II.

TINJAUAN PUSTAKA

A. Definisi dan Manfaat Bioetanol

Bioetanol merupakan cairan hasil proses fermentasi gula dari sumber

karbohidrat (selulosa) menggunakan bantuan mikroba. Produksi bioetanol dari

tanaman yang mengandung selulosa, dilakukan melalui proses konversi

lignoselulosa menjadi selulosa dengan beberapa metode diantaranya dengan

hidrolisis fisik, kimia, dan biologi (Khairani, 2007). Bioetanol merupakan

bahan bakar alternatif yang memiliki keunggulan mampu menurunkan emisi

CO2 hingga 18 %.

Bioetanol memiliki karakteristik mudah menguap, mudah terbakar,

larut dalam air, tidak karsinogenik, dan tidak berdampak negatif pada

lingkungan. Bioetanol mempunyai manfaat untuk dikonsumsi manusia sebagai

minuman beralkohol. Selain itu, bioetanol dapat dimanfaatkan sebagai bahan

bakar dengan kandungan minimal 10 % etanol (Seftian dkk., 2012). Biaya

produksi bioetanol tergolong murah karena sumber bahan baku berasal dari

limbah pertanian yang memiliki nilai ekonomis yang rendah (Novia dkk.,

2014).

B. Definisi, Bahan Baku, dan Proses Fermentasi

Fermentasi adalah proses penguraian senyawa organik yang berfungsi

untuk menghasilkan energi serta terjadinya proses pengubahan substrat atau

bahan baku menjadi sebuah produk oleh mikroba dalam kondisi anaerob

(Madigan dkk., 2008). Fermentasi merupakan penerapan metabolisme mikroba

8
 9

untuk mengubah bahan baku menjadi produk yang bernilai tinggi, seperti asam

organik, protein sel tunggal, antibiotika, dan biopolimer (Tarigan, 1988).

Fermentasi telah lama dilakukan oleh nenek moyang kita secara tradisional

dengan produk yang biasa dikonsumsi manusia sampai sekarang, seperti tape,

tuak, wine, tempe, dan oncom (Nurhayani dkk., 2000).

Fermentasi anaerob merupakan fermentasi yang tidak membutuhkan

oksigen tetapi bahan lain akan bertindak sebagai akseptor, misalnya aldehide

atau asam karboksilat. Mikroba yang melakukan fermentasi ini adalah yeast

(ragi) terutama dari Saccharomyces sp., beberapa jamur dan bakteri (Tarigan,

1988). Proses fermentasi alkohol hanya dapat terjadi apabila terdapat sel-sel

khamir . Bahan baku untuk proses fermentasi berupa bahan mentah seperti

monosakarida atau disakarida (gula tebu, tetes tebu), bahan berpati (padi,

jagung, umbi, dll), dan bahan selulosa (kayu, limbah pertanian) (Anshori,

1985).

Proses fermentasi etanol dapat dilakukan secara batch. Fermentasi

secara batch membutuhkan waktu sekitar 50 jam, pH awal 4,5 dan suhu 20-

30 oC untuk menghasilkan yield etanol 90 % dari nilai gula teoritis (Anshori,

1985). Pada fermentasi secara proses batch tidak dilakukan penambahan

substrat maupun nutrien sehingga semakin lama waktu fermentasi maka

produktivitas etanol semakin berkurang serta adanya akumulasi produk etanol

yang dapat mengganggu pertumbuhan mikroba (Tarigan, 1988).

Keberadaan oksigen dalam fermentasi akan menghambat jalur

fermentasi di dalam sel khamir sehingga sumber karbon yang ada akan
 10

digunakan melalui jalur respirasi (Pasteur effect), namun Pasteur effect pada

sel khamir dapat diamati pada fase stationer, sedangkan produksi alkohol

terjadi ketika sel berada pada fase pertumbuhan (fase log) (Pelczar dan Chan,

1986). Menurut Widiastuti dan Pramesti (2011), pada saat fermentasi alkohol

dalam kondisi anaerob satu molekul glukosa dapat menghasilkan 2 molekul

ATP. Jalur biokimia bervariasi tergantung jenis gula yang digunakan akan

tetapi biasanya melibatkan jalur glikolisis yang merupakan bagian awal dari

tahap respirasi aerobik pada sebagian besar organisme. Reaksi yang terjadi

sebagai berikut:

1. Gula (C6H12O6) asam piruvat (glikolisis)

2. Dekarbeksilasi asam piruvat.

Asam piruvat asetaldehid + CO2

Piruvat dekarboksilase
(CH3CHO)
3. Asetaldehid oleh alkohol dihidrogenasi diubah menjadi ethanol.

CH3CHO + 2 NADH2 2 C2H5OH + 2 NAD

Alcohol dehidroginase enzim

Sumber: Widiastuti dan Pramesti (2011)

C. Deskripsi, Morfologi, dan Kandungan Nanas

Menurut Kwartiningsih dkk. (2005), klasifikasi tanaman nanas adalah

sebagai berikut:

Kingdom : Plantae
Divisio : Spermatofita
Kelas : Monoctyldonae
Ordo : Farinosae
Famili : Bromeliaceae
Genus : Ananas
Spesies : Ananas comosus (L.) Merr
Nanas (Ananas comosus) merupakan anggota dari famili

Bromeliaceae dan terdiri dari sekitar 200 species dengan produksi tahunan di
 11

seluruh dunia lebih dari 14 juta ton (Brat dkk., 2004). Buah nanas berasal dari

Brazil dan telah tersebar ke berbagai negara tropis dan subtropis di seluruh

dunia (Dhar dkk., 2008). Limbah pertanian merupakan sumber energi

terbarukan dan dapat dimanfaatkan karena memiliki karakteristik tidak

beracun, terdapat dalam jumlah besar, murah dan mampu mendukung

pertumbuhan produksi biomassa (Dhanasekaran dkk., 2011).

Pabrik pengalengan nanas hampir 67 % dari buah yang terdiri dari 41

% kulit, 6 % jonggol atau inti, 20 % mahkota tidak dimanfaatkan dan dibuang

sebagai limbah yang menyebabkan pencemaran lingkungan. Kandungan bahan

kering dari nanas sekitar 10 % terdiri dari 96 % bahan organik dan 4 % bahan

anorganik (Abdullah, 2007). Limbah nanas mengandung bahan organik dengan

konsentrasi 96 % dan padatan tersuspensi. Selain dampak negatif yang

ditimbulkan dari limbah nanas, terdapat potensi untuk didaur ulang menjadi

bahan baku yang dikonversi menjadi produk selai, jus, kripik dan bioetanol

(Abdullah, 2007).

Kulit nanas mengandung 81,72 % air, 20,87 % serat kasar, 17,53 %

karbohidrat, 4,41 protein, dan 13,65 % gula reduksi (Wijana dkk., 1991).

Kandungan selulosa pada kulit nanas sebesar 19,8 % dan hemiselulosa 11,87 %

(Bardiya dkk., 1996). Berdasarkan kandungan karbohidrat dan gula pada kulit

nanas yang cukup tinggi maka kulit nanas berpotensi sebagai bahan baku

pembuatan bioetanol. Karakteristik limbah kulit nanas dapat dilihat pada Tabel

1.
 12

Tabel 1. Karakteristik limbah kulit nanas

Parameter Konsenterasi (g/L)
Gula reduksi 53,4
Gula total 79,1
Kjeldahl nitrogen 0,224
pH 4,5
Sumber: Paramashinta dan Abdullah (2014).

D. Hidrolisis Lignoselulosa

Bahan lignoselulosa dapat diperoleh dari jerami padi, rumput, limbah

pertanian seperti kulit nanas dan bonggol jagung. Lignoselulosa memiliki

komponen polimer selulosa, hemiselulosa dan lignin. Proses hidrolisis

diperlukan untuk melepas selulosa dan hemiselulosa dari ikatan kompleks

lignin dan depolimerisasi untuk mendapatkan gula bebas (Anindyawati, 2010).

Tahap hidrolisis merupakan tahap senyawa-senyawa kompleks diuraikan

menjadi senyawa yang lebih sederhana seperti senyawa asam organik, glukosa,

dan hidrokarbon, kemudian senyawa-senyawa tersebut akan digunakan sebagai

sumber karbon dan energi oleh mikroba fermentasi (Fernandes dkk., 2008).

Efek dari Hidrolisis Lignoselulosa untuk melepas komponen selulosa dan

hemiselulosa dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Efek dari Hidrolisis Lignoselulosa untuk melepas komponen

selulosa dan hemiselulosa
Sumber: Mosier dkk. (2005).
 13

Proses hidrolisis lignoselulosa memiliki fungsi dalam proses konversi

selulosa yaitu untuk memisahkan selulosa dari ikatan lignin-hemiselulosa dan

mengurangi kristal selulosa (Balan dkk., 2009). Metode hidrolisis lignoselulosa

dapat dilakukan secara fisika (pencacahan, penggilingan), fisiko-kimia (steam

explosion, ammonia fiber explosion), kimia (alkaline pretreatment, ozonolisis,

hidrolisis asam, dan delignifikasi oksidatif), dan metode hidrolisis biologi

(enzim selulase) (Khairani, 2007). Beberapa metode hidrolisis untuk bahan

lignoselulosa dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Metode Hidrolisis untuk Bahan Lignoselulosa

Metode Contoh
Mekanik panas Digerus, digiling, digunting
Autohydrolysis Tekanan uap, letusan uap, carbon
dioxide explotion
Perlakuan asam Asam sulfat dan asam klorida encer,
asam sulfat dan asam klorida pekat
Perlakuan alkali Sodium hidroksida, amonia, alkali
hidrogen peroksida
Perlakuan larutan organik Metanol, etanol, butanol, phenol
Sumber: Saha (2003).

Alkaline pretreatment memiliki kelebihan dibandingkan teknik

hidrolisis fisik dan biologi yaitu mampu menghilangkan lignin sebesar 77,3 %

dengan menggunakan NaOH 2 % pada suhu 121 oC dan tekanan 1 atm selama

90 menit (Mcintosh dan Vancov, 2010). Pada penelitian Harun dkk. (2010),

alkaline pretreatment untuk memproduksi bioetanol dari mikroalga. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa yield glukosa tertinggi diperoleh sebesar 350

mg/g alga dan etanol tertinggi sebesar 0,2 g etanol/ g alga pada saat

penggunaan NaOH 0,75 % dengan suhu 120 oC dan tekanan 1 atm selama 50

menit (Harun dkk., 2010).

 14

E. Fermentasi Produk oleh Saccharomyces cerivisiae

Saccharomyces cerivisiae termasuk dalam filum Ascomycota. Secara

aseksual, khamir dalam kelas ini memperbanyak diri melalui aseksual dengan

pembentukan konidium dalam jumlah besar (Pelczar dan Chan, 1986). Ukuran

khamir ini dapat mencapai 5 – 10 μm (diameter), berbentuk bulat atau oval,

memiliki spora bulat lonjong, permukaan halus, elevasi konveks, volume sel

rata-rata 29 hingga 55 μm3 dan berwarna putih atau krem (Madigan dkk.,

2008).

Saccharomyces cerevisiae sangat bermanfaat bagi manusia sebagai

agen sediaan hayati dalam industri pembuatan keju, roti, dan minuman

berakohol (Pelczar dan Chan, 1986). Saccharomyces cerevisiae telah lama

digunakan dalam industri alkohol karena dapat melakukan fermentasi glukosa

menjadi etanol. Proses fermentasi dalam Saccharomyces cerevisiae

berlangsung dalam keadaan anaerob. Fermentasi etanol oleh Saccharomyces

cerevisiae akan berlangsung secara optimal pada temperatur 32 dengan pH

4,5 (Winarno dan Fardiaz, 1979).

Spesies ragi yang mempunyai daya konversi gula menjadi etanol yang

tinggi adalah Saccharomyces cerivisiae, khamir (yeast) ini dapat menghasilkan

enzim hidrolase dan enzim invertase. Enzim hidrolase pada Saccharomyces

cerivisiae berfungsi sebagai pemecah sukrosa (disakarida) menjadi glukosa

(monosakarida) dan enzim invertase pada Saccharomyces cerivisiae yang

berfungsi mengubah glukosa menjadi etanol. Saccharomyces cerivisiae banyak

digunakan dalam fermentasi etanol (Muhiddin dan Nurhayati, 2001).

 15

Menurut Darwis dan Aziz (1995), produk fermentasi yang terbentuk

tergantung kepada berbagai faktor lain, antara lain:

1. Jenis dan konsentrasi ragi

Pemilihan mikroba ini biasanya didasarkan pada jenis karbohidrat

yang digunakan sebagai medium. Pada pembuatan alkohol dari gula

digunakan Saccharomyces cereviceae. Selain itu dapat juga digunakan

Saccharomyces ellipsoidea. Konsentrasi optimum adalah 1–5 %.

2. Lama fermentasi

Lama fermentasi tergantung pada jenis karbohidrat yang digunakan

serta raginya. Pada umumnya membutuhkan waktu 20 hari untuk

memperoleh fermentasi yang sempurna (karbohidrat yang di fermentasi

terkonversi secara maksimal)

3. Temperatur

Kecepatan reaksi kimia umumnya akan bertambah jika terjadi

kenaikan temperatur. Tetapi untuk reaksi enzimatis hal ini tidak berlaku.

Suhu optimum proses fermentasi antara 19 – 29 °C, pada interval suhu

tersebut aktivitas khamir akan optimum.

4. pH

Keasaman yang optimum untuk pertumbuhan sel khamir adalah pH 4

sampai dengan 4,5, karena pada interval tersebut pertumbuhan bakteri

pembusuk ( Bakteri Asam Laktat) terhambat.

 16

5. Konsentrasi substrat

Sumber karbon yang biasanya dipakai adalah gula dengan konsentrasi

15 sampai 30 %. Konsentrasi gula yang optimum untuk permulaan

fermentasi adalah 16 %. Hal ini bertujuan untuk mempercepat pertumbuhan

khamir. Apabila gula di dalam ekstrak sudah habis, dapat ditambahkan lagi

gula untuk memperoleh kandungan etanol yang besar.

6. Oksigen

Kebutuhan oksigen hanya pada saat awal fermentasi dan ini sudah

cukup dengan oksigen terlarut dan yang ada pada permukaan. Pengunaan

oksigen ini untuk merangsang pertumbuhan khamir, meningkatkan jumlah

sel khamir dan memungkinkan metabolisme maltosa. Keadaan dalam

fermentor bertahap menjadi anaerobik dan fermentasi alkohol mulai terjadi.

7. Umur Khamir

Semakin tua umur sel khamir maka kemampuan khamir dalam

memfermentasi etanol semakin menurun.

F. Deskripsi dan Jenis Metode Imobilisasi sel

Imobilisasi sel merupakan suatu proses untuk menghentikan

pergerakan dari molekul enzim atau sel ditahan pada tempat tertentu dalam

suatu ruang reaksi yang digunakan sebagai katalis (Darmawan dkk., 2010). Sel

khamir imobil yang digunakan secara berulang akan mempengaruhi kadar

etanol yang dihasilkan (semakin menurun) karena sel khamir imobil semakin

menua sehingga kemampuan fermentasi etanol berkurang (Darwis dan Aziz,

1995).
 17

Teknik imobilisasi sel dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu ikatan

dengan carrier, ikatan silang, dan metode penjebakan (Grote dkk., 1980).

Metode penjebakan dapat dilakukan dalam matrik polimer. Matrik polimer

yang dapat digunakan adalah kolagen, gelatin, selulosa triasetat, alginat, agar,

poliakrilamid, dan polistiren untuk menghasilkan sel imobil dalam bentuk

manik-manik, kubus atau lembaran. Metode penjebakan dengan matrik alginat

lebih sering digunakan, karena sederhana dalam pelaksanaannya, dapat

mempertahankan viabilitas dan aktivitas sel immobil, tidak beracun serta

murah dan mudah didapat (Grote dkk., 1980).

Rakin dkk. (2009) melakukan studi perbandingan antara produksi

etanol oleh Saccharomyces cerevisiae terimobilisasi pada Ca-alginat dengan

produksi etanol oleh Saccharomyces cerevisiae terimobilisiasi pada polyvinly

alcohol (PVA). Substrat yang digunakan adalah hidrolisat pati jagung dengan

kadar total gula awal sebesar 176 g/L. Hasil studi tersebut menunjukkan bahwa

penggunaan yeast terimobilisasi pada Ca-alginat mampu menghasilkan etanol

dengan konsentrasi mencapai 10,1 % (v/v). Nilai konsentrasi tersebut lebih

baik jika dibandingkan dengan penggunaan yeast terimobilisasi PVA (Poli

Vinil Alkohol) yang hanya mampu menghasilkan etanol berkonsentrasi 7,2 %

(v/v) (Rakin dkk., 2009).

Metode ikatan dengan carrier yaitu pengikatan sel langsung pada

matriks yang tidak larut dalam air dan dapat dibedakan lagi atas tiga macam

berdasarkan cara pengikatannya, yaitu adsorbsi fisik, ikatan ionik, dan ikatan

kovalen (Muchtadi dkk., 1992). Matriks yang dapat digunakan untuk

 18

imobilisasi dengan sistem ikatan diantaranya polisakarida tidak larut air

(selulosa, dekstran, dan turunan agarosa), protein (gelatin dan albumin),

polimer sintetik (gel poliakrilamida), bahan organik (gelas berpori, silica, ion

metal dan tanah alkali) (Muchtadi dkk., 1992).

Metode ikatan silang didasarkan atas pembentukan ikatan kimia

seperti pada metode ikatan kovalen. Imobilisasi sel terjadi melalui komponen

multifungsional, sebagai komponen pengikat dapat digunakan gluraldehida dan

turunan bis-diazobenzidin. Sel yang diimobilisasi dengan metode ikatan silang

sering bersifat gel. Sel dapat diimobilisasi sebagai bagian dari suatu

kopolimerisasi dengan anhidrida maleat dan etilen yang sebelumnya telah

direaksikan dengan etilen diamin (Palmer,1991).

Pada penelitian ini menggunakan metode penjebakan dengan matrik

alginat karena sederhana dalam pelaksanaannya, dapat mempertahankan

viabilitas dan aktivitas sel immobil, tidak beracun serta murah dan mudah

didapat (Grote dkk., 1980). Glukosa berdifusi masuk ke dalam gel melalui

matriks pori alginat maka dari itu konsentrasi alginat yang tepat dapat

mengoptimalkan difusi masuk dan keluarnya glukosa (Widjaja dkk., 2009).

Alginat dengan konsentrasi tinggi (7-10%) atau semakin kental dapat

menyebabkan difusi glukosa semakin menurun (Beshay, 2003). Matriks pori

yang terlalu rapat (konsentrasi alginat tinggi) akan menurunkan efisiensi difusi

glukosa karena glukosa yang berukuran 0,8 nm sulit masuk ke dalam gel

melalui matriks pori alginat (Goksungur dan Zorlu, 2001).Metode imobilisasi

sel dengan Ca-alginat dapat dilihat pada Gambar 2.

 19

Gambar 2. Metode Imobilisasi Sel dengan Ca-alginat (Ozturk, 2001).

Keterangan: a. Matriks Polimer Ca-alginat b. Sel Saccharomyces
cerevisiae

G. Analisis Kadar Gula Reduksi

Analisis kadar gula reduksi pada penelitian ini menggunakan metode

Nelson Somogy. Metode Nelson Somogy merupakan uji kuantitatif yang

digunakan untuk menentukan kadar gula reduksi dalam sampel dengan

menggunakan metode absorbansi dengan alat spektrofotometri (Tranggono,

1984). Uji ini menggunakan reagen arsenomolibdat yang terdiri dari Nelson A

dan Nelson B. Glukosa diendapkan dengan ZnSO 4 dan Ba(OH)2. Kupri oksida

dioksidasi oleh larutan tembaga alkali dengan membentuk kupro oksida (CuO),

kemudian kupro oksida dioksidasi kembali dengan asam arsenomolibdat yang

akan membentuk warna biru (Bintang, 2010).

Uji kadar gula reduksi dapat digunakan untuk mengetahui pola

pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae (Muhiddin dan Nurhayati, 2001).

Saccharomyces cerevisiae menggunakan glukosa untuk pertumbuhan dan

 20

produksi etanol. Substrat merupakan bahan baku fermentasi yang mengandung

nutrien yang dibutuhkan oleh Saccharomyces cerevisiae untuk tumbuh dan

menghasilkan produk fermentasi. Nutrien yang paling dibutuhkan adalah

karbohidrat (glukosa) (Azizah dkk., 2012). Grafik konsentrasi gula reduksi dan

konsentrasi etanol dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Konsentrasi gula reduksi dan etanol Saccharomyces

cerevisiae (Ria dkk., 2012)
Keterangan: a. Konsentrasi etanol. b. Konsetrasi gula reduksi

Gambar 4. Kurva pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae (Brooks

dkk., 2005)
 21

Pada Gambar 3 menunjukkan jam ke-4 hingga jam ke-12 penurunan

kadar gula reduksi signifikan dapat diasumsikan sel Saccharomyces cerevisiae

sedang bertumbuh (Ria dkk., 2012). Pada jam ke-12 hingga jam ke-72 kadar

gula reduksi tidak turun terlalu banyak yang dapat diasumsikan sel

Saccharomyces cerevisiae sedang melakukan fermentasi etanol (Ria dkk.,

2012). Pada Gambar 4 fase log terjadi pada 12 jam awal kemudian dilanjutkan

dengan fase stasioner pada jam pengamatan berikutnya hingga dari jam ke-64

sampai jam ke-72 menandakan fase kematian bagi Saccharomyces cerevisiae

(Brooks dkk., 2005).

H. Hipotesis

Berdasarkan landasan teori, rumusan masalah, dan tujuan, maka dapat

diajukan hipotesis sebagai berikut :

1. Kadar etanol yang dihasilkan pada fermentasi substrat filtrat kulit nanas

dengan teknik imobilisasi Ca-alginat pada pengulangan pertama sebesar 9

%, dan pada pengulangan ketiga sebesar 7 %.

2. Penggunaan sel imobil Saccharomyces cereviceae dapat dilakukan secara

berulang lebih dari 2 kali dalam fermentasi substrat filtrat kulit nanas.