (0,009 ppm). Dapat dilihat hasil spektra panjang gelombang
Gambar 12. A = konsentrasi 0,005 ppm absorbansi 0,205, maksimum 260 nm; B =
konsentrasi 0,007 ppm, absorbansi 0,333, , maksimum 260 nm dan C = konsentrasi 0,009
ppm, absorbansi 0,374, maksimum 260 nm
Dari ketiga gambar spektra nikotin yang diperoleh terlihat bahwa bentuk
spektra yang dihasilkan pada tiga level konsentrasi sama. Panjang gelombang
yang menghasilkan serapan maksimum nikotin terletak pada 260 nm. Menurut
Mulja, 1995 penentuan panjang gelombang maksimum yang pasti (tepat) dapat
Pembuatan kurva baku telah dilakukan pada tahap validasi. Kurva baku
menunjukkan hubungan antara AUC dengan konsentrasi analit pada beberapa seri
baku. Dalam penelitian ini dibuat tiga replikasi kurva baku, kemudian dipilih
persamaan regresi linear yang memberikan nilai koefisien korelasi (r) dengan
kriteria r 0,999 (Center for Drug Evaluation and Research, 1994). Diperoleh
yaitu 0,9996. Persamaan regresi linear ini digunakan untuk menghitung kadar
(baku nikotin) dan AUC baku terlihat bahwa semakin meningkatnya konsentrasi
dari cairan penyari dapat membasahi kertas saring sehingga dapat menyari serbuk
daun tembakau tersebut. Cairan penyari yang digunakan adalah etanol 96% karena
nikotin larut dalam etanol, sangat efektif dalam menghasilkan jumlah bahan aktif
yang optimal dan tidak beracun (Voight, 1994). Prinsip metode soxhletasi adalah
pendingin menjadi tetesan-tetesan yang akan turun ke tabung berisi sebuk yang
telah dibungkus kertas saring. Cairan penyari akan menetes melarutkan zat aktif
jika volume tetesan telah mencapai permukaan, seluruh pelarut akan turun
kembali ke labu alas bulat sehingga sirkulasi terjadi berulang-ulang yang akan
yang digunakan adalah 65ºC yang dilakukan selama 10 menit. Setelah diperoleh
ekstrak cair yang lebih pekat hasil evaporasi, dipekatkan kembali dengan
diuapkan di atas waterbath pada suhu 80ºC hingga diperoleh ekstrak kental.
Sampel dalam cawan ditutup aluminium foil dan disimpan dalam desikator.
Tujuan dari optimasi waktu ekstraksi nikotin dari serbuk daun tembakau
lebih sedikit daripada metode ekstraksi lain dan secara langsung diperoleh hasil
ekstraksi yang lebih pekat (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan,
1986).
jam. Optimasi waktu 7 jam digunakan sebagai waktu optimasi terendah karena
dilakukan orientasi ekstraksi terlebih dahulu selama 5 jam diperoleh hasil yaitu
cairan penyari yang terdapat pada tabung soxhlet berwarna hijau tua (pekat).
dikatakan sempurna jika cairan penyari pada tabung soxhlet tidak berwarna.
D
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel II. Hasil pengukuran AUC sampel dengan variasi waktu ekstraksi sampel
dengan soxhlet
Waktu 7A 7B 8A 8B 9A 9B 10 A 10 B
(jam)
AUC 1072305 1135700 1228904 123771 916992 942139 659037 644588
dan terjadi penurunan respon AUC pada 9 jam ekstraksi dan 10 jam ekstraksi,
maka waktu optimum proses ekstraksi dengan soxhlet adalah 8 jam karena
menghasilkan respon AUC paling tinggi. Hal ini dimungkinkan terdapat pengaruh
lama waktu ekstraksi terhadap stabilitas dari nikotin. Suhu yang harus
dengan waktu optimum ekstraksi selama 8 jam. Hasil kromatogram dan respon
AUC dari kedua sampel dapat dilihat pada gambar 17 dan tabel III.
A
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
E
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
I
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
J
Gambar 16 = A:NO 1; B:NO 2; C:NO 3; D:NO 4; E:NO 5; F:VBN 1; G:VBN 2; H:VBN 3;
I:VBN 4; J:VBN 5.
Tabel III. Hasil pengukuran AUC ekstraksi serbuk daun tembakau jenis VBN dan
NO dengan soxhlet selama 8 jam
Replikasi AUC
Na Oogst Vorstenlanden
1 627977 1258549
2 628873 1232800
3 626067 1231498
4 628265 1238593
5 628560 1232771
I. Preparasi Sampel
Sampel yang berupa ekstrak kental ditimbang ± 1 gram dilarutkan dalam HCl
encer dengan bantuan ultrasonikator selama 30 menit. Pada tahap ini nikotin yang
terkandung dalam sampel akan bereaksi dengan asam klorida membentuk nikotin
N N
HCl
H3C +- H
+
CH3 Cl
N N
nikotin asam klorida nikotin hidroklorida
Gambar 18 . Reaksi antara nikotin dengan asam klorida
penambahan kloroform yang kedua nikotin akan terlarut dalam fase kloroform.
+ NaOH
N
+
H3C -
Cl H
N
Nikotin hidroklorida NaOH Nikotin
N
+ NaCl + H2O
N CH3 Gambar 19. Reaksi antara nikotin hidroklorida
dengan NaOH
hingga tersisa residu nikotin, karena titik didih nikotin adalah 247°C sehingga
fase gerak dan dilakukan pengenceran sepuluh kali lipat untuk memperoleh
respon analit yang masuk dalam area under curve (AUC) kurva baku . Pada
larutan sampel masih terdapat senyawa lain yang larut dalam fase kloroform yang
adalah waktu yang dibutuhkan analit saat diinjek sampai keluar dari kolom dan
Waktu retensi (tR) suatu analit sangat dipengaruhi oleh interaksi analit
dengan fase diam dan fase gerak. Jika waktu retensi analit semakin singkat maka
interaksi analit lebih besar dengan fase gerak dibandingkan dengan fase diam.
Dalam penelitian ini, fase diam yang digunakan kolom oktadesilsilan (C18) yang
bersifat non polar dan fase gerak yang digunakan adalah buffer
Dari sistem kromatografi fase terbalik, senyawa polar akan terelusi terlebih
dahulu daripada senyawa non polar sehingga waktu retensinya lebih singkat.
Dilihat dari strukturnya pada gambar (20), nikotin memiliki bagian polar
dan non polar. Bagian polar terdapat pada cincin piridin dan pirolidin dan bagian
Gambar 20. Struktur nikotin dengan bagian polar dan non polar
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
hidrogen dengan fase gerak, sedangkan bagian non polarnya akan berinteraksi
secara Van der Waals dengan rantai alifatis fase diam oktadesisilan (C18).
hidrogen terjadi pada atom nitrogen cincin piridin, sedangkan interaksi ionik
terjadi pada atom nitrogen cincin pirolidin yang terprotonasi karena suasana asam
dari buffer asetat. Karena interaksi hidrogen dan ionik lebih kuat dibandingkan
interaksi Van der Waals antara bagian non polar nikotin dengan fase diam,
O CH3
Asam asetat C
O
Interaksi ionik
H
N+
Ch3
= Interaksi hidrogen
N O
Metanol Natrium asetat
H
H CH3
O Na O C CH3
O
H3 C H H
O H OH
O
Aqua
H H H C CH3
H3 C
O- NH4+ Asetonitril
C
Amonium asetat
H3 C O
Gambar 22. Interaksi nikotin dengan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6).
Hasil validasi pada gambar (22) diperoleh kromatogram baku nikotin
dengan tR yaitu 2,017 menit dan hasil penetapan kadar diperoleh kromatogram
sampel dengan tR pada puncak I yang hampir sama dengan baku pada puncak I
yaitu 1,970 menit, dapat dipastikan adanya nikotin dalam sampel ekstrak daun
temperatur, komposisi fase gerak dan tekanan yang stabil menghasilkan tR yang
a
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b
Gambar 23. (a) kromatogram baku nikotin tR = 2,017 menit dan (b) kromatogram
sampel ekstrak etanolik daun tembakau tR = 1,970 menit
KCKT 115 kgf/cm2 berbeda dengan validasi metode 110 kgf/cm2, hal ini
pressure tidak stabil. Semakin besar tekanan semakin singkat waktu retensinya,
karena semakin kuat kemampuan fase gerak untuk mendorong analit (nikotin)
keluar dari kolom. Data yang diperoleh benar karena tR sampel lebih singkat
dibandingkan tR baku.
berdasarkan persamaan kurva baku yang diperoleh dari validasi. Presisi yang
Tabel IV. Perhitungan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau kedua sampel
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
etanolik daun tembakau Vorstenlenden Bawah Naungan 2,790 x 10-3 ± 2,744 x 10-
5
% b/b dengan nilai CV = 0,9835% dan Na Oogst adalah 1,316 x 10-3 ± 2,775x10-
6
% b/b dengan nilai CV = 0,2109 %. Kadar nikotin yang didapatkan dalam
penelitian ini merupakan kadar nikotin dalam 1 gram ekstrak yang digunakan,
statistik yang bertujuan untuk mengetahui data yang diperoleh berbeda bermakna
atau tidak. Syarat dilakukan uji t tidak berpasangan adalah data yang didapatkan
merupakan data yang terdistribusi normal, oleh karena itu dilakukan uji
normalitas terlebih dahulu. Uji normalitas data yang digunakan adalah Shapiro-
Wilk dengan nilai kemaknaan (p) > 0,05. Shapiro-Wilk digunakan karena jumlah
terdistribusi normal karena pada tabel Sig. VBN memiliki nilai p = 0,454 dan NO
nilai p = 0,126.
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
ekstrak etanolik daun tembakau jenis VBN dan NO berbeda bermakna atau tidak,
maka dilakukan uji uji t tidak berpasangan dengan taraf kepercayaan 95%.
Dari tabel VI diperoleh hasil bahwa varians data kedua jenis ekstrak
sama karena memiliki nilai p >0,05 yang ditunjukkan dengan Sig. 0,059. Untuk
dengan kolom sig.(2-tailed) baris kedua (equal variences not assummed) jika p
! "
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
$%
&'
%
# $% ( " " ) *
asetil CoA sebagai substrat untuk daur Krebs. Salah satu hasil asetil CoA yang
Dari penjelasan di atas, reaksi yang terjadi dipengaruhi oleh adanya kerja
enzim yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi (katalis) dan lebih spesifik
tertentu (Salisbury dan Ross, 1995). Salah satu faktor yang mempengaruhi
aktivitas enzim adalah cahaya yang berpengaruh terhadap suhu. Pada suhu yang
melebihi atau dibawah suhu normal enzim, kerja enzim tidak efektif sehingga
terbentuk lebih besar. Sehingga kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun
BAB V
A. Kesimpulan
1. Dari hasil penelitian yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa rata-rata kadar
2. Hasil analisis statistik kadar nikotin dalam ekstrak etanolik kedua daun
B. Saran
2. Perlu dilakukan penimbangan terhadap berat total jumlah ekstrak kental yang
dihasilkan dalam sekali ekstraksi sehingga kadar yang didapat setara berat
DAFTAR PUSTAKA
Cahyono, B., Drs., 1998, Tembakau Budidaya dan Analisis Usaha Tani, Kanisius,
Yogyakarta, pp. 9-10.
Center for Drug Evaluation and Research, 1994, Reviewer Guidance Validation of
Chromatographic Methods, Food and Drug Admisnistration, Rockville,
pp. 12.
Dahlan, M.S., 2009, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika,
Jakarta, pp.45-57, 53, 60-65.
Ernesta, A., 2011, Optimasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase T
Terbalik Pada Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun
Tembakau, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta.
Hanum, C., 2008, Teknik Budidaya Tanaman jilid 3, Teknik Budidaya Tembakau
bab X, Direktorat Jenderal Manajemen Pendidikan Dasar dan Menegah
Departemen Pendidikan Nasional, Jakarta, pp.425, 431-435.
Whagner, H.L., 2003, The Health Effects of Nicotine and Smoking, in Triggle,
D.J., Nicotine-Drugs the Straight Facts, Chapter 3, University Pofessor
School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences State University of
New York, Buffalo, pp. 45-48.
Kar, A., 2005, Pharmaceutical Drug Analysis, New Age Publications, India, pp.
454, 462.
Kazakevich, Y., dan LoBrutto R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientists,
John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 15, 192.
.
Landoni, J.H., 1991, Nicotine, http://www.inchem.org/documents/pims/chemical/
nicotine.htm#SectionTitle:32%20Chemical%20structure, diakses tanggal 18
Februari 2011.
Raymond, W.R., Hale, R.W., 1991, United States Patents Process For Isolating
Plant Extract Fractions, Philip Morris Incorporated, New York, pp. 11-
12.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J., 1994, Analytical Chemistry, Sixth edition,
Saunders College Publishing, USA, pp. 386.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC
MethodDevelopment, Second edition., Wiley & Sons, Inc., New York,
pp. 313, 507.
Syenina, A., 2011, Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase
Terbalik pada Penetapan Kadar Nikotin Dalam Ekstrak Etanolik Daun
Tembakau, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta.
The Merck Index, 1989, The Merk Index An Encyclopedia OF Chemicals, Drugs
and Biological, Eleventh edition, Merck & Co., Inc., USA, pp.6434.
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
0% 3 & 4 3 (5 + +
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
'% + $ 5 + 6
7 %7 89 :* ; 3 ; ; * 3 ; 3 83 < &7 8 84 (
: "3; = 7 ; 3;
7 ; 3; 9 3 ;
>%7 + ; %0 %?# @&/'1'(.'''.2 9 1,00 A 5 $B+ C + %
No : KC – INSIP/11.262
Lampiran : -,-.
Hal : Bahan Penelitian (Tembakau Jenis VBN dan NO)
Kepada :
Yth. Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Di Yogyakarta
Penelitian Klaten,
Cara-cara menghitung :
1. Menghitung ke bawah pergeseran pKa nikotin :
pKa nikotin = 8,5
pelarut organik dalam sistem 60% (metanol:asetonitril = 54:6), sehingga
0,2 x 6 = 1,2
8,5 – 1,2 = 7,3
2. Menghitung pH agar nikotin dalam bentuk ionik :
pH = -2 unit pKa nikotin
7,3 – 2 = 5,3
3. Pergeseran ke atas pH dari buffer dengan penambahan pelarut organik :
0,2 x 6 = 1,2
4. Menghitung pH maksimum buffer yang dibuat agar nikotin dalam bentuk
terion :
5,3 – 1,2 = 4,1. Sehingga pH buffer yang dibuat 4,1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Indeks polaritas =
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Timbangan kasar
Beker kosong (g) 62,53 44,89 58,23 45,09 58,24 58,23 61,19 45,09
Beker + serbuk (g) 82,54 64,90 78,24 65,10 78,24 78,24 81,20 65,10
Timbangan analitik
Beker + serbuk (g) 82,5492 64,9028 78,2490 65,1108 78,2435 78,2437 81,2062 65,1025
Beker + sisa (g) 62,5488 44,9024 58,2488 45,1103 58,2439 58,2435 61,2059 45,1022
Berat serbuk (g) 20,0004 20,0004 20,0002 20,0005 19,9996 20,0002 20,0003 20,0003
Waktu 7A 7B 8A 8B 9A 9B 10 A 10 B
(jam)
AUC 1072305 1135700 1228904 123771 916992 942139 659037 644588
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b) Na Oogst Replikasi 2
c) Na Oogst Replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
d) Na Oogst Replikasi
e) Na Oogst Replikasi 5
f) VBN Replikasi 1
g) VBN Replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
h) VBN Replikasi 3
i) VBN Replikasi 4
j) VBN Replikasi 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Seluruh fase kloroform diuapkan dalam almari asam, kemudian dilarutkan dalam
5 mL pelarut. Diambil 100 µL dan diencerkan dalam labu ukur 10,0 mL dengan
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Levene's
Test for
Equality of
Variances t-test for Equality of Means
kadar Equal variances 4.833 .059 119.527 8 .000 .001474600 .000012337 .001446151 .001503049
assumed
Varians data kedua jenis ekstrak sama karena memiliki nilai p >0,05
yang ditunjukkan dengan Sig. 0,059. Data kedua kelompok berbeda bermakna
BIOGRAFI PENULIS